糖原合成酶激酶3β转基因细胞模型的建立

目的建立GSK3β(糖原合成酶激酶3β)转基因细胞模型。方法RT-PCR方法扩增GSK3β基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染PC12细胞;Western blot验证稳定株;染色质染色法和流式细胞术检测细胞凋亡;MTT法确定细胞接种条件。结果成功获得GSK3β融合载体;并建立GSK3β转基因细胞株;转基因组中GSK3β蛋白表达量明显高于对照组,染色质明显浓染甚至出现凋亡小体,去血清后该变化更加明显;GSK3β转基因组早期凋亡的细胞含量比对照组明显增多;确立了转基因细胞筛选化合物的接种条件。结论成功建立GSK3β转基因细胞模型。

α-Synuclein与MPP^+细胞毒性协同作用的研究

目的模拟与帕金森病发病密切相关的遗传因素与环境因素,研究α-synuclein与MPP+对细胞的毒性作用。方法RT-PCR方法扩增α-synuclein基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染;Western blot,MTT方法,双报告基因检测法和显微镜观察,研究过表达α-synuclein和MPP+对细胞存活率及NFκB信号通路的影响。结果MPP+和α-synuclein均能够显著抑制细胞存活率,二者共同作用时抑制作用更加明显;而且研究发现α-synuclein能够抑制由转录因子NFκB介导的基因表达,MPP+能够进一步增强其抑制作用。结论在遗传背景发生改变时,细胞对外界环境中的毒素更加敏感,提示帕金森病的发病存在某种遗传易患性。

α-synuclein促进凋亡的机制研究

目的：α-synuclein是一种功能未知的突触前膜蛋白，是多种神经退行性疾病胞浆中的纤维聚积体中的主要成份。虽然经过大量的研究，α-synuclein在这些疾病中发挥的作用仍未充分阐明，但是许多研究均报道过α-synuclein的过量表达对细胞具有一定的毒性，因此本研究的主要目的是研究α-synuclein对NF-xB信号途径所介导的细胞凋亡的调节作用。NF-xB是在细胞中广泛表达的转录因子，能够调节多种抗凋亡基因如BCl-2的表达，而GSK3β是与神经细胞凋亡紧密相关的多功能激酶，通过磷酸化包括NF-xB等各种转录因子的多种靶蛋白而调节细胞的凋亡。方法与结果：本研究通过分子克隆技术构建人源α-synuclein的载体并建立稳定过表达株，我们的研究发现：过表达α-synuclein的细胞稳定株细胞存活率与对照组相比显著性降低，而通过报告基因检测发现过表达的α-synuclein能够显著抑制NF-xB介导的基因的表达，并且这种抑制作用呈现剂量依赖性，随着α-synuclein转染量的增加而呈现更加明显的抑制作用；而通过Western Blot检测发现，过表达的α-synuclein能够促进GSK3β的表达，而抑制抗凋亡基因BCl-2的表达。结论：α-synuclein对细胞的毒性可能通过促进GSK3β的表达抑制NF-xB途径，由此通过抑制由NF-xB介导的抗凋亡基因BCl-2表达而发挥作用。

α-突触核蛋白影响BDNF表达机制的研究

目的：研究α-突触核蛋白对BDNF（brain--derivedneurotrophicfactor）表达的影响及作用机制。方法：利用分子克隆技术构建α-突触核蛋白真核表达载体并转染PC12，建立稳定高表达细胞株；MTT法检测细胞存活率；Westernblot法、ELISA法和Confocal检测的蛋白表达及蛋白磷酸化的改变；

星形胶质细胞在脑缺血中的变化和作用

星形胶质细胞作为中枢神经系统数量最多的细胞,它在脑缺血中发生增殖、肥大,特异性标记物胶原纤维酸性蛋白和波形蛋白表达明显增加。星形胶质细胞在缺血状态下具有较强的耐受力,可通过多种途径保护神经元。并且它也通过产生兴奋性氨基酸、炎症介质,降低缝隙连接等损伤神经元。因此,星形胶质细胞在脑缺血中起着损伤和保护脑组织的双重作用。明确星形胶质细胞在脑缺血中的作用及其机制,可能将为脑缺血的治疗提供新的靶点。

