肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化定量检测研究

背景与目的:APC基因编码的蛋白参与信号转导途径,大量研究证实APC启动子区的高甲基化在肿瘤的发生发展中起重要作用。本研究建立血浆APC基因实时荧光定量甲基化特异性基因扩增(methylation-specificPCR,MSP)检测方法,并对临床肺癌患者血浆进行检测,以确定该方法在肺癌诊断中的应用价值。方法:将APC基因启动子甲基化阳性肺癌细胞株NCI-H460细胞用有限稀释法获取单个集落形成的细胞,以经典的酚-氯仿法提取细胞DNA,并用MSP对APC基因甲基化进行验证,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μL健康人血浆中,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟肺癌及肺癌患者、肺部良性疾病患者和健康对照者血浆中提取DNA,对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰;以模拟血浆样品作为标准品,采用外标准曲线法对各种血浆样品中APC甲基化进行定量分析。结果:所建立的实时荧光定量MSP检测方法的线性范围为1.5×102～1.5×105拷贝/mL,用该方法检测甲基化肿瘤细胞的DNA其最低检测限为1.5×102拷贝/mL。78例肺癌患者有40例组织中检测出APC基因甲基化阳性,其中的19例(47.5%)肺癌患者血浆中APC基因启动子甲基化阳性,APC甲基化浓度为1.67×102～6.78×103拷贝/mL,中位浓度为1.60×103拷贝/mL。38例组织阴性的肺癌患者、31例肺部良性疾病患者和23例健康者的血浆APC基因启动子甲基化均为阴性。结论:实时荧光定量MSP检测血浆APC基因甲基化在肺癌诊断方面具有潜在应用价值。

抑癌基因APC启动子甲基化检测及其在肺癌诊断中的应用

目的 建立抑癌基因APC启动子部位甲基化的检测方法 ,并对肺癌临床样品进行初步检测研究。方法 :对肺癌组织提取的DNA及转甲基后的脐带血DNA进行化学修饰 ,以甲基化特异性引物进行基因扩增 (methylationspecificPCR ,MSP)和甲基化序列分析 (methylationsequencing ,MS)。结果 :经转甲基的人脐带血DNA样品MSP检测为阳性 ,其序列与预期相符 ,未经转甲基样品为阴性。 17例肺癌患者的肿瘤及其正常肺组织APC甲基化检测阳性率分别为 4 7% (8/ 17)和 18% (3/ 17) ,1例肺部良性肿瘤及其正常肺组织的检测结果均为阴性 ;对MSP检测为阴性的 9例肺癌患者肿瘤及其正常肺组织进行MS检测分析 ,有 4例APC启动子部位存在CpG甲基化。结论 :利用MSP和MS两种甲基化检测分析手段 ,对 17例临床确诊肺癌组织的检测总阳性率可达 71% (12 / 17)。MSP操作简便 ,价格低廉 ,可适合于大规模肿瘤患者样本的筛查 ;而对于MSP检测为阴性的临床样品 ,可以利用MS进行进一步的确认 ,为临床肺癌诊断提供更准确的信息。

金黄色葡萄球菌随机扩增多态性DNA分型及其应用

目的 利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA ,RAPD)分析技术 ,对金黄色葡萄球菌进行基因分型 ,并观察临床耐药型与其基因型之间的关系。方法 利用自己合成的随机引物 ,建立RAPD检测分析方法 ,并利用这一方法对 5株金黄色葡萄球菌进行基因分型的研究。结果 5株金黄色葡萄球菌中 ,2株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)为同一基因型 ,另外 3株为两种基因型 ,均是敏感菌株。结论 从RAPD分析的初步结果可以看出 ,金黄色葡萄球菌的临床表现型与基因型存在一定的关系 。

