猪场环境源大肠杆菌的耐药性调查及携带mcr-1和tet(X4)菌株的传播特征

养殖场中抗菌药的长期使用促使耐药菌株快速出现和传播,并可以通过粪肥和污水向环境排放,给公共卫生带来巨大威胁。为了调查猪场环境源大肠杆菌的耐药情况,评估耐药基因的传播风险,本试验采集163份猪场粪便、污水和土壤样本,通过平板划线分离培养法分离大肠杆菌,通过药敏试验检测分离菌株对14种抗菌药物的耐药情况,聚合酶链式反应(PCR)检测临床重要耐药基因,脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测菌株间的亲缘关系,接合试验和质粒复制子分型检测接合子的质粒类型。结果显示,共分离获得150株大肠杆菌,其中粪便源大肠杆菌耐药情况最严重,污水源大肠杆菌次之,土壤源大肠杆菌最低;污水源大肠杆菌耐药基因检出种类最多,粪便源大肠杆菌次之,土壤源大肠杆菌最少。10株携带黏菌素耐药基因mcr-1大肠杆菌和18株携带替加环素耐药基因tet(X4)大肠杆菌分离自粪便和污水样本,且多重耐药情况较为严重。10株携带mcr-1大肠杆菌经PFGE分为9种脉冲场图谱,其中9株与大肠杆菌C600接合成功,接合子中有IncFIA、IncW、IncFIB、IncI2和IncP五种质粒类型;18株携带tet(X4)大肠杆菌经PFGE分为15种脉冲场图谱,其中16株与大肠杆菌C600接合成功,接合子中有IncFIB、IncFrepB和IncHI1三种质粒类型。结果表明,必需持续监测猪场环境中的临床重要耐药基因,特别需要关注mcr-1和tet(X4)基因的流行情况,并且在养殖中合理使用黏菌素和四环素类抗生素。

鸡源大肠杆菌生物被膜形成与耐药性、毒力基因的关联性分析

旨在了解鸡源大肠杆菌临床分离株生物被膜形成能力与耐药性、毒力基因之间的关系。通过刚果红试验、结晶紫染色法测定生物被膜形成能力;采用微量肉汤稀释法检测分离株对阿莫西林、氟苯尼考、庆大霉素等8种抗菌药的耐药性;PCR检测常见耐药、毒力基因携带情况;采用实时荧光定量PCR检测毒力基因在生物被膜阳性菌中的表达量。结果表明,在51株分离株中,生物被膜阳性菌株比例为19.61%,阳性菌株中,OD_(600)最大值为2.233±0.702,最小值为0.374±0.099,其他介于1.455~1.604之间;耐药性检测显示,生物被膜阳性菌株对头孢喹肟、氟苯尼考、庆大霉素、阿米卡星、黏菌素的耐药率均高于阴性菌株,其中对阿米卡星和黏菌素差异显著(P<0.05),但对多西环素耐药率低于阴性菌株,差异显著(P<0.05),二者对阿莫西林+克拉维酸、恩诺沙星耐药率无差异;OD_(600)值最大的E13对8种测定药物全部耐药,6株OD_(600)值介于1.455~1.604的菌株对5种及以上抗菌药产生耐药性,OD_(600)值为0.374的菌株E39为敏感菌株。PCR结果显示耐药基因bla_(CTX-M-9)、bla_(CTX-M-U)、bla_(OXA-1)、mcr-1、rmtB、floR在生物被膜阳性菌株中的检出率高于阴性菌株,菌株E13同时携带9种耐药基因;共检出16种毒力基因,其中fimH、astA、aggR、irp1、iucD、fyuA、ybtA、ompA在生物被膜阳性菌株中的检出率高于阴性菌株,且阳性菌株毒力基因型复杂;以OD_(600)值为0.374的E39菌株为对照,OD_(600)值较大的生物被膜阳性菌株中,fimH、ompA、ompA、iucD、hlyF毒力基因表达呈现上调趋势。综上,与生物被膜阴性菌株相比,大肠杆菌生物被膜阳性菌株耐药更为严重,携带毒力基因型更加复杂多样,且毒力基因表达呈现上调趋势。

