年龄对不明原因不育男性精子运动参数及DNA损伤的影响

目的探讨不明原因不育男性的年龄对其精子运动力及DNA损伤的影响。方法回顾性分析2013年1月至2018年12月在本院不孕不育专科门诊就诊的400例不明原因不育患者,按年龄分为二组:<35岁组和≥35岁组,通过计算机辅助精液分析系统(CASA)检测获得前向运动精子百分率(PR%)、总活力和精子运动参数(VAP、VSL、VCL、ALH、STR、LIN、BCF);采用精子染色质扩散法(SCD)评估精子DNA损伤程度,结果以DNA碎片指数(DFI)报告。结果不明原因不育患者年龄与PR%、总活力、VAP、VSL和VCL呈负相关(r分别为-0.142、-0.125、-0.142、-0.114和-0.161,P均<0.05),而与精子DFI呈正相关(r=0.161,P<0.05);≥35岁组的PR%、VAP和VCL均明显低于<35岁组(P均<0.05),而≥35岁组的DFI水平及DFI异常率均高于<35岁组且差异具有统计学意义;同时,≥35岁组的精子DNA损伤率风险是<35岁组的两倍多。结论在不明原因不育男性中,年龄越大的患者其精子运动参数可能越低,DNA损伤率及风险则增高。

植物生长调节剂对苹果组培苗延缓生长保存的效应

以富士、乔纳金、金矮生、嘎拉组培苗为试材,在继代培养基中加入不同浓度的比久、矮壮素、多效唑及脱落酸,研究了植物生长延缓剂和生长抑制剂对苹果组培苗种质延缓生长保存的效应。结果表明:比久、矮壮素均有明显抑制苹果组培苗生长的作用,且茎尖存活率高,试管苗生长状况较好,转入常规继代培养基当代即可恢复生长,可用于苹果种质资源的离体保存,比久适宜的浓度为80mg/L,矮壮素为75mg/L左右;多效唑处理虽能明显抑制苹果试管苗生长,但易使有些品种试管苗玻璃化,可选择性应用;脱落酸作用过于剧烈,绝大部分处理苗死亡,不宜在苹果种质保存中使用。

梨果肉质地性状分析

【目的】比较不同梨品种的果肉质地特性,探讨反映梨果实质地状况的评价参数,为研究梨的内在品质提供依据。【方法】应用质构仪质地多面分析法(TPA,质地参数包括脆度、硬度、弹性、回复性、凝聚性、咀嚼性)和穿刺试验(Puncture test,质地参数包括破裂力、破裂位移、破裂能、屈服力、屈服位移和屈服能)对成熟期采收的14个梨品种的果实果肉质地进行测定,通过多元分析得出质地参数之间的关系。【结果】基于TPA和穿刺试验的分析结果表明,不同梨品种之间果肉质地之间有一定的差异。与‘鸭梨’、‘丰水’、‘美人酥’等相比,‘粉酪’、‘晚秀’、‘南水’等品种具有较高的果肉硬度、脆度和咀嚼性;与‘鸭梨’、‘丰水’、‘黄金’等相比,‘粉酪’、‘晚秀’、‘满天红’等品种具有较高的破裂力、破裂能、屈服力和屈服能。相对来说,不同品种之间的果肉破裂位移和屈服位移的差别较小。相关分析表明,除弹性、屈服位移和破裂位移外,梨果肉质地参数中脆度、硬度、回复性、凝聚性、咀嚼性、屈服力、屈服能、破裂力、破裂能之间相关性显著,大多呈正相关关系;聚类分析将14个品种分为松软(如‘丰水’、‘黄金’、‘黄冠’等)、硬脆(如‘晚秀’)、坚硬(如‘粉酪’)等3种不同的果肉质地类型;主成分分析表明,前3个主成分对梨果肉质地的贡献率达到92.196%,第1主成分反映了果肉的咀嚼特性;第2主成分反映了果肉的弹性和屈服性;第3主成分反映了果肉的破裂特性;并且,在梨果肉质地中,果肉硬度、破裂力、脆度等对质地的影响较大,弹性和破裂位移次之。【结论】不同梨品种之间的果肉质地存在差异;梨果肉大多数的TPA参数与穿刺试验参数呈显著正相关;果肉硬度、破裂力、脆度是影响梨果肉质地的重要参数。

