广州地区RhD阴性献血者Del表型及基因型分析

目的研究广州地区RhD阴性献血者D放散型(Del)分布、表型及基因型以了解本地区DEL血型分子生物学背景。方法对2021年11月1日—2022年6月30日期间广州地区献血者采用盐水法初筛为RhD阴性血液进行间接抗人球蛋白试验(IAT)血清学确认、采用RhCE分型卡确定RhCE表型,对1146例确认RhD阴性所有C+(n=459)以及随机抽取部分C-标本(n=175)进行吸收放散(Del)筛查(共634例);提取Del阳性标本DNA进行高分辨熔解曲线分析法(HRM)实时荧光PCR检测RHD基因c.1227位点基因情况;对HRM检测RHD^(*)1227位点无突变标本采用限制性片段多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)扩增后产物作PstⅠ酶切,进行电泳分析RHD基因合子型;sanger法进行RHD基因进行外显子测序(exon 1-10),采用SeqMan软件分析基因突变情况;采用第3代单分子测序技术对可疑Del阳性标本进行RHD全基因分析。结果634例确认RhD阴性标本吸收放散试验结果显示Del表型占36.1%(229/634),占总RhD确认阴性的20%(229/1146);229例DEL的RhCE分型分别为Ccee 181例,CCee 40例,CcEe 7例,ccEe 1例,HRM结合RHD盒子型分析结果显示170例RHD基因为RHD^(*)1227A/01N.01、32例为RHD^(*)1227A/1227G,26例为RHD^(*)1227A/1227A、6例为RHD^(*)1227G/1227G(其RHD基因测序结果显示1例为弱D12型、4例为D-和1例RHD^(*)01EL.02)。结论广州地区献血者DEL个体基因型以RHD^(*)1227A/01N.01为主且其RhCE表型均为C+的特征;HRM可作为常规筛查“亚洲型”DEL血型基因的分子生物学方法。

IgG型意外抗体鉴定用试剂盒(固相凝集法)的研发

目的研发IgG型意外抗体鉴定用试剂盒(固相凝集法)。方法琥珀酰亚胺溶液包被微孔板后,将谱细胞悬液加入微孔板中制得红细胞单层,随后用1×PBS(pH7.40)裂解红细胞单层形成细胞膜单层;将低温干燥保护液加至细胞膜单层表面,4℃干燥后制成试剂盒反应板;定期用制备的试剂盒测试低效价IgG抗-E和抗-Fy a,以评估试剂盒稳定性;对72例意外抗体阳性血浆标本和152例正常血浆标本采用研发的试剂盒和微柱凝胶卡进行抗体鉴定试验,计算灵敏度和特异度指标,采用卡方检验分析,以评估试剂盒的检测性能。结果琥珀酰亚胺包被的微板能够较好的固定裂解后的红细胞膜;低温干燥保护液对膜单层能够形成较好的保护作用;在各个观察点内,低效价的IgG抗-E和抗-Fy a均能被准确检出;与微柱凝胶卡相比,72例意外抗体阳性的标本,固相法试剂盒正确检出70例,同时纠正1例凝胶卡漏检的抗-JK a;152例意外抗体阴性标本,2种试剂分别正确检出149例和152例。两者的灵敏度为97.22%(70/72)vs 98.61%(71/72),特异度为98.02%(149/152)vs 100%(152/152),配对卡方检验结果表明,2种试剂盒的检测结果差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论采用固相凝集法研发的试剂盒,适用于IgG型意外抗体的鉴定。

