茶黄素体外抑菌作用研究

通过体外试验研究茶黄素对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠球菌、禽肺炎克雷伯、鸭源鸡杆菌、禽肠炎沙门氏菌、野鸟黏质沙雷氏菌、禽巴氏杆菌的抑菌作用。采用最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定法研究茶黄素的抑菌作用及杀菌作用。结果显示,茶黄素对禽巴氏杆菌、鸭源鸡杆菌等具有抑菌作用,并与其浓度呈正相关,而对大肠埃希氏菌、禽肠炎沙门氏菌、黏质沙雷氏菌等无作用;茶黄素浓度为128μg/mL时,其对鸭源鸡杆菌生长具有抑制作用,当茶黄素浓度为512μg/mL时,其对禽巴氏杆菌C48-1生长具有抑制作用;当茶黄素浓度为512μg/mL时,其对禽巴氏杆菌和鸭源鸡杆菌具有杀菌作用。茶黄素在MBC浓度时能抑制生物被膜的形成能力。结果表明,茶黄素是一种天然抗菌剂,具有优良的替抗前景,促进绿色健康养殖。

血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

旨在从送检的病鸡中分离鉴定出禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV),为临床诊断和疫病防控提供参考依据。本研究将阳性样品接种SPF鸡胚并传代,利用PCR检测、基因序列分析、动物回归试验等方法鉴定病毒。结果:经过鸡胚传代及病毒特异性检测获得了纯净的FAdV,命名为HB2306;分析Hexon基因序列可知,HB2306株属于血清4型分支,与国内外分离的FAdV-4毒株核苷酸序列同源性为98.2%~99.9%,HB2306株与国内外的4型高致病性毒株氨基酸序列相似性在97.9%~99.8%;受试动物临床病理变化显示,HB2306株以104.5EID50/只的剂量经胸部肌肉注射后,引起宿主心包积液,肝脏变黄肿胀、淤血出血,肾出血、肿胀等典型的病理变化,与流行的高致病性毒株所致临床症状相似,且死亡率为100%。综上,本研究成功分离并鉴定出一株FAdV-4高致病力毒株,丰富了毒种库,为该病毒感染的流行情况调查和综合防控奠定了基础。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

A、B、J亚群禽白血病病毒混合感染的鉴定及gp85基因序列分析

【目的】了解湖北地区禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)亚群之间混合感染及其gp85基因遗传变异情况,为进一步研究ALV混合感染的流行病学提供参考。【方法】对来自湖北宜昌疑似感染ALV的一只病死鸡进行病理剖检,无菌采集病变组织接种DF-1细胞进行病毒分离,通过PCR、ELISA及间接免疫荧光试验(IFA)等方法进行亚群鉴定,进一步对分离株gp85基因的相似性和变异情况进行分析。【结果】剖检结果可见病死鸡肾脏、脾脏肿大,肺脏出血,表面可见灰白色肿瘤结节;组织匀浆接种DF-1细胞后,ELISA检测发现细胞上清P27抗原呈阳性;IFA检测发现,感染细胞里有特异性绿色荧光;PCR鉴定能同时扩增出A(692 bp)、B(847 bp)和J(545 bp)亚群的特异性条带。鉴定结果表明,从该病死鸡中分离到A、B和J亚群ALV毒株,分别命名为HBYC2022-A、HBYC2022-B和HBYC2022-J。分离株gp85基因核苷酸相似性分析显示,HBYC2022-A与江苏株JS-A1201相似性最高,为99.6%;HBYC2022-B与江苏株JS-B1204相似性最高,为99.7%;而HBYC2022-J与黑龙江株PK19FA01、广西株GX20YL12 J及安徽株AHaq02相似性均为100%。此外,分离株gp85基因高突变区域(hr1、hr2)氨基酸序列并未出现特殊点突变。【结论】鸡群存在A、B和J不同亚群ALV的混合感染情况,提示国内养禽场需提高警惕并加强针对ALV各亚群的流行病学调查。

