我国25省市自治区丁型肝炎病毒感染的流行病学调查研究

应用本室先后建立的酶联免疫吸附法和核酸打点杂交法,检测我国25省布自治区、16个不同民族共9 758例乙型肝炎病毒感染者中的丁型肝炎病毒抗原、抗体和核酸。其中乙型肝炎病人4 714例,HBsAg慢性携带者5 044例。病人和携带者中丁型肝炎抗原阳性率分别为4.25％和3.0％,丁型肝炎抗体阳性率分别为1.46％和1.18％,丁型肝炎病毒核酸阳住率分别为3.70％和2.2％。在不同地区不同民族丁型肝炎的这些指标有一定差异。在16个民族中,维吾尔族、蒙族和藏族丁型肝炎抗体阳性率明显高于其他民族,黎族丁型肝炎核酸阳性率高于其他民族。但在1136例不同临床型乙型肝炎病人中,丁型肝炎感染率无明显区别。丁型肝炎感染与暴发性肝炎的关系有待进一步研究。

不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响

目的确定以大肠杆菌表达丁肝抗原的最佳条件,为规模生产以求研发丁肝ELISA诊断试剂奠定基础。方法在不同温度、时间、IPTG和菌种浓度条件下,分别进行蛋白表达,取等体积样本进行SDS-PAGE电泳,经Image Lab软件分析,比较目的蛋白表达量,确定最佳表达条件。结果在25℃、29℃、33℃和37℃条件下,蛋白表达量无统计意义的差别;在添加IPTG后的1、2、3、4、5和6h,表达量无统计意义的差别;在以0.25、0.5、1、2和4mmol/L IPTG诱导时,表达量无统计意义的差别。当添加诱导剂前,菌种的OD600值分别为1.236、0.772、0.542和0.384,目的蛋白表达量有显著意义的差别。以OD600值为1.236和0.772时,表达量最高,两者之间无统计意义的差别;OD600值为0.542时,表达量次之;OD600值为0.384时,表达量最低。结论温度、表达时间和IPTG浓度在一定范围内对丁肝抗原蛋白表达量无影响;菌种的浓度是影响蛋白表达量的决定性因素;当菌种浓度在OD600值约为0.7～1.2时,以0.25mmol/L IPTG在37℃,诱导表达1h为最佳表达条件。该条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的41.5%。

比较不同中国株丁型肝炎病毒(HDV)重组抗原检测抗HDV抗体的差异

我国属于乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染高发区和丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）感染低发区。为了弄清我国ＨＤＶ感染率低是否是由于我国存在不同血清型ＨＤＶ所致，我们在原核细胞上表达了我国ＨＤＶ基因１Ａ亚型株（河南株）和ＩＢ亚型株（四川株）抗原编码区基因，并应用这些基因重组丁肝抗原检测了四川、河南、内蒙三省（区）的２５２份ＨＢｓＡｇ阳性携带者血清，并与美国提供的重组丁肝抗原做了比较。结果证明，对以上三种抗原均阳性者８份，对河南与美国抗原双阳性者１份，对四川与美国抗原双阳性者１份，仅对美国抗原阳性者１份。河南和四川抗原的阳性检出率均为３６％（９／２５２），美国抗原的检出率为４．３７％，三种抗原之间的总符合率均为９９．２％，经统计处理均无显著差异。这证明我国分离的ＨＤＶ株虽然属于ＨＤＶ基因Ⅰ型的两个不同基因亚型，但它们的免疫原性无明显区别，可能属于同一个血清型。同时亦证明我们两次全国流行病学调查发现的抗ＨＤＶ阳性率低，不是由于所用美国提供的丁肝抗原引起的。

应用抗-HBc单克隆抗体研究乙型肝炎核心抗原的抗原位点

应用基因工程表达的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫Balb/c小鼠,取该鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得8株能稳定分泌高滴度抗HBcAg抗体的杂交瘤细胞株.用其中7株(4A4、4B5、3H6、3A5、1G8、1D3、5G10)与HBcAg亲和性相近的单克隆抗体(McAb)首次证明,在HBcAg上存在3个不同的抗原位点,并分别命名为α、β和γ. α抗原位点:能诱生中和及免疫沉淀抗体,在体外能中和HBcAg的抗原活性,能与HBc-Ag产生免疫沉淀线.如3H6、4A4、4B5、3A5等单克隆抗体. β抗原位点:不能诱生中和及免疫沉淀抗体,但此种单克隆抗体与4A4或4B5混合后即可与HBcAg产生免疫沉淀线.如1G8、1D3 McAbs. γ抗原位点:能诱生免疫沉淀抗体,但不能诱生中和抗体.如5G10McAb. 抗相同抗原位点的单克隆抗体之间可产生有意义的互相竞争抑制,而抗不同抗原位点的单克隆抗体之间则无,或很少有竞争抑制.对有关问题进行了讨论.