单核细胞单层试验在预测IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病中的应用

目的探讨单核细胞单层实验(monocyte monolayer assay,MMA)是否能够用于IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of fetus and newborn,HDFN)的预测。方法选取8例含有IgG抗-M的孕妇并采集血浆标本,其中有胎儿水肿等严重临床症状及无明显临床症状的各4例;8份血浆用二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)灭活,与M抗原阳性红细胞孵育致敏后,将致敏红细胞与单核细胞混合进行吞噬试验,同时设立阳性及阴性对照,并计算吞噬率;采用t检验对2组吞噬率进行比较。结果4例发生严重抗-M相关HDFN的孕妇的MMA吞噬率分别为15.37%、13.05%、9.17%和24.50%,均值为15.52%;检出IgG抗-M但未发生HDFN的孕妇,其MMA吞噬率分别为8.74%、11.07%、5.12%和6.23%,均值为7.79%,2组吞噬率无差异(P>0.05)。2组吞噬率分别与阴性对照比较均无差异(P>0.05),但均明显低于阳性对照(P<0.05)。结论IgG抗-M介导单核细胞吞噬的能力较低,提示抗-M导致胎儿水肿的机制可能并非红细胞被吞噬破坏而发生的溶血,因此体外单核细胞单层实验可能不适用于IgG抗-M相关HDFN的预测。对于检出IgG抗-M的孕妇,现仍需通过定期监测胎儿大脑中动脉血流,来判断胎儿宫内贫血情况。

罕见抗-Di^(b)致严重胎儿新生儿溶血病的实验室检测与相关研究

目的对1例高频抗体导致的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)进行检测、鉴定及配血。方法对患儿进行新生儿溶血试验,对母亲进行血清学意外抗体鉴定,并对母亲红细胞进行常见高频抗原鉴定;对检出抗体进行IgG分型检测,并用流式细胞术进行单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验,以检测抗体相关的吞噬率;对患儿母亲、父亲及舅舅进行相关红细胞血型基因测序;利用稀释的母亲血浆和抗人球卡法,在献血者中进行大规模相合血液的筛选。结果产妇鉴定为Di(b-)稀有血型,产生了抗-Di b(效价512)并导致了严重的HDFN;抗-Di b亚型分型为IgG1和IgG2型,单核细胞体外吞噬效率为88.83%(74.7/84.09);产妇亲属中没有相合献血者,后续从5520名献血者中筛选到2例Di(b-)相合血液,患儿接收输血治疗后康复出院。后续在51334名献血者中筛查到17名Di(b-)献血者,该数据表明Di(b-)在广州地区献血者中的分布频率约为三千分之一(0.033%,17/51334)。结论综合利用血型血清学及分子生物学方法诊断了抗-Di b所致的严重HDFN,建立了1种有效大规模筛查Di(b-)稀有血型的方法并找到相合血液,为建立Di(b-)稀有血型库奠定了基础。

观察小儿护理过程中应用肢体语言沟通对医嘱接受度和生活质量的影响

目的:分析研究肢体语言沟通的护理效果。方法:选取本院90例小儿患者作为本次的研究对象,时间为2020年4月至2021年4月,采取随机颜色球抽取法将所有患者分为参照组(行常规护理)和研究组(行肢体语言沟通护理),各45例。比较两组医嘱接受度、家长满意度、患儿不良情绪及生活质量。结果:研究组患儿医嘱接受度明显高于参照组(P<0.05),社会功能、精神健康以及身体健康评分均明显高于参照组(P<0.05),家属满意度明显高于参照组(P<0.05),患儿护理后SAS、SDS等不良情绪评分均明显低于参照组,差异有明显的统计学意义(P<0.05)。结论:肢体语言沟通的护理效果更好,可提高患儿医嘱接受度,取得患儿的积极配合,促进病情恢复,提高患儿生活质量,缓解患儿负面情绪,并取得较为满意的护理效果,具有应用价值。

RhD双群患者的血清学及分子生物学分析--附1例报道

目的对1名配血困难的RhD双群(double population,DP)患者进行血清学及分子生物学分析,解决其RhD血型鉴定及临床用血问题。方法用毛细管离心法分离患者红细胞,对近心端、远心端红细胞分别进行ABO和Rh血型鉴定,以及直接抗人球蛋白试验;对患者血浆进行不规则抗体筛选及鉴定以及交叉配血试验;采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测RHD基因合子型,采用序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)进行RHD和RHCE基因型检测。结果血型鉴定的结果显示该患者血型为B型,RhD及RhCE的c和E血型抗原均为DP,直抗阳性,抗体筛查及鉴定结果显示血浆中含有抗-D;PCR-RFLP结果显示该患者RHD基因盒子型为D-/D-纯合子,即为RHD编码基因缺失型所致的RhD阴性;PCR-SSP的结果也显示该患者RHD编码基因外显子均缺失,RHD基因型为RHD*01N.01/01N.01,RHCE基因型为Ccee。结论本例患者在急救情况下输注了RhD阳性血液,之后被误判为RhD阳性血型,实则为RhD阴性血型。本中心在血型鉴定为DP时,利用分子生物学方法对患者进行了Rh血型准确鉴定,为该患者的精准临床用血提供了依据。