鸡胚免疫新城疫疫苗后宿主法氏囊转录组学分析

【目的】通过转录组学分析鸡胚免疫新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C株后宿主法氏囊内免疫关键基因及信号通路分子转录差异,探究免疫后宿主法氏囊内免疫相关分子的调控反应。【方法】将60只18胚龄SPF鸡胚随机分为免疫组和对照组,30枚/组,免疫组将NDV TS09-C株通过羊膜腔接种鸡胚,剂量为103.0 EID 50/枚,注射体积为0.1 mL,对照组以同样的方法接种等体积PBS。检测免疫后不同时间点肺脏、胸腺、脾脏和法氏囊组织的病毒载量。选取病毒载量最高的法氏囊组织进行转录组学测序后,筛选免疫相关差异表达基因并分析其参与的主要功能及通路。【结果】免疫后1 d法氏囊组织中即可监测到病毒,免疫后3 d病毒载量达到最高。将免疫后3 d的法氏囊进行转录组学分析,与对照组相比,免疫组有453个基因上调、98个基因下调,其中免疫相关基因有36个上调、10个下调。免疫相关差异表达基因主要富集于自噬和细胞因子-细胞因子受体相互作用的免疫相关通路。差异表达基因蛋白互作分析显示,自噬通路中富集的BCL2与其他免疫相关基因有较多互作关系,且在B细胞活化、分化、免疫系统发育等功能注释中均有参与。【结论】本研究结果揭示了鸡胚免疫NDV TS09-C株后法氏囊内调控B细胞活化、分化的潜在靶向基因及通路,为进一步研究该毒株鸡胚免疫后B淋巴细胞调控的分子机制提供新的信息。

竹叶黄酮对鸡胚接种新城疫疫苗免疫效果的影响

【目的】探究竹叶黄酮(bamboo leaf flavonoid,BLF)作为疫苗佐剂对新城疫(ND)疫苗鸡胚接种的免疫效果影响。【方法】试验选取18胚龄SPF种蛋108枚,随机分为3组:Control组(不注射任何物质)、TS组(注射0.1 mL 103.0 EID 50/0.1 mL的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C疫苗株)和BLF+TS组(注射0.1 mL含2%BLF和103.0 EID 50/0.1 mL的NDV TS09-C疫苗株的混合液),每组36枚种蛋。试验期间,统计种蛋的孵化率和雏鸡的存活率,在雏鸡7、14、21、28日龄时,每组随机选取3只进行屠宰,采集脾脏、法氏囊、胸腺组织,统计免疫器官指数;采集雏鸡翅下静脉血液,测定血清抗体和细胞因子水平;在雏鸡28日龄时使用NDV强毒株F48E9进行攻毒保护试验,攻毒后每天观察试验雏鸡状态,记录体重变化情况,并于攻毒后第3天每组随机选取3只雏鸡进行屠宰,取十二指肠、肺脏和气管组织并检测雏鸡不同组织病毒载量。【结果】鸡胚接种后,BLF+TS组雏鸡孵化率为100%,存活率为97.22%。与TS组相比,21~28日龄时BLF+TS组雏鸡的脾脏、法氏囊和胸腺指数以及血清中白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)含量均显著升高(P<0.05)。攻毒试验结果显示,攻毒后BLF+TS组雏鸡存活率为100%,攻毒后2~4 d BLF+TS组雏鸡体重增长速度显著低于健康对照组(P<0.05);攻毒后3~7 d时BLF+TS雏鸡体重增长速度显著高于TS组(P<0.05)。BLF+TS组雏鸡攻毒后呼吸道和消化道组织的病毒载量显著低于TS组(P<0.05)。【结论】BLF作为免疫佐剂可安全进行鸡胚接种,而且能够帮助雏鸡建立早期免疫保护,进一步提高ND疫苗免疫效果,研究结果为开发高效鸡胚免疫疫苗佐剂提供借鉴和参考。

坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立与应用

为了大量表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并建立一种可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法,试验首先将去除跨膜域的截短坦布苏病毒E基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;然后以重组蛋白为包被抗原、鸭待测血清为一抗、HRP标记兔抗鸭IgG为二抗,通过反应条件[抗原包被质量浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、一抗(待测血清样品)稀释液、一抗(待测血清样品)稀释度、一抗(待测血清样品)孵育条件、二抗稀释度、二抗孵育条件和显色条件]的优化和临界值的确定建立间接ELISA方法;最后进行特异性、敏感性和重复性试验,并通过临床样品检测比较该方法与Western-blot方法的符合性。结果表明:PCR扩增得到大小为1227 bp的坦布苏病毒截短E基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-E-tr。诱导后的重组蛋白分子量大小为49 ku并以包涵体的形式表达,纯化后的重组蛋白条带单一,可与鸭源坦布苏病毒阳性血清发生特异性结合。建立的ELISA方法优化后的抗原包被质量浓度为5μg/mL,抗原包被条件为4℃过夜,封闭液为2%BSA,封闭时间为60 min,一抗(待测血清样品)稀释液为1%BSA,一抗(待测血清样品)稀释度为1∶800,一抗(待测血清样品)孵育条件为37℃、30 min,二抗稀释度为1∶7500,二抗孵育条件为37℃、90 min,显色条件为37℃、10 min,阴阳临界值为0.368;仅可检测出鸭源坦布苏病毒阳性血清,无法检测出鸭源鸭疫里默氏杆菌、新城疫病毒、禽腺病毒、禽流感病毒、细小病毒阳性血清;待测血清最高稀释度为1∶3200(Western-blot方法待测血清最高稀释度仅为1∶1600);批次内重复变异系数(CV)为1.7%~4.7%,批次间重复CV为1.4%~5.7%;对137份临床鸭血清样品进行检测,阳性率为81.7%,与Western-blot方法比较样品阳性率较高,两种方法的符合率为87.6%。说明成功表达了坦布苏病毒截短E蛋白,并建立了一种特异性良好、敏感性较高、重复性较好的可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。