抗丁型肝炎病毒(HDV)抗体酶联免疫测定(ELISA)方法的建立与应用

利用大肠杆菌表达的丁型肝炎病毒抗原(HDAg)和从人血清中纯化的抗-HDV IgG,首次在我国建立了检测抗-HDV抗体的ELISA方法。用此法检测53份HBsAg阳性病人和HBsAg携带者血清,并以Abbott Anti-Delta-EIA试剂进行标化,结果完全相同。检测1份抗-HDV抗体阳性血清,其ELISA滴度为80000,高于Abbott EIA试剂检测的ELISA滴度10000。 用此法检测国内部份省市地区HBsAg阳性病人和携带者的血清标本1155份,阳性者同Abbott检测的一致,无假阳性。此法可用于HDV感染的临床诊断,流行病学调查和其它研究,为在我国开展HDV肝炎的研究提供了可靠方法。

一种新的无传染性的检测HBeAg抗HBe的单克隆酶联免疫吸附法(MonoLISA)的建立与应用

应用我室自1988年5月以来建立的抗乙型肝炎e抗原两个抗原决定簇的单克隆抗体,和在大肠杆菌中高效表达的乙型肝炎病毒e抗原,组装成检测HBeAg/抗HBe的酶联免疫试剂(简称Mo-noLISA)。测定了该试剂的特异性、敏感性和可重复性,并与用日本单克隆抗体和血清e抗原组装的类似的EIA试剂进行了比较。结果两种试剂检测92份乙肝病人血清e抗原和38份血清e抗体的总符合率,分别为97.8％和100％。用两种试剂同时滴定一份已知HBeAg阳往和一份抗-HBe阳性的血清,证明两者的敏感性无显著差异。重复性试验证实,该试剂的重复率为100％。由此证明,用抗-HBeMcAb和基因工程抗原组装的诊断试剂,特异性强,敏感性高,可重复性好,且无传染性。这不仅为诊断试剂原材料的更新提供了丰富的来源,而且将该类试剂提高到一个新水平。

甘肃省部分县农村人群病毒性肝炎血清流行病学研究

目的 了解甘肃省国家级扶贫县农村人群病毒性肝炎病毒的感染状况.方法 采用ELISA方法检测人群血清中抗甲（HAV-IgG）、乙（HBsAg和HBsAb）、丙（HCV-IgG）和戊型肝炎病毒抗体（HEV-IgG）.血清来自5个县一般人群不同年龄组,共采集血清2 429份.结果 人群肝炎病毒抗体阳性率,抗-HAV、抗-HCV、抗-HEV流行率分别为77.97%、0.74%和13.92%,HBsAg阳性率为5.15%,抗-HBs阳性率为42.94%,HBeAg、抗-HBe阳性率分别为1.31%和2.48%,抗-HBc阳性率为41.70%.HAV感染率随年龄的增加而升高,10～14岁组68.99%的儿童已感染HAV.HBsAg阳性率显著低于1992年和2003年的7.74%和10.70%,15岁以下儿童HBsAg携带率为2.96%.结论 低年龄人群及局部地区甲肝的感染率较低.乙肝疫苗免疫接种工作已经取得效果.HCV感染率低于其他地区.戊型肝炎病毒感染率与居民的生活习性密切相关.

华北地区人群和商品猪戊型肝炎病毒感染的调查

戊型肝炎（HEV，简称戊肝）是人畜共患疾病，是20世纪80年代初被认识的一种病毒性肝炎，由戊肝病毒（HEV）感染引起的一种急性自限性肝炎。目前已被世界卫生组织（WHO）认为是发展中国家的一个重要公共卫生问题。1997年Meng等首次从美国本地猪中分离出野生株HE病毒．由此也揭示了动物作为戊型肝炎传染源的可能性。HEV主要经粪一口途径传播感染人和猪，可呈流行或散发两种形式，常常会通过食用被HEV污染的食物或与HEV携带者密切接触而感染，当水源被含有HEV的粪便污染后会引起大规模爆发流行。为了解华北地区人群和商品猪HEV的感染情况，对来自华北地区不同区域的两组人群和成年猪进行了HEV感染的抗体检测。

抗乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原双特异性单克隆抗体的建立与应用

用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达的乙型肝炎病毒核心抗原(内含高滴度的e抗原)免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合,获得两株分泌高滴度既抗-HBe又抗-HBc的双特异性杂交瘤细胞系。细胞培养上清液中抗体滴度为100～1000以上;免疫腹水中的抗体滴度为8万至10万以上,均属IgG2a亚类。细胞在实验室连续传代二年多,仍保持高效分泌抗体能力。此单克隆抗体与HBeAg或HBcAg的结合可被抗-HBc或抗-HBc阳性血清所抑制,竞争抑制率在85.9％～96.8％之间。用此单克隆抗体与HBe的β型单克隆抗体和抗HBc的α型单克隆抗体配对,可组装成检测HBeAg/抗-HBe和抗-HBc的诊断试剂,具有重要的应用价值。