中国人群中RHAG变异对mRNA剪接影响的体外研究

目的通过mRNA异常剪接体外验证实验,即体外微基因剪接系统(minigene splicing assay,MSA),研究中国人群中发现的RHAG突变对于RHAG基因mRNA剪接的影响。方法通过对KMxD数据库中RHAG基因数据的分析,选择10种中国人群中分布频率相对较高的位于RHAG基因剪接位点附近的突变或编码区域的同义突变,构建相应的RHAG外显子野生型及突变型pSplicePOLR2G微基因表达质粒。转染HEK-293T细胞,48 h后收集细胞提取总RNA,反转录后进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测和毛细管电泳检测,根据实验结果判断RHAG基因突变是否会影响相应外显子的正常剪接。结果2种RHAG基因剪接位点附近突变(c.158-5delT,c.807+3A>C)轻微减弱了原剪接位点的剪接效率,其余8种突变(c.312G>A,c.341+3G>A,c.609C>T,c.681G>A,c.861G>A,c.957T>A,c.984T>C和c.1139-7G>A)均不影响RHAG基因mRNA的剪接。结论RHAG基因在剪接方面比较保守,剪接位点附近突变及编码区同义突变较少会引起RHAG基因异常剪接。

稀有抗体抗-Jk^3的发现及Jk(a-b-)血型家系遗传背景研究

目的研究抗-Jk3的血清学特异性及产生该抗体的Jk(a-b-)稀有血型的遗传途径,了解该血型在广州地区人群的分布。方法患者血清与试剂谱红细胞在盐水介质,低离子介质凝聚胺和coomb's微柱凝胶中反应,分析鉴定其抗体特异性;对kidd血型进行家系调查,分析Jk(a-b-)稀有血型的遗传背景;采用2mol/L尿素溶血试验初筛,coomb's微柱凝胶试验确认,对广州地区32 000名献血者的红细胞作Jk(a-b-)血型筛查。结果患者血清与试剂红细胞在低离子凝聚胺介质和coomb's微柱凝胶介质中的反应格局显示患者血清中含有抗-Jk3,kidd血型家系遗传研究提示母方带有Jkb/Jknull基因,推测父方至少带有1条Jknull基因;在32 000名献血者中发现8名Jk(a-b-)个体。结论该例同种抗体为IgG抗-Jk3特异性抗体;隐性基因Jknull可以遗传,当该基因为纯合子时表现为Jk(a-b-)表型个体,该血型在广州地区人群分布频率为0.025%,解决稀有血型患者输血问题的有效措施是建立本地区的稀有血型献血者队伍。

Sephadex-G50微柱凝胶血型试剂的研制和应用

目的研制卡式微柱凝胶血型试剂并应用于血型血清学试验。方法以Sephadex-G50超细凝胶为分子筛载体,制备成中性微柱凝胶试剂卡、特异性凝胶试剂卡及coomb′s凝胶试剂卡并用于血型鉴定、配血试验、抗体筛选和鉴定,对1000名献血者ABO及Rh(D)血型进行鉴定,其中A型272例、B型279例、B3亚型1例、O型437例、AB型11例;Rh(D)阴性2例,Rh(D)阳性998例;对100例输血前检查标本进行配血试验;以coomb′s凝胶试剂卡对抗-D、-C、-c、-E、-e、-Jka、-Jkb、-Fya、-Dia等9个抗体分别与谱红细胞反应做特异性抗体鉴定试验;同时以瑞士进口的DiaMed同类产品及常规的血型血清学试管法同步比较。结果研制的卡式微柱凝胶血型试剂与瑞士进口的DiaMed同类产品比较,检验结果、敏感性、特异性无明显差别。结论研制的卡式微柱凝胶试剂适用于血型鉴定、配血试验、抗体筛选和鉴定等血型血清学检查,该试剂制备具有成本低、工艺简单的优点,具有较好的推广应用和开发价值。