湖北省2个规模化蛋鸡养殖场环境细菌监测分析

为了解蛋鸡养殖场环境中病原菌流行情况,试验采集湖北省不同地区2个规模化蛋鸡养殖场不同位置的空气、水线和饲料样品进行病原菌检测,并采用16S rDNA测序分析样品中的优势病原菌。结果显示:饲料样品中细菌总数符合《GB 13078—2017饲料卫生标准》,而鸡舍风机附近空气及水线中细菌总数均较高;空气中优势病原菌是芽孢杆菌和葡萄球菌,饲料和水线优势菌为芽孢杆菌。结果表明,规模化蛋鸡养殖场饲料中的芽孢杆菌易污染水线和空气,风机附近是细菌污染重点区域,应定期消毒。

鸡滑液囊支原体的分离鉴定及药敏试验

为弄清湖北省某蛋鸡场180日龄鸡群出现呼吸道症状和产蛋率下降的病原,采集病料进行病原的分离鉴定与药敏试验,用形态学观察方法和分子生物学方法对分离株进行了形态学观察和16S rRNA基因鉴定,并用鸡胚感染试验对分离株进行致病性试验。结果显示,病原分离鉴定结果仅滑液囊支原体阳性,镜检观察到典型的“煎蛋样”菌落;16S rRNA序列与已报道的滑液囊支原体的具有高度同源性;鸡胚感染试验显示,分离株导致鸡胚发育迟缓,胚体弱小,从弱小胚体内可再次分离出滑液囊支原体;药敏试验结果显示滑液囊支原体分离株对泰妙菌素、四环素和盐酸克林霉素敏感。结果表明,从产蛋下降的鸡群中成功分离到1株滑液囊支原体,为临床该病的防治提供了科学依据。

一株鸭疫里氏杆菌的分离、鉴定与生物学特性分析

为确定引起2022年湖北省襄阳市某规模化鸭场的鸭急性死亡病因,对病料进行病原菌分离、对分离株进行生化特性鉴定、耐药性测定、动物回归试验及全基因组测序。结果表明,急性死亡的鸭病原菌仅有鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer)分离鉴定为阳性。药敏结果显示分离菌株对药物敏感性较高,仅对环丙沙星、氧氟沙星耐药;动物回归试验结果显示分离菌株可引起雏鸭急性死亡,剖检可见典型的浆膜炎症状。组织病理学切片显示心脏、肝脏被膜有明显纤维性渗出,心肌细胞有炎性浸润、脾脏实质内可见淋巴细胞数量明显减少、脑组织可见较多的血管淤血扩张。毒力测定显示分离菌株的半数致死量为3.06×106CFU/mL。

一株A型副鸡禽杆菌的分离与鉴定

对湖北省某规模化养鸡场中肿头肿脸病料进行病原菌分离,对分离菌株进行分子生物学、生化特性、血清型和耐药性鉴定,并测定了分离菌株基因组序列,通过动物回归试验验证菌株致病性。结果表明,从病料中分离出白色圆形、边缘光滑、半透明露珠样的菌落,革兰氏染色为阴性短杆菌,卫星试验中呈典型的“卫星”现象,分离菌株的16S rRNA与已报道的副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)高度同源,血清型鉴定为A型;药敏试验结果显示分离株对甲氧苄胺嘧啶、林可霉素和阿米卡星耐药,对强力霉素、大观霉素等多种抗生素敏感;动物回归试验显示,分离菌株引起雏鸡典型的肿头肿脸症状,病理切片显示菌株造成雏鸡的肺脏、肝脏以及脾脏出现明显的病变。分离株二代全基因组测序结果显示分离株有53个耐药基因和121个毒力基因。