Y染色体微缺失人群中Y-STR等位基因缺失模式分析

Y染色体短串联重复序列(Y-short tandem repeats, Y-STRs)已被广泛应用到DNA检验领域。然而,由于Y染色体存在较高的结构突变率,可能会导致部分Y-STR等位基因丢失甚至产生特殊的缺失模式,从而影响其在法医学中的应用。位于Y染色体长臂的无精子症因子(azoospermia factor, AZF)与精子发生有关,该区域微缺失可导致不育症。然而Y染色体微缺失人群是否存在特殊的Y-STR缺失模式仍有待研究。本文利用法医学上常用17个Y-STR探讨了85例Y染色体微缺失患者的Y-STR缺失模式。结果显示,单纯AZF a区缺失样本,均存在DYS439-DYS389I-DYS389II基因座无效扩增情况;单纯AZF b区或单纯AZF c区缺失样本存在DYS448基因座无效扩增;复合AZF b+c+d区缺失样本存在DYS385-DYS392-DYS448基因座无效扩增;复合AZFa+b+c+d区缺失样本存在DYS390-Y-GATA-H4-DYS385-DYS392-DYS448基因座无效扩增。因此,本研究结果提示Y-STR缺失模式与Y染色体微缺失有对应关系。

中国人群中抗肌萎缩蛋白基因突变类型和分布特点及其与临床症状的相关性

假性肥大型进行性肌营养不良症(Duchenne’s muscular dystrophy,DMD)是源于横纹肌的一种X-连锁隐性致死性遗传病,由编码抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因突变所致。为了探讨中国人群中DMD患者的dystrophin基因突变类型和分布特点及其与临床症状的相关性,文章采用Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification(MLPA)方法对720例DMD患者及其母亲和20例正常成年男性进行dystrophin基因分析。结果显示,检出率为64.9%(467/720),54.3%(391/720)的患者为基因缺失;10.6%(76/720)的患者为基因重复。累及Exon45-54缺失突变型占全部缺失型患者的71.9%(281/391);重复突变型累及Exon1-40占全部重复型患者82.9%(63/76);检出的患者中,DMD型和中间型营养不良症(Intermediate muscular dystrophy,IMD)型占90.6%(423/467),Becker型营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)型占9.4%(44/467)。表明假肥大型肌营养不良症以dystrophin基因缺失突变为主,突变发生在整个基因中非均匀分布,存在突变热区,在缺失和重复的位置和片段长度与肌病的临床症状严重程度之间并不存在简单的相关关系。

Expressmarker22系统检测广东汉族人群中的标准梯度外等位基因

【目的】分析Expressmarker22(EX22)系统检测广东汉族人群中的梯度标准物范围之外(OL)等位基因频率及序列组成,完善频率数据库。【方法】应用EX22系统对3495例广东汉族无关个体进行STR分型,统计等位基因分型OL的等位基因频率并筛选稀有等位基因。通过比对STRBase数据库和相关文献,对暂未报道的OL样本进行单基因座扩增及克隆测序。【结果】共发现分布于10个基因座中的33种OL等位基因,频率为0.3‰~4.6‰,其中稀有等位基因25种,11个未见报道。测序结果显示以核心序列的不完整重复多见。【结论】OL等位基因数据有助于提高个体识别率和非父排除率,有效补充法医DNA多态性数据,完善数据库建设。