不完全抗体快速反应介质在新生儿溶血病检测中的应用

目的 探讨新研制的不完全抗体快速反应介质在母婴血型不合新生儿溶血病 (HDN)检测中应用的可行性 ,并建立检测新方法 ,为推广应用本法提供理论和实验依据。方法 应用本文建立的新检测方法 ,以传统使用的间接抗人球蛋白法作平衡对照试验 ,同时对 110 4例新生儿标本进行“3项试验”(直接抗人球蛋白试验、血清游离抗体检测、红细胞抗体释放试验 )血型血清学分析。结果 两法相比 ,取得完全一致的实验结果。在受检的 110 4例标本中 ,43 0例实验确诊为HDN ,其中确诊为ABO -HDN 416例 ,Rh -HDN 13例 ,MN -HDN 1例。结论 本文建立的方法操作简单易行 ,结果准确可靠 ,灵敏度高、重复性好 ,实验耗时短 ,适合应用于HDN的实验室检查诊断。

红细胞谱细胞的建立及临床应用

目的 :建立一套能快速鉴定血型抗体特异性的谱红细胞。方法 :挑选O型健康献血员的红细胞 ,应用相关血型系统特异性的抗血清 ,先在微板上进行相关血型抗原分型初筛试验 ,挑选出符合要求的抗原 ,然后用试管法做抗原确证试验。结果 :筛选出 2 2名献血员为谱细胞成员 ,组成每套为 10份的谱细胞 ,包含D、E、Jka、Jkb、Fya、Fyb、Mur等 2 0余种抗原 ,可鉴定出Rh、NM、P、Lewis、Kidd等 8个常见血型系统 2 0余种抗体。谱细胞应用于临床 ,鉴定出各种抗体 33例。结论 :本项研究建立的谱细胞抗原分布合理 ,鉴定抗体能力强 。

GZB试剂红细胞4℃保存液的研究及其临床应用

本文介绍一种新的试剂红细胞４℃保存液及其应用。结果表明，用该液保存试剂红细胞在４～６℃下可保存１２０天，较国内外目前已报道的保存期（最长５６天）明显延长。该法不需特殊设备，试剂原料成本低，来源方便易购，保存细胞具有保存期长，使用方便，抗原特异性及强度不受影响，随时可取用等特点。使用效果良好。

中国汉族人群人类白细胞抗原DRB1~* 04等位基因多态性

目的研究中国南方和北方汉族人群的人类白细胞抗原(HLA)-DRB1*04等位基因多态性。方法采用PCR-SBT对104名南方和168名北方汉族无偿献血者的HLA-DRB1*04基因做高分辨分型,并采用高分辨PCR-SSP对其中的DRB1*0406/0449模棱两可等位基因做精确分型,进而采用卡方检验对南北方汉族群体的DRB1*04等位基因与其他不同种群的分布情况做比较。结果56个DRB1*0406/0449模棱两可等位基因的分型结果全部为DRB1*0406。南方汉族无偿献血者共检出5种DRB1*04基因,最常见的为DRB1*0405(47.32%)、DRB1*0406(24.24%)和DRB1*0403(16.35%),北方汉族无偿献血者共检出10种DRB1*04等位基因,以DRB1*0405(40.48%)、DRB1*0406(18.45%)和DRB1*0403(17.26%)常见。中国南方、北方汉族人群HLA-DRB1*04等位基因的总体分布格局与高加索人、非裔美国人、西班牙人和亚洲/太平洋岛民存在明显差异,而与韩国人非常接近。结论中国南北汉族人群HLA-DRB1*04等位基因的总体分布格局不同,但主要等位基因DRB1*0405、DRB1*0406和DRB1*0403的分布无明显差异;不同种群的DRB1*04等位基因的分布各具特色。