阿米卡星诱导对大肠埃希氏菌耐药性及生物被膜和外排泵活性的影响

为研究亚抑菌浓度阿米卡星诱导对大肠埃希氏菌敏感菌株耐药性、生物被膜形成能力及外排泵活性的影响,采用微量肉汤稀释法测定阿米卡星对6株菌株的最小抑菌浓度(MIC),并以0.5 MIC作为初始诱导浓度进行诱导,每隔5 d重新测定阿米卡星MIC,并调整诱导浓度,共计30 d,最后将诱导第30天菌株进行无药物压力稳定培养5 d,保存各诱导菌株及无药传代菌株共计210株,测定各诱导菌株药物敏感性、生物被膜形成能力及部分菌株外排泵活性变化。结果发现,随着诱导天数的增加,阿米卡星对6株分离菌株MIC逐渐升高,诱导菌株耐药性不断增强,其对诱导第30天菌株的MIC值为诱导前的8~32倍;经过5 d无药培养后,MIC测定结果与第30天基本保持一致;诱导后的菌株中,强成膜能力菌株占总数的5%,中成膜能力菌株为56.7%;以每5 d的生物被膜形成量平均值与原菌相比,结果发现,所有诱导菌株生物被膜形成量均显著增加(P<0.01),表明亚抑菌浓度阿米卡星诱导可促进大肠埃希氏菌生物被膜的形成;无药稳定培养5 d的菌株与诱导第30天菌株相比,生物被膜形成能力基本保持不变。荧光探针测定外排泵结果显示,诱导菌株外排泵活性显著受到抑制。以上研究结果表明,阿米卡星诱导促进菌株生物被膜的形成,抑制外排泵活性,使菌株的耐药性增强,研究结果可为氨基糖苷类药物用药提供理论依据。

碘醚柳胺增强黏菌素对肺炎克雷伯菌抗菌活性机制的转录组学分析

为了了解碘醚柳胺(rafoxanide,RAF)增强黏菌素(colistin,COL)对肺炎克雷伯菌抗菌活性的分子机制,试验采用微量肉汤稀释法初步判断RAF和COL单独或联合后对肺炎克雷伯菌KP1的最小抑菌浓度(MIC)及两药联合的部分抑菌浓度(FIC)指数,然后应用转录组学方法对RAF和COL联合作用4 h后的耐药基因聚类热图、差异表达基因火山图、KEGG通路富集、KEGG功能注释及小分子代谢和转运的差异表达基因进行分析。结果表明:COL对KP1的MIC为128μg/mL,与RAF联用后MIC降低至0.25μg/mL。RAF和COL具有协同作用,FIC指数为0.007 8~0.008 8。与单药COL比较,两药联合后耐药基因bla_(CTX-M)、bla_(SHV)、aac(3)-Ⅱd、aph3-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰb、gyrA、gyrB和parC的表达量均下降;共下调了2 017个差异表达基因;下调基因中富集程度和基因数目较为显著的通路有氨酰基-tRNA合成、卟啉与叶绿素代谢、脂多糖生物合成、氧化磷酸化和核糖体;显著富集的通路主要有碳水化合物代谢、辅助因子和维生素代谢、膜转运、氨基酸代谢、能量代谢和信号转导;甘油代谢、核糖体转运、氧化磷酸化、三羧酸循环和抗氧化等与小分子代谢和转运有关的差异表达基因下调。说明RAF可能通过影响肺炎克雷伯菌的代谢和相关小分子的转运功能来增强COL的抗菌活性。

猪鸡致病菌β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测与药敏试验

对分离的猪鸡致病菌,分别进行了?-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测,并用试管二倍稀释法测定了β-内酰胺环类抗生素或β-内酰胺环类抗生素与抑制剂舒巴坦联用对非产酶菌、产?-内酰胺酶菌、产ESBLs菌的抗菌活性.结果表明,43株分离菌的大多数可产生?-内酰胺酶,3株鸡志贺氏菌为ESBLs阳性菌株.30株分离产酶菌均对阿莫西林、氨苄西林耐药(MIC≥32 μg/ml),16株非产酶菌(标准菌株及分离株)中的15株对阿莫西林、氨苄西林敏感,只有一株非产酶分离菌耐药.氨苄西林与舒巴坦以2∶1、4∶1配比联用时,其对分离产酶菌的MIC值分别降低10~40倍、10~20倍.临床致病菌对三代头孢均敏感,与舒巴坦以2∶1、4∶1配比联用时,三代头孢的MIC值不变.当头孢噻呋、头孢曲松与舒巴坦以2∶1配比联用时,其对产ESBLs菌的MIC值降低2～4倍.