鸡白痢检测方法研究进展

鸡白痢是由鸡白痢沙门菌(Salmonella Pullorum)感染导致的传染性疾病。种鸡鸡白痢净化是防控该病最主要的措施。通过对传统病原学、分子生物学及免疫学三类检测方法进行概述和比较,指出各种方法的优势及不足,创造性地提出了将不同方法进行联合应用的思路,旨在为建立准确、快速的检测方法,优化净化程序及养殖业持续健康发展提供帮助。

2009年湖北省禽白血病的流行特点

禽白血病（Avian Leukosis，AL）是由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒（Avian Leukosi Svirus，ALV）引起的以禽类造血组织中某些细胞成分增生为主的各种可传染的肿瘤疾病、免疫抑制病。根据病毒中和试验宿主范围和囊膜糖蛋白的特性，禽白血病／肉瘤群病毒划分为A-J10个亚群，

鸡白色念珠菌的分离鉴定及其防治措施

[目的]寻找鸡白色念珠菌的有效防治措施。[方法]近10年来,从湖北省100多个蛋鸡场收集鸡白色念珠菌病料,对病料进行白色念珠菌的分离和鉴定,探讨该病的初步诊断方法和防治措施。[结果]从832份鸡病料中分离到86株白色念珠菌。从2只鸡的嗉囊炎症部位涂片镜检结果发现,有卵形生芽的或不生芽的酵母状细胞和假菌丝。该病的诊断应以流行病学、症状及病理变化等资料为依据,并结合病原学检查。[结论]可通过向健康鸡群定期投喂"真菌通治"等生物制剂,也可在饲料中添加5.00%大蒜、维生素和0.05%龙胆紫水,改善鸡舍环境条件等措施来预防鸡白色念珠菌。发病鸡则应立即隔离消毒,喂服制霉菌素。

限铁培养禽巴氏杆菌制备灭活疫苗及其免疫效果分析

为控制禽多杀性巴氏杆菌病的流行,通过对禽巴氏杆菌标准菌种A群NCTC1502进行限铁培养,制备稳定性和安全性较好的甲醛油乳剂灭活疫苗,免疫江汉鸡,监测其抗体消长规律和免疫效力。结果:禽巴氏杆菌限铁培养制备的灭活疫苗稳定性和安全性好,对江汉鸡可产生高效的免疫保护力,免疫保护率达100%,显著高于非限铁培养制备的灭活疫苗(80%)。试验表明利用禽巴氏杆菌标准菌种进行限铁培养所制备的疫苗可有效防控禽霍乱。

中国鸽病的流行及防控现状

对危害养鸽业的主要疫病的流行及防控现状进行了综述,重点对鸽新城疫、鸽流感、鸽痘、鸽沙门氏杆菌病、鸽大肠杆菌病、鸽毛滴虫病、鸽念珠菌病的流行特点、防控措施进行了阐述,为深入研究鸽病的防控提供思路和参考。

蛋鸭网状内皮增生症病毒的分离与鉴定

2009-2010年我国江苏、安徽、广西、湖北等地蛋鸭出现产蛋急剧下降，剖检卵泡严重出血等症状，经中国农业大学张大丙等人诊断为出血性卵巢炎。2011年湖北某地的两个鸭场蛋鸭产蛋由高峰91％陡然下降至40％，剖检症状与2009和2010年发病鸭很类似，经实验室诊断为出血性卵巢炎（黄病毒感染）并采取积极防控措施，鸭群逐渐康复，产蛋章恢复至80％以上，

2009年湖北省鸡J亚群白血病的初步调查分析

禽白血病（avian leukosis，AL）是由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒（avian leukosis virus，ALV）引起的以禽类造血组织中某些细胞成分增生为主的各种可传染的肿瘤疾病。根据病毒中和试验宿主范围和囊膜糖蛋白的特性及其它一系列标准，将禽白血病／肉瘤群病毒划分为A到J10个亚群，

规模化肉鸡场疾病防治用药及其检测方法综述

针对当前"速成鸡"事件对规模化养殖鸡行业形成较大的负面影响,对肉鸡出栏时间、疫病防治用药及其残留物检测方法进行综述,客观总结兽药使用对鸡肉品质和安全的影响,旨在为肉鸡生产、检测部门及公众提供参考。

新城疫V4耐热弱毒株的研究进展

新城疫是一种严重威胁禽类健康的烈性传染病。本文对鸡新城疫病毒V4耐热弱毒株的分离培育、免疫原性、耐热性、安全性及其相关机制的国内外研究进展进行了综述,以期对新城疫的综合防控研究提供参考。