ACP215型血液处理仪制备冰冻红细胞的方法学评价

目的应用ACP 215型血液处理仪制备甘油化红细胞、去甘油化红细胞,观察去甘油化红细胞的质控指标,并对操作方法和制备效果进行评价。方法随机取10袋红细胞悬液(2U/袋),于采血后10天应用215型血液仪处理制备甘油化红细胞,-70℃冰箱保存30天,37℃融化,再应用215型血液处理仪制备去甘油化红细胞。解冻红细胞洗涤前后留取样本检测冰冻红细胞质量。结果红细胞回收率(84±4)%,游离血红蛋白浓度(0.31±0.12)g/L,体外溶血试验(33±15)%,甘油残余量(6.3±2.4)g/L。细菌培养试验阴性。结论ACP 215型血液处理仪可全程自动化无菌制备冰冻红细胞,人为操作误差小,产品质量保证,值得推广。

mPEG-BTC体外修饰红细胞抗原解决疑难交叉配血的初步研究

目的探讨甲氧基聚乙二醇-苯丙三唑(mPEG-BTC)对红细胞抗原遮蔽的效果,为疑难交叉配血提供新的血液选择途径。方法用mPEG-BTC修饰12名健康志愿献血者红细胞(A型、B型、AB型、O型各3例),并收集了含高效价不规则抗体及发生临床配血困难病例标本15例。检测mPEG-BTC修饰前后的红细胞ABO、Rh、Kidd、Duffy、Ss血型抗原变化情况,比较mPEG-BTC修饰前后的献血者红细胞与15例疑难交叉配血标本在盐水介质、聚凝胺介质、抗人球蛋白介质中的配血结果。结果 mPEG-BTC可以完全遮蔽受试红细胞ABO、Rh、Kidd、Duffy、Ss血型抗原,红细胞不再与这些血型抗原对应的抗体反应,也不与上述病例血清中的任何抗体发生反应。修饰后的红细胞与疑难交叉配血标本在盐水介质、聚凝胺介质、抗人球蛋白介质中均未出现凝集反应,达到了临床配血输用的要求。结论 mPEG-BTC对红细胞血型抗原有较好的遮蔽效果,经其修饰的红细胞在体外实验中较好地解决了疑难交叉配血的血液选择问题。

1例AmosB的血清学和分子生物学特征分析

目的研究1例罕见AmosB的血清学和分子生物学特征。方法采用ABO血型定型凝胶卡检测受检者的ABO血型;采用鼠源的IgG抗-A和抗-B(一抗)与受检者红细胞进行孵育后,加入FITC标记的羊抗鼠抗体(二抗),用流式细胞分选仪检测其细胞构成比例;采用PCR-SSP法检测其HLA-A、B、DRB1位点的等位基因;用STR-PCR方法检测其15个短串联重复序列位点的等位基因。结果ABO血型检测抗-A部分呈现混合凝集外观,抗-B部分凝集强度4+;流式细胞仪检测表明B细胞占87%,A细胞占13%;HLA-A、-B、-DRB1位点均有3个等位基因出现,

广州地区无偿献血者抗-Mur筛查及Mur抗原基因型检测

目的了解广州地区无偿献血者中抗-Mur及Mur抗原基因型的频率,为指导临床输血及产前抗体监测提供依据。方法用微柱凝胶卡方法筛查2725名献血者血清中37℃有活性的抗-Mur;采用多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)对91名献血者的Mur抗原基因型进行检测,然后用人源抗-Mur血清检测Mur抗原基因型阳性样本的红细胞表型。结果无偿献血者血清中抗-Mur频率为0.04%(1/2725),Mur抗原基因型阳性频率为6.59%(6/91),经血型血清学方法验证基因型与表型符合率为100%(6/6)。结论广州地区无偿献血者中抗-Mur频率较低,而Mur抗原阳性则相对较常见;通过MLPA方法检测Mur抗原基因型可以准确推断其表型,解决了因缺乏商品化抗-Mur试剂导致Mur抗原鉴定难以开展的难题。