氟苯尼考及其与多西环素联合的体外抗菌作用

对氟苯尼考 (Florfenicol)及其与多西环素 (Doxycycline)联合的体外抗菌活性、杀菌动力学曲线和抗菌后效应(PAE)作了研究。结果表明 :氟苯尼考对鸡大肠杆菌等 9种标准菌株最小抑菌浓度 (MIC)为 0 .2～ 1.6 mg/L ,与氯霉素相似或略低 ,比甲砜霉素低 1/2～ 1/80 ;对耐氯霉素、甲砜霉素的鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和猪大肠杆菌临床分离株仍有较强抗菌作用 ;对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌动力学曲线与甲砜霉素相似 ,表现为低浓度抑菌 (小于 4 MIC值 )、高浓度缓慢杀菌 ;对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 PAE显著长于甲砜霉素 (P<0 .0 5 ) ,呈浓度依赖性 ,对鸡大肠杆菌的 PAE(1.4 5～ 2 .0 7h)显著长于对金黄色葡萄球菌 (0 .4 8～ 1.18h)。棋盘法测得氟苯尼考与多西环素联合对鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、猪链球菌和金黄色葡萄球菌均为无关作用 ,对前 3种菌的部分抑菌浓度(FIC)指数值为 1.5 ,联合时的氟苯尼考 MIC值比其单独时减小了 1/2。氟苯尼考以 1∶ 2与多西环素联合时 ,对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌速率与氟苯尼考单药相比均有所增加 ,当浓度大于或等于 4 MIC时呈现出协同作用 ;对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 PAE与单药 PAE的较大值相近 ,与相应浓度的单药相比均表现为无关作用。

β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦与氨苄西林联用的体内外抗菌作用研究

试验观察了β 内酰胺酶抑制剂舒巴坦与氨苄西林联用的体内外协同抗菌作用。结果表明 :氨苄西林与舒巴坦联用对 5个标准菌株的抗菌活性与氨苄西林相似 ,对除绿脓杆菌外的 6株临床分离菌株的体外抗菌活性较显著高于氨苄西林。临床分离菌株均可产生 β 内酰胺酶并可不同程度的水解氨苄西林 ,在不加入舒巴坦时 ,β 内酰胺酶对氨苄西林的水解率为 5 7 6 4%～ 10 0 % ,加入舒巴坦时 ,β 内酰胺酶对氨苄西林的水解率降低。舒巴坦对临床分离菌株产生的 5种 β 内酰胺酶均有抑制作用 ,在 1μg/ml时的抑制率为 9 35 %～ 6 7 2 0 % ,10 μg/ml时为 5 0 %～93 19% ,显示出明显的抑酶保护作用。氨苄西林与舒巴坦联用对氨苄西林耐药菌株引起的鸡白痢有明显的治疗效果 ,按 5mg/kg肌注的治愈率为 91 18% ,显著高于氨苄西林混饮 ,与舒他西林相似。提示二者联用体内体外均有协同抗菌作用 ,值得进一步研究。

鸡志贺氏菌产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的分子进化

【目的】检测鸡志贺氏菌分离株和诱导株所产ESBLs的基因型,探讨其产酶耐药的分子进化机制。【方法】对1株诱导和5株临床分离产ESBLs细菌分别用TEM、SHV、CTX-M3种通用引物进行PCR扩增、基因克隆及测序分析,确定鸡福氏志贺氏菌ESBLs的基因型和基因亚型。【结果】5株临床福氏志贺氏菌质粒上具有相同的TEM序列和相同的SHV序列,TEM型序列与AY903309(TEM-116)序列相比发生了2个位点基因突变即G157A、C409T,其中409位点碱基突变为沉默突变,157位点碱基突变导致相应氨基酸序列53位发生突变Gly53Ser,此氨基酸突变为新的突变位点,所以该TEM型ESBLs是一种新的TEM亚型,暂命名为TEM-1V型;SHV型与AY826418(SHV-12)序列完全相同,为SHV-12型。头孢噻呋诱导标准福氏志贺氏菌,诱导10代时产生了TEM-1型β-内酰胺酶,诱导50代时产生了TEM-1V型ESBLs。【结论】临床分离鸡福氏志贺氏菌ESBLs的基因型为TEM-1V型和SHV-12型,鸡福氏志贺氏菌TEM-1V型ESBLs是由TEM-1型β内酰胺酶直接进化而来。