ANF基因转染人血管平滑肌肉瘤细胞及其表达的实验研究

通过对体外传代培养的人血管起源平滑肌肉瘤细胞进行直接和脂质体Ｔｆｘ－５０包裹的人心钠素（ＡＮＦ）基因表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ转染，并以非同位素地高辛标记的ＲＮＡ分子探针对转染细胞中的ＡＮＦｍＲＮＡ水平进行ＲＮＡＤｏｔＢｌｏｔ分子杂交检测，同时利用放射免疫方法测定转染细胞培养上清中的ＡＮＦ含量。结果显示，与未经脂质体Ｔｆｘ－５０包裹的ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ直接进行细胞转染及低浓度脂质体Ｔｆｘ－５０包裹的ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ进行细胞转染相比，脂质体Ｔｆｘ－５０与ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ以３∶１（荷质比）进行包裹，并当ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ在细胞数为１０５达到２．０μｇ时，细胞中ＡＮＦｍＲＮＡ表达阳性，转染细胞培养上清中ＡＮＦ含量达到５８．０ｎｇ／Ｌ。表明通过脂质体Ｔｆｘ－５０介导可以提高ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ的转染效率，并使细胞表达ＡＮＦ显著增加。

小儿急性淋巴细胞性白血病微小残留病免疫治疗的初步研究

目的 :研究利用体外培养的激活脐血造血干细胞 ( activated cord blood stem cell,ACBSC) ,对急性淋巴细胞性白血病( AL L )患儿微小残留病 ( MRD)进行免疫治疗的疗效。方法 :无菌枸橼酸 ( ACD)抗凝脐血收集 ,经 Percoll单个核细胞分离与植物血凝素 ( PHA)培养 ,采用桥联免疫组化 ( APAAP)方法进行 PHA激活前后 CD3、CD4、CD8抗原测定 ;应用双抗体夹心 EL ISA法进行肿瘤坏死因子 ( TNF- α)检测 ;利用 PCR方法对克隆性重排的 T细胞受体 ( TCR)基因进行测定 ,检查外周血中 AL L MRD。结果 :1脐血单个核细胞以一定浓度 PHA( 2 0 mg/ L)培养激活后 ,其中表达 CD3、CD4、CD8抗原的淋巴细胞数增高。2未经 PHA激活的单个核细胞TNF-α分泌呈一过性 ,72 h后检测 <10 pg/ ml;经 PHA激活 4 8h后 ,分泌维持在一个较高水平 ,达 60 0 pg/ ml。 3 6例 AL L患儿输注前骨髓和外周血中 MRD测定全部阳性 ,4例经多次输注 ,半年后 MRD检测为阴性 ,骨髓中 MRD明显减少 ,其余 2例骨髓和外周血中 MRD检测均为阴性。结论 :ACBSC能够分泌抗肿瘤细胞因子及可能具有细胞毒 T淋巴细胞 ( CTL)样作用 ;可望通过利用脐血免疫治疗方法 ,对小儿 AL L的 MRD进行彻底清除 ;利用 ACBSC移植 ,可能是治疗小儿 AL L MRD安全有效的免疫治疗方法。

APC基因甲基化定量检测芯片的建立

目的建立抑癌基因APC(adenomatous polyposis coli,APC)启动子1A的甲基化定量芯片检测方法。方法选取一段420bp的APC基因启动子1A CpG密集序列作为靶序列,针对M0、M1、M2、M3、M45个CpG靶位点,设计一套检测甲基化与非甲基化的探针。采用脐带血DNA克隆体作为阴性、阳性质控品。结果甲基化阳性、阴性质控的芯片结果与测序吻合。每组探针中荧光强度由强至弱依次为,阳性质控(甲基化):探针1>2、3>4;阴性质控(非甲基化):探针3>4、1>2。5个位点的5条荧光强度标准曲线,R2范围是0.93～0.99。M0、M1、M2、M3、M45个位点甲基化杂合型的检测范围分别为50.0%±3.6%、50.0%±6.9%、50.0%±3.5%、50.0%±8.5%、50.0%±7.3%。结论建立了APC基因启动子5个CpG位点的甲基化定量检测芯片。

地高辛标记的RNA分子探针检测血清HCV

利用构建的ｐＧＰ１４４质粒，进行ＨＣＶ地高辛ＲＮＡ分子探针的标记，以该探针对ＨＣＶ临床血清样品及已知ＨＣＶ滴度的阳性血清１０倍逐级稀释样品的ＰＣＲ基因扩增产物进行ＤｏｔＢｌｏｔ分子杂交检测。结果显示，４０例ＨＣＶ病人血清中３９例阳性，假阴性２．５％（１／４０）；２０例正常人血清，ＨＣＶ病毒检测结果均为阴性；ＨＣＶ检测线性范围为１０１～４０４（ｃｏｐｙ／１００μｌ）之间。套式ＰＣＲ第二轮基因扩增对上述血清检测电泳结果为４１例阳性，其余１９例正常血清为阴性，假阳性５％（１／２０）。与套式ＰＣＲ结果相比较，ＤｏｔＢｌｏｔ的敏感性与之接近并具有特异性高，不易因污染而造成假阳性结果，以及它的线性范围宽等优点，可以作为较理想的病原体微生物在体液中浓度的定量检测方法。