畸型精子症患者精子DNA完整性与年龄及常规精液参数的关系

【目的】探讨畸形精子症患者的精子DNA完整性与年龄及常规精液参数的相关关系。【方法】收集2013年1月至2016年12月在我院生殖中心就诊的255例畸型精子症患者的精液标本,将患者按年龄分为≤30岁、30~35岁和≥35岁3组,按WHO第5版手册进行精液常规分析,采用精子染色质扩散法(SCD)检测精子DNA完整性。【结果】畸形精子症患者精子DNA碎片指数(DFI)与前向运动精子百分率(PR%)、精子总活力呈负相关(P <0.001;P <0.001),与年龄、正常形态精子百分率(NF%)可能存在弱相关关系(P=0.003;P=0.027)。精子浓度、总精子数与精子DFI之间的相关关系无统计学意义(P=0.260;P=0.541)。不同年龄组患者的精子DFI水平差异具有统计学意义(P=0.021);年龄≥35岁组的精子DFI水平显著高于≤30岁组和30~35岁组(P=0.030,P=0.035);而≤30岁组和30~35岁组间的精子DFI水平差异无统计学意义(P=1.000)。年龄≥35岁组的精子DFI异常率明显高于≤30岁组和30~35岁组(P=0.002)。在年龄≥35岁组中,年龄、PR%及精子总活力在DFI正常患者与DFI异常患者之间的差异具有统计学意义(P=0.006;P <0.001;P <0.001)。【结论】畸形精子症患者的PR%是与其精子DFI最密切相关的精子参数;年龄越大的畸形精子症患者的精子DNA完整性越差。

DNA浓度及注射时间对苹果花粉管通道法基因转化率的影响

通过花粉管通道法,将携带CBF3和GUS基因的pWBVec10a质粒DNA导入苹果。坐果后70d左右采收种子,将收获的种子进行离体培养,培养基为MS+BA0.2mg/L+GA2.0mg/L,附加蔗糖50g/L,琼脂6g/L,培养40d后对转化子叶进行GUS染色检测。结果表明,最佳注射时间为授粉后11～24h之间。随着注入外源DNA浓度的增加,坐果率逐渐降低,DNA浓度为500μg/ml时,坐果率可达3.1%;DNA浓度为1000μg/ml时GUS基因阳性表达率可达12.5%。

应用基因芯片技术快速检测G-6-PD基因突变

目的 :建立基因芯片实验平台 ,并应用本技术检测G 6 PD基因突变。方法 :对我院用酶学方法筛查出的G 6 PD缺乏患者 45例 ,抽血提取DNA ,用五对荧光引物进行PCR扩增后与芯片进行杂交 ,用ScanArray芯片扫描仪读片。结果 :检测出G1388A ,G 1376T ,C10 2 4,A95G和G392T ,C5 92T等类型的G 6 PD基因突变 ;图像清晰稳定。结论 :基因芯片技术检测G 6 PD基因突变方法稳定、快速 ,在临床上应用可行。

多重荧光STR-PCR方法在血友病A携带者产前基因诊断中的应用

目的:通过血友病A家系遗传连锁分析,建立血友病A携带者产前诊断方法。方法:采用多重荧光STR-PCR方法对50例正常女性进行检测和20个血友病A家系进行连锁分析。结果:DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108和F8Civs13的杂合率分别为88%、84%、20%、62%、22%和30%;用这6个位点提供的遗传信息成功为20个血友病A携带者进行了产前诊断。结论:多重荧光STR-PCR方法是一种快速、简便、实用的血友病A产前诊断方法。