达氟沙星对试验性感染仔猪副伤寒和霉形体肺炎的药效学研究

研究了国产新兽药达氟沙星对人工感染仔猪副伤寒和霉形体肺炎的疗效。每个疗效试验用仔猪 10 5只 ,随机分为达氟沙星 3个不同剂量组、恩诺沙星对照组、强力霉素对照组、阳性对照组和阴性对照组 ,每组动物15只。当感染猪出现典型症状时 ,达氟沙星 3个剂量组分别按每千克体重 2 .5mg、1.2 5mg、0 .6 2 5mg及恩诺沙星组按 2 .5mg肌肉注射 ,每日 2次 ,强力霉素按每千克体重 3mg肌肉注射 ,每日 1次。结果表明 :达氟沙星 3个不同剂量组、恩诺沙星组、强力霉素组连续用药 4d ,对仔猪副伤寒的治愈率分别是 10 0 %、80 %、33 .3%、80 %、5 3 .3% ,而感染 (阳性 )对照组的死亡率为 6 6 .7% ;达氟沙星 3个不同剂量组、恩诺沙星组、强力霉素组连续用药5d ,对霉形体肺炎的治愈率分别是 10 0 %、80 %、46 .7%、93 .3%、6 0 % ,肺部病变率分别是 2 0 %、40 %、6 0 %、2 0 %、6 0 % ,而感染 (阳性 )对照组的死亡率为 40 % ,肺部病变率为 10 0 %。

恩诺沙星及其活性代谢物在鸡体内的药物动力学

为全面了解恩诺沙星在鸡体内的动力学过程与药效的关系进行了本研究。用反向高效液相色谱法测定鸡血浆中的药物质量浓度，所得恩诺沙星ｃｉ－ｔｉ数据用ＭＣＰＫＰ计算机程序处理，代谢物环丙沙星的ｃｉ－ｔｉ数据用代谢物动力学方法处理。静注恩诺沙星后的ｃｉ－ｔｉ数据符合二室开放模型，主要动力学参数：ｔ１／２α（０．２５±０．０４）ｈ，ｔ１／２β（５．２６±０．８１）ｈ，Ｖｄ（４．５３±１．０７）Ｌ／ｋｇ，ＣＬＢ（０．６１±０．１１）Ｌ／（ｋｇ·ｈ），ＡＵＣ（１７．３９±３．９２）ｍｇ／（Ｌ·ｈ）。内服恩诺沙星的ｃｉ－ｔｉ数据，符合有吸收因素二室模型，主要动力学参数ｔ１／２ｋａ（０．４４±０．１１）ｈ，ｔ１／２α（１．１５±０．３８）ｈ，ｔ１／２β（９．１４±１．４５）ｈ，ＡＵＣ（１２．４８±２．３６）ｍｇ／（Ｌ·ｈ），ｔｍａｘ（１．７７±０．２１）ｈ，Ｃｍａｘ（１．４４±０．３１）ｍｇ／Ｌ，Ｆ７２．１８％。试验结果表明，鸡静注与内服恩诺沙星后，代谢物环丙沙星的生成及消除缓慢、分布广泛，是影响恩诺沙星疗效的重要因素。

左旋氧氟沙星的药效学研究

测定了左旋氧氟沙星对家禽致病菌的抗菌活性和抗菌后效应(PAE),观察了其对人工感染鸡葡萄球菌病的治疗效果。结果表明:左旋氧氟沙星有广谱抗菌作用,对家禽常见致病菌(革兰氏阳性、阴性菌)均有高度的抗菌活性。对鸡大肠杆菌O74等标准菌株的MIC介于0.05-0.20μg/ml之间,而对临床分离菌株的MIC介于0.20-0.80μg/ml之间。左旋氧氟沙星等氟喹诺酮类抗菌药物对革兰氏阳性、阴性菌均产生明显的PAE,并呈浓度依赖性。左旋氧氟沙星对人工感染鸡葡萄球菌病有良好的治疗效果,其分别按每升水25 mg、50 mg、100mg及氧氟沙星按每升水50 mg混饮4 d,治愈率分别为81.3％、90.6％、93.8％、68.8％,感染对照组的死亡率为59.4％。

加味黄连解毒丸对鸡人工感染大肠杆菌病的治疗效果

鸡大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的一种原发性或继发性传染病，可引起不同品种和不同日龄的鸡只感染发病，对养鸡业危害严重。因大肠杆菌的血清型很多，菌苗的免疫预防效果尚不理想，故药物防治仍是控制本病的主要手段。目前治疗大肠杆菌病的药物很多，但有些因长时间应用已...