DNA甲基化标志物在分子诊断与治疗中的价值

DNA甲基化是指基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳原子上共价结合一个甲基基团,其主要参与基因的表达调控。DNA甲基化异常与肿瘤等疾病密切相关。抑癌基因启动子区甲基化是肿瘤发生发展的重要事件。DNA甲基化,不仅可作为肿瘤分子诊断的标志物,同时也可作为分子治疗的靶标。

循环DNA的临床应用研究进展

循环DNA(circulating DNA)是存在于血液(血浆或血清)、滑膜液、脑脊液等体液中的细胞外DNA,包括游离DNA和DNA-蛋白质复合物两种形式,它与细胞在生理和病理状态下的代谢活动密切相关。其量和性质的改变在产前诊断、肿瘤的诊断和监测、自身免疫性疾病、器官移植和创伤后病情监测等方面具有重要的意义。

胰岛素样生长因子受体表达与肿瘤细胞生长和转移

正常细胞分裂和分化过程受生长因子调控；在肿瘤的生长及转移过程中，一些生长因子及肿瘤细胞表面生长因子受体亦起着决定性作用。目前已发现肿瘤细胞的凋亡、转化、浸润性生长及远处脏器转移与胰岛素样生长因子Ⅰ（ Ｉ Ｇ ＦⅠ） 及其受体（ Ｉ Ｇ ＦⅠ Ｒ） 有关。肿瘤细胞表面的 Ｉ Ｇ ＦⅠ Ｒ 表达的高低、周围微环境中的 Ｉ Ｇ ＦⅠ浓度大小，在一定程度上决定了该肿瘤细胞的致瘤性及转移特性。

肺癌单克隆抗体制备及研究

以纯化肺癌肿瘤相关抗原免疫BALB/c系小鼠,应用杂交瘤技术,建立了抗人肺癌(腺癌及鳞癌)单克隆抗体CL2B细胞株。用间接免疫荧光技术检测36例肺癌肿瘤组织的冰冻切片,其中32例找到带有强荧光的肿瘤细胞,而另4例经HE染色证明末初到肿瘤细胞。CL2B单克隆抗体除对某些肿瘤(宫颈癌、乳腺癌)有弱阳性反应以外,对正常人的肺及其它脏器和血细胞都没有交叉反应,有很好的选择性。以CL2B单抗作用于肺癌细胞表面相应的抗原后,癌细胞生长受到抑制,且对抗肿瘤药物的敏感性发生变化。

维拉帕米影响丝裂霉素C抗人肺腺癌作用的体外研究

维拉帕米影响丝裂霉素Ｃ抗人肺腺癌作用的体外研究潘世扬，毕志刚，殷凯生，丁小健，陈德才南京医学院第一附属医院临床实验研究室（南京·２１００２９）有人试图某些本身并无抗癌作用的药物采增强抗癌药的杀瘤细胞效果。Ｔｓｕｒｕｏ指出钙离子拮抗剂及钙通道抑制剂能够...