广东汉族人群H19基因上游差异甲基化区SNP

目的 调查广东汉族人群中H19基因上游差异甲基化区（differentially methylated region,DMR）的单核苷酸多态性（SNP）及单倍型.方法 应用PIA分型法,以限制性内切酶McrBC、HpaⅡ消化基因组DNA分别获得个体单亲源DNA模板链,经测序,分别获得个体H19基因上游DMR单亲源SNP等位基因、基因型及单倍型数据.结果 共检出13个SNP（rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098）及1个突变点（g7351c）.所有位点经统计学分析均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P〉0.05）.除rs12417375位点DP值为0.279,其余12个SNP DP值在0.446~0.614;g7351c突变点DP值为0.013,提示为南方汉族民族特异性位点.共检出8种单倍型（命名为单倍型1~8）,其中有3种为新发现的单倍型,其DP、PIC、PE及H分别为0.891、0.714、0.524和0.758.结论 PIA分型法获得的H19基因上游DMR SNP位点及其单倍型遗传标记系统具有较高的鉴别能力,在法医学鉴定中具有较好的实用价值.

携带遗传转化质粒的农杆菌在无抗性选择压二次悬浮下的质粒稳定性

本试验对携带不同目的基因和启动子的农杆菌菌株在去掉抗生素条件下进行菌液二次悬浮时的质粒稳定性进行了研究。结果表明:GV3101菌株中的几丁质酶基因质粒与AGL1菌株中的CBF3/rd29a质粒非常稳定,未发生质粒丢失现象;其次是LBA4404菌株中的CpTI质粒,虽发生个别质粒丢失,但与对照相比没有显著差异;携带CBF3/rd29a质粒的EHA105菌株悬浮培养12h后质粒发生明显丢失;含β-1,3葡聚糖酶基因质粒的EHA105菌株、含CBF3/CaMV35S质粒的GV3101菌株悬浮培养10h后质粒发生明显丢失;EHA105菌株CBF1/rd29a质粒和AGL1菌株CBF3/CaMV35S基因质粒最不稳定,分别悬浮培养6h和4h后即发生质粒明显丢失,且随悬浮培养时间的延长,质粒丢失率显著增高。质粒丢失程度与目的基因、启动子和农杆菌菌株三要素中的单一因素没有规律性联系,而是与目的基因、启动子和农杆菌菌株的组合有关;同时,在悬浮时间为0.5～6.0h范围内,质粒丢失主要与菌液浓度有关,而与悬浮时间关系不大;直接吸取一次悬浮液或离心后分别悬浮于细菌培养液和植物培养液等不同的悬浮培养方式下质粒稳定性没有差异。

基因测序结合STR连锁分析在假肥大型肌营养不良症产前诊断中的应用

目的假肥大型肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular dystrophy(DMD/BMD)是一种X-连锁隐性致死性遗传病,尚无特异性治疗方法,建立一套适合于DMD基因点突变产前诊断及早期产前诊断的方法,为携带者产前诊断提供有效的基因诊断途径,以避免患胎的出生。方法 27例DMD基因点突变携带者妊娠期取绒毛组织或羊水进行风险胎儿的DMD基因测序、DNA-STR分型和性别基因检测。结果 27个风险胎儿中,检出DMD患胎6例,其中无义突变3例,移码突变2例,剪接位点突变1例;检出携带者胎儿8例,其中移码突变4例,无义突变3例,剪接位点突变1例;13例为正常胎儿。27例中11例是通过绒毛膜穿刺活检进行,其余为羊膜腔穿刺羊水检查。结论基因测序结合STR连锁分析用于用于DMD点突变的产前基因诊断是目前一种准确和可行的方法。可成功地避免患病胎儿的出生,并能明确区分DMD基因纯合子和杂合子突变,避免正常胎儿被错误淘汰。