鸡志贺菌产ESBLs的基因型鉴定

目的检测鸡志贺菌所产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型和基因亚型,分析其产酶耐药的分子机制。方法采用双纸片协同增效法对临床分离的鸡志贺菌进行了ESBLs检测,用试管二倍稀释法测定了其对常用抗菌药物的敏感性,并通过PCR扩增、基因克隆及测序分析,确定该菌所产ESBLs的基因亚型。结果鸡志贺菌为ESBLs产生菌,对三代头孢类药物严重耐药,具有多重耐药特性。该菌所产ESBLs的基因序列与U48775对比,同源性为99.2%,属于TEM型ESBLs;与同源性最高的AY903309(TEM-116)相比,同源性为99.8%,两处碱基发生变化,409位碱基T突变为C,没有引起氨基酸变化,为沉默突变,157位碱基A突变为G,引起53位丝氨酸变为甘氨酸且该突变是新的突变位点。结论该菌产ESBLs基因型为新的基因亚型,暂命名为TEM-1V,上传至GenBank获序列号DQ211973。

禽喘安对鸡霉形体与大肠杆菌合并感染的药效学研究

研究了中药散剂禽喘安对鸡霉形体与大肠杆菌合并感染的药效学。结果表明，禽喘安按０．７５％，０．５０％拌料连续５天，对鸡霉形体与大肠杆菌合并感染具有显著疗效，治愈率分别为９２．５０％，９０％；试验结束时，试验鸡只的抗体反应阳性率分别为２５％，５０％，气囊平均损伤记分分别为０．３３％，１．３３％。

沙拉沙星对鸡细菌病的药效学研究

用两倍试管稀释法测得沙拉沙星对鸡白痢沙门氏菌C79.13 、鸡大肠杆菌078 、鸡多杀巴氏杆菌C48_1 的最小抑菌浓度分别为0.078、0.039、0 .312μg/ml,明显优于对照药物诺氟沙星及氯霉素。沙拉沙星按高剂量(100mg·L-1 水)、中剂量(50mg·L-1水) 、低剂量(25mg-L-1水) 混饮,连用3 天,对人工感染鸡的3 种常见细菌病均可取得明显的疗效,3 个剂量组对鸡白痢的治愈率分别为100% 、100 % 、93.3% ;对鸡大肠杆菌病的治愈率分别为96.7% 、96.7% 、93.3% ;对鸡巴氏杆菌病的治愈率分别为96.7 % 、90% 、83.3% 。

恩诺沙星及其活性代谢物在传染性鼻炎鸡体的药动学

为建立鸡传染性鼻炎的药动学模型，研究了恩诺沙星及其活性代谢物在传染性鼻炎鸡体内的药动学特征。用反向高效液相色谱法测定血浆中的药物浓度，所得恩诺沙星的ｃｉ－ｔｉ数据用ＭＣＰＫＰ程序处理，代谢物环丙沙星的ｃｉ－ｔｉ数据用代谢物动力学方法处理。结果表明，鸡静注恩诺沙星后的ｃｉ－ｔｉ数据符合二室开放模型，其主要动力学参数如下：ｔ１／２α（０．２５±０．０４）ｈ、ｔ１／２β（５．４６±０．７１）ｈ、Ｖｄ（４．２１±１．０９）Ｌ／ｋｇ、ＣＬＢ（０．５４±０．１１）Ｌ／（ｋｇ·ｈ）、ＡＵＣ（１９．６８±３．５０）ｍｇ／（Ｌ·ｈ）。鸡内服恩诺沙星的ｃｉ－ｔｉ数据，符合有吸收因素二室模型，其主要动力学参数如下：ｔ１／２ｋａ（０．４４±０．１１）ｈ、ｔ１／２α（１．１７±０．４０）ｈ、ｔ１／２β（９．２４±２．０７）ｈ、ＡＵＣ（１２．２３±３．６８）ｍｇ／（Ｌ·ｈ）、ｔｍａｘ（１．５０±０．２９）ｈ、Ｃｍａｘ（１．３４±０．４４）ｍｇ／Ｌ、Ｆ６２．２６％。恩诺沙星在感染鸡体内的动力学特征是吸收迅速、分布广泛、消除缓慢；感染鸡静注与内服恩诺沙星后，代谢物环丙沙星的动力学特征是生成及消除缓慢、分布广泛。鸡传染性鼻炎可使恩诺沙星内服?

百球威克冲剂对人工感染鸡球虫病的防治效果试验

用中药百球威克对人工感染鸡球虫病的防治效果表明 :百球威克按 2～ 4 g/ l水混饮 ,有较高的抗球虫效果 ,抗球虫指数分别为 186 .8和 190 .