2008年南京医科大学第一附属医院细菌及真菌耐药性监测

目的了解2008年我院临床分离病原菌分布及其对常用抗菌药物的耐药性。方法细菌及真菌鉴定采用API系统;细菌药物敏感试验测定采用纸片扩散法(K-B法),根据CLSI2008版判断结果;真菌药物敏感试验测定采用Rosco纸片法,判断标准由Rosco公司提供;WHONET5.4软件进行统计分析。结果 2008年我院共分离出病原菌4972株,其中,革兰阳性菌1106株,占22.2%,革兰阴性菌2475株,占49.8%,真菌1386株,占27.9%。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的菌株分别占59.2%和52.7%。葡萄球菌属中甲氧西林耐药株对大多数常用抗菌药物的耐药率显著高于甲氧西林敏感株,未发现对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺的耐药株。肠球菌属中,屎肠球菌和鸟肠球菌对多数抗菌药物的敏感率低于粪肠球菌,3种肠球菌均已出现少数对万古霉素或替考拉宁耐药的菌株。肠杆菌科细菌中大肠埃希菌和克雷伯菌属的ESBLs分离率为59.4%和45.3%,产ESBLs菌株对常用抗菌药物的耐药率高于非产ESBLs菌株。非发酵革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药率均显著高于肠杆菌科细菌。结论细菌耐药性呈增长趋势,白假丝酵母菌的分离率升至第1位,需加强耐药性监测,并采取有效控制措施。

慢性HBV感染患者血清中HBV-DNA与HBsAg、HBeAg的关系

目的:定量检测慢性HBV感染患者血清中HBV-DNA与HBsAg、HBeAg,并寻找三者浓度之间的关系。方法:选取555例HBsAg阳性的慢性HBV感染患者血清标本,分别用荧光定量聚合酶链式反应法(FQ-PCR)检测HBV-DNA和微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测HBsAg、HBeAg。结果:555例患者中,有338例检测出HBV-DNA阳性,阳性率为60.9%(338/555);对HBV-DNA浓度取对数后分为三组:>6组、3～6组和<3组。三组之间的HBsAg的浓度差异存在显著性(P<0.001),进一步两两比较发现>6组中位浓度低于3～6组(P<0.001),而3～6组和<3组之间差异无显著性(P=0.505);三组之间HBeAg差异有显著性(P<0.001),进一步进行两两比较,发现>6组高于3～6组(P<0.001),而3～6组高于<3组(P<0.001)。在HBV-DNA阳性组,对HBV-DNA浓度的对数与HBeAg进行相关分析,两者相关系数为0.463,而与HBsAg浓度呈负相关,相关系数为-0.180。结论:随着HBV-DNA拷贝数的增加,HBsAg量呈下降趋势,而HBeAg浓度呈上升趋势,且均存在相关性。

肺癌细胞株APC基因启动子甲基化对其转录的影响

背景与目的:抑癌基因家族性腺瘤样结肠息肉病易感基因(adenomatous polyposis coli,APC)启动子区的高甲基化在很多肿瘤中被发现,与这些肿瘤的发生发展相关。本实验室在肺癌患者肿瘤组织中检测到APC甲基化率达47%,为了研究其在肺癌细胞株中的甲基化情况,并进一步了解甲基化对其转录的影响,本研究检测了3株肺癌细胞的抑癌基因APC启动子甲基化状态及其对该基因转录水平的影响。方法:提取3株肺癌细胞株(肺腺癌细胞株SPC-A1、小细胞肺癌细胞株NCI-H446、大细胞肺癌细胞株NCI-H460)的DNA,以经转甲基处理和未做处理的脐带血DNA为阳性、阴性对照,亚硫酸氢盐化学修饰后,用甲基化特异性基因扩增(methylation specific-polymerase chain reaction,MSP)和甲基化基因芯片对APC基因启动子1ACpG岛甲基化进行研究,并用实时荧光定量PCR(real time-polymerase chain reaction)技术,以Sybr-GreenⅠ为荧光染料,β-actin基因为内参照,检测mRNA转录;对甲基化阳性的NCI-H460细胞,分别用1、5、10、15μmol/L的5′-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(5-aza-2-deoxycytidine,5-aza-dC)试剂进行脱甲基化,提取RNA,荧光定量检测其转录变化。结果:SPC-A1和NCI-H446细胞APC甲基化阴性,NCI-H460细胞APC甲基化阳性;甲基化芯片检测NCI-H460细胞在APC启动子1A5个CpG位点均存在甲基化(687、707、714、719、726),SPC-A1和NCI-H446甲基化阴性,荧光定量结果NCI-H460的APC转录较SPC-A1和NCI-H446有明显的下降,仅为二者平均的30.04%;经5-aza-dC脱甲基化作用后,NCI-H460细胞的APC表达增加了约5～10倍,其中10μmol/L浓度作用下,APC表达增加最多。结论:肺癌细胞株NCI-H460中存在APC基因高甲基化,5-aza-dC脱甲基化试剂可以激活其转录。