血小板特异性基因(HPA-1～17)在广州地区人群中分布的多态性研究

目的:调查在广州地区人群中HPA-1～17基因的多态性及其表达频率。方法:采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)对500名健康的血小板捐献者的HPA基因进行分型。结果:广州地区健康的血小板捐献者中表达出HPA-a基因中的1a～17a基因;各基因独立的分布频率中,HPA-1a(99.8%)、2a(99.85%)、3a(56.3%)、4a(99.9%)、5a(98.8%)、6a(98.6%)、15a(55.1%),HPA-7a～14a、16a、17a均为100%。仅表达HPA-b基因中的1b、2b、3b、4b、5b、6b和15b,分布频率为HPA-1b(0.2%)、2b(0.15%)、3b(43.7%)、4b(0.1%)、5b(1.2%)、6b(1.4%)、15b(44.9%);未表达HPA-7b、8b、9b、10b、11b、12b、13b、14b、16b和17b;说明HPA-1a～17a和HPA-3b、15b在广州地区为高频率基因。在与中国汉族不同地区HPA基因多态性分布的比较分析中发现,广州地区人群中HPA基因频率与北京地区人群的差异较明显;在与部分国家民族人群的比较分析中发现,广州地区人群中HPA基因频率与欧洲、美国、英国和埃及人群有较明显差异,而与日本和泰国人群的差异较小。文中调查和分析了HPA基因组合型及其频率,发现广州地区HPA基因有40种组合型,其中仅有5种基因组合型频率>10%(占25%),另外35种基因组合型的频率均<9%(占75%)。结论:数据提示广州地区人群中HPA基因遗传距离较接近。HPA基因表达和分布频率在中国汉族人群中存在南北差异。与不同亚洲以外的种族和国家之间亦表现出基因表达和分布的差异。HPA基因多态性研究数据有利于指导地区性血小板供者库库容的设计,配合临床开展选择适合性血小板输注,避免同种免疫造成的血小板输注无效,且对开展HPA相关临床研究具有重要意义。

广州市无偿献血者中抗-HCV阳性人群的比较分析

目的了解广州市不同性别、年龄以及不同职业的无偿献血者抗-HCV阳性率情况。方法对从2000年1月～2010年12月的2 520 179(人)份广州市无偿献血者的血液标本,采用ELISA做抗-HCV双试剂检测并对检测结果做统计学分析。结果广州地区无偿献血者抗-HCV阳性率为0.42%(10 570/2 520 179),且在不同性别、年龄、职业之间差异具有统计学意义(P<0.05)。女性抗-HCV阳性率(0.29%)低于男性(0.52%);<35岁[18～<25岁(0.40%);25～35岁(0.36%)]较≥35岁[35～45岁(0.54)%,45～55岁(0.52%)]的献血者的抗-HCV阳性率低;工人(0.56%)和无职业者(0.76%)的抗-HCV阳性率比较高,医务人员血样中未检出抗-HCV阳性。结论广州市无偿献血人群中抗-HCV阳性率较低,符合献血条件的≤35岁的人群积极献血将有利于保障临床输血安全;宜加强对工人和无职业者献血安全和输血相关病毒知识的宣传和教育。

高通量红细胞血型基因分型的多重连接依赖的探针扩增技术在一例抗Di^a新生儿溶血病诊断中的应用

目的运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)辅助诊断一例罕见的由抗Di^a导致的严重核黄疸新生儿溶血病。方法运用传统的血型血清学方法对导致新生儿溶血病相关红细胞血型抗体进行鉴定,运用MLPA对患儿及其父母的超过40种红细胞血型抗原进行基因分型,对鉴定的抗体进行效价分析。结果血型血清学检测表明患儿体内含有针对某种低频抗原的抗体,MLPA基因分析结果提示母婴红细胞MNS血型系统及Diego血型系统抗原不匹配,可能存在抗N或抗Di^a,经进一步的血型血清学检测,证实母亲及患儿血清中存在抗Di^a,并且其母亲血清抗Di^a效价为1:32。结论抗Di^a可引起包括核黄疸在内的严重新生儿溶血病;高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够协助并有效解决临床疑难样本稀有血型鉴定;针对国人的Di^a阳性的试剂红细胞应该常规应用于日常的抗体筛查工作中。