单精子测序结合PCR-反向点杂交技术在1例东南亚缺失型α地中海贫血患者胚胎植入前遗传学检测中的应用

目的探讨单精子测序结合PCR-反向点杂交(PCR-reverse dot blot,PCR-RDB)技术在东南亚缺失型α地中海贫血胚胎植入前遗传学检测中的应用价值。方法选取2020年4月24日就诊于广州医科大学附属第三医院妇产科的一对东南亚缺失型α地中海贫血携带者夫妇,针对男方无法提供家系成员样本的情况,本案例采用上游法结合显微操作移液管挑选其5份单精子样本并进行全基因组扩增,通过PCR-RDB技术确定男方单精子样本的地中海贫血基因分型,在--^(SEA)区域的上下游1 Mb范围内选择单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP)作为遗传标记,进行二代测序分析构建双亲单体型。对6份囊胚活检样本进行全基因组扩增后行二代测序,通过单体型分析胚胎是否携带致病变异,并选取非患病囊胚进行移植。孕20周抽羊水进行产前诊断,验证与单基因病胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing for monogenetic disease,PGT-M)结果是否一致。结果女方的致病变异来源于其母亲,男方5份单精子样本的地中海贫血基因分型结果显示有4份为野生型。单精子测序筛选出男方有效位点10个,女方家系连锁分析得到女方有效位点6个,PGT-M结果显示4枚囊胚为αα/--^(SEA),2枚为--^(SEA)/--^(SEA),产前诊断结果显示胎儿基因型为αα/--^(SEA),与PGT-M结果一致,并于孕40周分娩一健康女婴。结论对于家系不全的男性东南亚缺失型α地中海贫血携带者,可采用单精子测序结合PCR-RDB技术筛选SNP位点,通过连锁分析行PGT-M。

MLPA技术用于假性肥大型肌营养不良症产前基因诊断的价值

目的探讨多重连接探针扩增（MLPA）技术用于假性肥大型肌营养不良症（DMD）先证者家系中高风险孕妇产前DMD基因诊断的价值。方法收集2005年至2012年广州医学院第三附属医院、南方医科大学南方医院等4家医院的155例有DMD先证者家系的高风险孕妇，其中7例孕早期孕妇取绒毛标本，148例孕中期孕妇取羊水样本，对绒毛标本和血性羊水标本排除母体DNA污染后，采用MLPA技术对绒毛和羊水样本行胎儿DMD基因检测；计算155个家系中DMD基因外显子突变发生次数。结果（1）155例孕妇中共检出DMD胎儿27例、胎儿DMD基因携带者28例、正常胎儿100例。155例胎儿中，男胎72例，其中27例为DMD胎儿（38％）；女胎83例，其中28例胎儿为DMD基因携带者（34％）。（2）27例DMD胎儿中，DMD外显子缺失突变22例（14．2％，22／155）；外显子重复突变5例，（3．2％，5／155）；28例DMD基因携带者中，DMD外显子杂合缺失突变25例（16．1％，25／155），外显子杂合重复突变3例（1．9％，3／155）。155个家系中，DMD基因突变的发生主要分布在外显子45-52之间，其中外显子49突变发生次数最高，共22次。（3）7例早孕期孕妇的绒毛组织DMD基因诊断结果中，有两例胎儿DMD基因型分别与先证者、孕妇的DMD基因型一致，其中1例为患儿、1例为DMD基因携带者，分别给予终止妊娠和继续妊娠的处理。结论MLPA技术用于DMD产前基因诊断，能准确区分DMD基因突变是属于缺失型、重复型突变还是杂合性缺失等，对DMD先证者家系的高危孕妇有较高的产前诊断价值，临床结果可靠；绒毛膜活检可用于产前DMD早期基因诊断。

对用多重连接探针扩增检出的假肥大型肌营养不良症基因单个外显子缺失的鉴别诊断

假肥大型肌营养不良（duchenne muscular dystrophy,DMD）是X染色体隐性致死性遗传病,发病率约为1/3 500男性活婴,进行性肌萎缩和肌无力伴小腿腓肠肌假性肥大是其典型的临床特征,主要累及青少年男性,一般在12岁以前丧失站立和行走的能力,最后因心肌和呼吸肌无力而于20岁前死于心力衰竭或呼吸衰竭,严重影响了青少年的健康成长.本病是由于编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的DMD基因突变所引起,DMD基因是人类最大的基因之一,含有79个外显子,编码14kbmRNA的转录.DMD患者中约55％～65％是该基因部分外显子缺失,5％～10％为基因重复导致,其余约25％是DMD基因点突变引起[1].本病至今无特异性治疗方法,只能对症治疗和支持治疗.寻找有效的方法治疗DMD一直是神经病学界研究的热点话题.