人胃癌组织块裸鼠原位移植/转移模型的建立

目的 用肿瘤组织块原位移植 ,建立人胃癌裸小鼠原位移植 /转移模型。方法 以人胃低分化腺癌细胞系接种于裸小鼠皮下 ,形成稳定传代的皮下移植瘤 ,再取该肿瘤组织块原位移植于裸鼠胃壁 ,观察移植肿瘤的生长状况、移植成功率和自发转移的发生率。结果 原位移植成功率 (成瘤率 )为 1 0 0 %、局部淋巴结转移率 1 0 0 %、远处淋巴结转移率 90 %、肝转移发生率为 75%。荷瘤鼠的中位生存期为 1 4周 ,晚期出现消瘦和全身衰竭。结论 该裸小鼠原位移植 /转移模型的生物学行为与人胃癌自然生长和转移过程相似 ,可作为一种有价值的工具用于胃癌转移机理和抗转移实验治疗的研究。

完全胸腔镜与传统开放肺叶切除术对非小细胞肺癌患者围手术期影响的比较

目的:比较完全胸腔镜与传统开放行非小细胞肺癌肺叶切除术对患者围手术期临床疗效、创伤及急性期反应。方法:将40例非小细胞肺癌患者分为完全胸腔镜手术(VATS)组和传统开放手术(TOS)组,每组20例。比较肺叶切除术围手术期临床疗以及血浆游离DNA浓度和血清C反应蛋白(CRP)水平,并进行统计分析。结果:两组无死亡病例,均未出现术后不良并发症,VATS组无中转开胸。两组的手术时间、清扫淋巴结站数及个数、术后引流时间、引流量无统计学差异(P>0.05)。VATS组的术中失血量、术后疼痛评分、术后下床活动日、术后住院天数明显低于TOS组,有统计学差异(P<0.05)。两组术前血浆DNA浓度和CRP水平无统计学差异(P>0.05),术后第1、3和5天各时间点VATS组血浆DNA浓度和CRP水平均明显低于同时间点TOS组(P<0.05)。结论:完全胸腔镜下非小细胞肺癌肺叶切除术与传统开放手术相比,围手术期疗效没有明显差异,却明显减轻了对机体的创伤、急性期反应和病人的痛苦,具有明确的微创性。

常用化疗药物对不同组织类型非小细胞肺癌体外药敏实验

目的探讨三种组织类型的非小细胞肺癌(NSCLC)对5种临床常用化疗药物的敏感性。方法28例临床肺部肿瘤标本制备成组织细胞悬液,在体外(96孔细胞培养板内)培养,24 h后加入化疗药物。应用四氮唑蓝比色(MTT)法检测各孔的吸光度值并计算出肿瘤细胞对所试药物的敏感率。结果肺腺癌对异环磷酰胺、丝裂霉素、顺铂的敏感率分别为75%、83%和75%;鳞癌对异环磷酰胺、丝裂霉素、顺铂的敏感率均达到80%。肺腺癌、鳞癌对紫杉醇的敏感率不高,而腺鳞癌对该药的敏感率可达100%。肺腺癌对阿霉素的敏感率仅为33%,肺鳞癌对该药也无明显反应性。结论不同组织类型非小细胞肺癌对5种化疗药物的敏感性存在显著差异。

4种血浆游离DNA提取方法的比较

目的比较4种方法对血浆游离结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA和质粒DNA的提取效率。方法MTBDNA和重组质粒DNA经紫外分光光度法准确定量并梯度稀释,建立标准品。构建含有一定浓度MTBDNA和质粒DNA的血浆,分别采用4种方法提取血浆游离DNA,采用实时荧光PCR技术定量检测模拟血浆中MTBDNA和质粒DNA的含量,比较各种方法的提取效率。结果4种方法中,磁珠法对MTBDNA和质粒DNA的提取效率最高,分别为52.8%和69.2%;相对丢失率最低,分别为40.1%和31.8%;重复性最好,其变异系数分别为26.7%和26.0%。结论在4种方法中,磁珠法对血浆游离DNA的提取效率最高,尤其适合于小片段DNA的提取。