浅谈大型储罐海水充水试验施工工艺原理

近年来．国家大型石油储罐建设多数位于沿海或海岛地区。大型储罐建造完成后．多采用洁净淡水进行充水试验，以检验储罐整体强度、浮船严密性及基础沉降。考虑到沿海、海岛部分地区淡水资源相对缺乏．而海水资源丰富，因此．如何利用海水进行充水试验日益受到关注，而其中最棘手的问题是海水防腐蚀。本文简单介绍大型储罐海水冲水试验原理及通过加设临时牺牲阳极块对罐壁、罐底、浮盘进行有效防护，

延边地区各种肝病患者HBsAg携带者及单项ALT增高者中抗-HCV分布

自1991年11月到1992年2月,用酶联免疫吸附试验对延边地区87例各种肝病患者.65例HBsAg携带者及5例单项ALT增高者血清共157份进行了抗-HCV检测.33例呈阳性,总阳性率为21.0％,其中单项ALT增高者高达80.O％.其次.急性肝炎为35.2％.慢性迁延性肝炎为18.2％.HBsAg携带者为6.2％,肝硬化为0％.

乙型肝炎患者及HBsAg携带者血清抗-HD,HDAg的检测

应用酶联免疫吸附试验检测延边地区135例乙型肝炎患者及HBsAg携带者中的HDAg和抗-HD.其中急性乙型肝炎41例、慢性迁延性肝炎10例、慢性活动性肝炎11例、肝硬化和肝癌各4例、HBsAg携带者65例.各种肝病患者和携带者中HDAg阳性率分别为7.1％和3.1％,但抗-HD均未检出.

北京地区部分人群接触密切的家畜（禽）戊型肝炎病毒感染血清学调查

目的了解北京地区戊型肝炎（戊肝）病毒感染现状。方法采用EIA诊断试剂检测人群、猪和鸡血清中戊肝病毒（HEV）抗体。结果1208份人群血清中有260份HEV－IgG抗体阳性，总阳性率为21．52％，对260份HEV IgG阳性血进行IgM抗体检测，有22份阳性，占8．46％。32份猪血清中有15份阳性，阳性率为46.88％，34份鸡血清HEV抗体全部为阴性。人群不同年龄组HEV抗体阳性率依次为11～20岁为5．60％（14／250），21～30岁为20％（42／210），31～40岁为24．03％（62／258），41～50岁为26．44％（78／295），51～60岁为32．82％（64／195），男女不同性别HEV感染率比较，男性阳性率为29．51％（144／488），女性为21．70％（102／470）。结论北京地区人群和与人接触密切的家畜猪均存在戊肝病毒感染，人群戊肝病毒感染率随年龄增长而升高，尤其是男性戊肝病毒感染率明显高于女性，郊区流动人群戊肝病毒感染率明显高于市内人群，家畜猪感染率是人群的2倍以上。

杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。

四川地区部分人群和与人接触密切的家畜禽戊型肝炎病毒感染的调查及基因分型的研究

目的了解四川地区人群和与人接触密切的家畜猪和鸡戊型肝炎（戊肝）病毒感染的分布及病毒基因分析。方法采用万泰生物药业的HEV EIA诊断试剂检测人群、猪和鸡血清中戊肝病毒（HEV）IgG抗体。采用逆转录套式PCR方法（RT-nPCR）检测猪胆汁和血清中戊肝病毒核酸，并对阳性产物进行纯化和部分核苷酸序列分析。结果学龄前儿童血清672份中有41份阳性，阳性率6．1％，成人血清661份中有280例阳性，阳性率42．36％，猪血清36份中有32份阳性，阳性率为88．89％，59份鸡血清HEV抗体均阴性。对15份HEV IgM抗体阳性的患者血清和54份猪胆汁进行RT-nPCR，从1份患者血清和3份猪胆汁扩增到戊肝病毒核酸，4株核苷酸序列之间同源性92．1％～98．6％，与GenBank HEV参考株ORF2相对应序列比较，核苷酸序列与Ch-T21（我国散发性急性肝炎人分离株HEV4B亚型）之间同源性最高占90．1％～96．9％。结论四川地区部分人群和与人接触密切的家畜猪均存在HEV感染，尤其是家畜猪感染率高达90％左右，从人和猪分离到的病毒株核苷酸同源性很高，均属于戊肝病毒基因4型。