三核苷酸重复引物PCR和甲基化特异性多重连接探针扩增技术在脆性X综合征产前诊断中的应用

目的探讨脆性X综合征(FXS)产前基因诊断的方法。方法采用三核苷酸重复引物PCR法(TP-PCR)及甲基化特异性多重连接探针扩增技术(MS-MLPA)检测2个FXS家系及30例正常对照胎儿样本FMR1基因CGG重复数、AGG排布及FMR 1基因Cp G岛甲基化状态。结果正常对照FMR1基因(CGG)n重复数介于23~40之间,频数最大的重复数为29,AGG排布式以9A9A9最为常见。2个FXS家系中前突变等位基因向子代遗传过程中均发生了CGG扩展。正常对照及前突变携带者FMR1基因Cp G岛均为低甲基化状态,全突变患者Cp G岛为高甲基化状态。结论 TP-PCR和MS-PCR联合应用能够检出胎儿FMR1基因CGG重复数和Cp G岛甲基化状态,从而判断胎儿是否为脆性X综合征患儿,为优生干预提供可靠的依据。

花粉管通道法遗传转化核桃的研究

为了提高核桃花粉管通道法转化成功率,以‘清香’核桃(Juglans regia L.)为试材,研究了外源DNA导入受体时间、DNA浓度和导入方法对导入效率的影响。结果表明:外源DNA滴加处理的适宜时间为授粉后14～20h;外源 DNA 注射处理的适宜时间为授粉后24h。综合考虑外源DNA浓度对坐果率和GUS检测结果的影响,认为350～500μg .mL-1DNA适宜转化。采用切割柱头滴加、柱头直接滴加和子房注射等3种导入外源DNA的方法均获得了转化成功的果实,其中以切割柱头滴加法获得的转化果实率最高(36.4%),其次是柱头直接滴加法(20.7%),子房注射法因易造成机械损伤,坐果率最低(10.9%)。

STR-PCR联合SRY-PCR方法在DMD点突变家系产前基因诊断中的应用

目的对点突变型假肥大型肌营养不良症(Duchenne's muscular dystrophy,DMD)患者的家系采用STR-PCR联合SRY-PCR分析方法进行产前基因诊断。方法采用STR-PCR连锁分析方法和SRY-PCR方法对20个点突变型DMD家系进行产前基因诊断。结果男性胎儿40%(8/20),其中患胎62.5%(5/8);女性胎儿60%(12/20),其中携带者58.3%(7/12)。结论 STR-PCR连锁分析方法结合SRY-PCR方法用于点突变型DMD家系的产前诊断,是目前一种快速、简便、准确和可行的方法。

Identifier^(TM)系统在产前基因诊断中的应用

目的评估IdentifierTM系统在产前基因诊段中的作用。方法采用IdentifierTM试剂盒对100例羊水标本和20例绒毛及其孕妇进行检测,排除母体组织污染后行相应基因检测,对于有母源性DNA污染标本进行羊水细胞培养。结果 100例羊水标本和20例绒毛中,9例羊水标本有母源性DNA污染和4例绒毛标本为母亲组织;羊水标本经培养后,再检测均无污染。2例21-三体、1例18-三体和1例13-三体。结论 IdentifierTM系统不但可对标本的采样、运送、DNA提取等过程进行了监控,还可检测胎儿性别,同时可快速诊断胎儿是否21、18和13-三体;另外对污染的羊水标本进行羊水细胞培养,达到去除污染的目的,这样可避免受检者重新取材。