表达丙型肝炎病毒NS3和Core融合蛋白基因的DNA疫苗免疫方案优化

目的本研究旨在构建一种包含丙型肝炎病毒（HCV）保守区基因的新型DNA疫苗，并在小鼠模型中使用电转技术优化其免疫原性。方法首先，我们构建了包含HCV非结构蛋白NS3和核心蛋白Core部分基因序列的DNA疫苗，并证实了其表达；然后采用不同的体内电转方式于第0、4周分别免疫BALB／c小鼠，比较分析不同免疫方案的体液免疫（特异性IgG与抗体亚类）与细胞免疫应答（IFN-γ ELISPOT）的效果。结果使用电转技术可显著增强新型DNA疫苗免疫原性，采用皮内注射加卡钳电极电转的方式产生最强NS3特异性T细胞免疫反应。结论包含HCV保守区基因的新型DNA疫苗可通过优化电转技术增强免疫应答效果。这为我们下一步优化HCVDNA疫苗的免疫方案提供了依据。

我国六省市（区）部分人群丙型肝炎病毒感染调查

目的 了解我国健康人群丙型肝炎病毒感染现状.方法 采用北京万泰生物药业的HCV EIA诊断试剂检测人群血清丙型肝炎病毒（丙肝,HCV）IgG抗体.结果 六省市（区）人群血清共9 538份,HCV抗体阳性数37份,总阳性率为0.39％,其中北京人群阳性率0.23％,黑龙江人群为0.74％,山东人群为0.26％,宁夏人群为0.10％,甘肃和四川人群阳性率均为0.44％.对37例HCV阳性者性别及年龄分析,男性19例占51.35％,女性18例占48.65％,＜10岁年龄组1例,占2.70％,10～19岁组5例,占13.51％,20～29岁4例占10.81％,30～39岁组6例,占16.22％,40～49岁组9例,占24.32％,≥50岁有12例占32.43％.对HCV阳性者重叠其他型别肝炎病毒感染分析,单独HCV阳性2例,占5.41％,伴有HAV-IgG抗体阳性35例,占94.59％,伴有HEV-IgG抗体阳性10例,占27.03％,伴有HBsAg、HBcAb和HbeAb阳性者2例,占5.41％,该2例HAV和HEV抗体也阳性.结论 六省市（区）人群HCV感染率均在1％以下,感染者年龄以50岁以上最高,决大多数HCV阳性者重叠有其他型别的肝炎病毒感染.

四种乙肝病毒表面抗原ELISA诊断试剂的评价

目的对四种国内乙肝病毒表面抗原诊断试剂进行评价。方法用四种试剂分别对标准品和未知血清进行检测,用几种常用诊断试验评价方法对检测结果进行分析和比较。结果四种试剂对标准血清的检测结果较好,A、B两种试剂的总符合率为100%,另两种的总符合率也在90%以上,其中B试剂有较好的精密性。δ值比较显示A和B两种试剂有较好的诊断特性。四种试剂在一定的抗原浓度范围内都有良好的线性关系。针对于未知样本的检测中,四种试剂与采用电发光法的罗氏诊断试剂有较好的一致性。结论国内主要厂家的HBsAgELISA诊断试剂具有较高的检测效能。在实际工作中,可以通过常用的诊断试剂筛选实验,经统计分析后筛选出较高效能诊断试剂用于检测。

丁型肝炎病毒抗原的原核表达及抗原性分析

目的利用含T7启动子和His纯化标签pRSETB质粒构建丁型肝炎病毒抗原(HDAg)重组表达质粒(pRSETB-HDAg),转化宿主菌,表达并纯化,获得生物活性高抗原性强的基因工程重组抗原。方法将中国河南株HDAg基因片段插入pRSETB表达质粒,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导表达。表达产物经Chelating亲和层析纯化后,采用EIA方法分析HDAg的抗原性。结果重组HDAg稀释1000倍(10ng/ml)仍与抗体有较强的反应。经与美国HDAg和华美公司生产的HDV诊断试剂同时检测26份HDV阳性参比血清,三者结果比较,除美国抗原漏检1份,检出率为96·15%(25/26份)外,病毒CDC和华美试剂均无漏检,检出率为100%,三者检测结果具有很高的符合率。结论成功构建了丁型肝炎病毒抗原重组表达质粒(pRSETB-HDAg),在原核细胞获得稳定高效表达,EIA检测证明HDAg抗原性好,可用于组装HDV诊断试剂,用于临床丁型肝炎患者的诊断和我国丁型肝炎病毒感染流行病学的调查。

风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价

原核表达与层析纯化获取风疹病毒（Rubella Virus,RV）多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性。将RV衣壳蛋白C aa 3～29、aa 96～123以及包膜糖蛋白E1aa208～247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot（WB）技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别。分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgM ELISA血清学检测中。