抑郁症的治疗研究进展

抑郁症以持续情绪低落和认知功能障碍为主要临床特征,包括焦躁情绪、快感缺失、睡眠障碍、负罪感和反复自杀念头等。抑郁症不仅给患者带来精神上的损失,也给患者造成沉重的经济负担。该文结合抑郁症相关假说:单胺假说、应激假说、神经营养因子和神经元新生假说等,根据不同的发病机制和作用通路,对抑郁症治疗进展进行综述和展望。

柴胡提取组分抗抑郁作用的研究

目的观察柴胡提取组分(CHB)的抗抑郁作用。方法采用小鼠强迫游泳、悬尾两种"行为绝望"抑郁动物模型和利血平拮抗模型,观察CHB对小鼠游泳不动时间、悬尾不动时间以及利血平诱导的体温降低、眼睑下垂、运动不能的影响。结果 CHB 100,200 mg/kg均能不同程度地缩短小鼠强迫游泳和悬尾不动时间,能拮抗高剂量利血平致小鼠体温下降,改善利血平诱导的小鼠眼睑下垂,并呈现一定的量效关系。结论 CHB具有一定的抗抑郁作用。

帕金森病模型大鼠中脑α-突触核蛋白增加

目的观察鱼藤酮对大鼠中脑α-突触核蛋白(α-SYN)的影响。方法SD大鼠长期低剂量皮下注射1.0mg·kg-1·d-1的鱼藤酮,建立帕金森病(PD)动物模型。采用旷场实验评价动物行为学改变,观察大鼠5min的活动情况。免疫荧光化学方法检测中脑部位TH阳性神经元数目的变化。免疫组织化学和Western blot方法检测中脑部位α-SYN的蛋白水平的改变。结果同对照组相比,鱼藤酮实验组动物5min的正中格停留时间明显延长(P<0.05),方格穿行次数明显减少(P<0.05),竖起时间和次数明显减少(P<0.01);中脑部位TH阳性神经元数目明显减少(P<0.05),α-SYN蛋白水平明显增加(P<0.05)。结论给予鱼藤酮能够使SD大鼠出现运动障碍,中脑部位TH阳性神经元数目减少,该现象可能与大鼠中脑部位α-SYN蛋白水平增加有关。

乳铁转运蛋白的研究进展

乳铁转运蛋白 (Lactoferrin ,LF)是一种具有抑菌、杀菌及抗病毒作用的蛋白 ,广泛存在于各种粘膜表面。乳铁蛋白除了具有抗菌活性以外 ,其他功能及其保健作用也引起多方关注。本文就近年来对LF的研究进展作一综述。

mTOR信号通路与神经退行性疾病研究进展

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamy-cin,mTOR)是进化上十分保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是自噬的关键调节位点。自噬体是神经退行性疾病内某些聚集蛋白清除的主要途径之一,近年的研究显示,神经退行性疾病如阿尔采末病、帕金森病、亨廷顿病等疾病模型或患者表现出mTOR通路异常,伴随着自噬功能的紊乱,而抑制mTOR的活性可以正向调节自噬。该文对当前mTOR信号转导通路与神经退行性疾病的研究进行综述。

细胞骨架与神经退行性疾病

神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一种以神经元退行性病变为基础的慢性进行性神经系统疾病,其病因十分复杂,其中线粒体功能障碍学说、氧化应激学说、蛋白质发生错误折叠聚集、炎症、免疫功能缺陷,基因突变等已经得到普遍认可。近年来的研究发现,细胞骨架在神经元变性过程中发挥了重要作用。细胞骨架是细胞质内蛋白质丝组成的纤维网架体系,其决定和维持着细胞的形态结构,同时参与细胞运动、分裂、胞浆运输等生命活动,对信号传导具有重要的意义。该文就其在神经退行性疾病方面的研究进行综述。

synapsinⅠ参与(-)黄皮酰胺增强齿状回突触传递功能

目的观察synapsin Ⅰ在（-）黄皮酰胺促进大鼠海马齿状回突触传递功能中的作用。方法用电生理方法观察（-）黄皮酰胺对基础突触传递功能的影响；采用Western blot方法及共聚焦显微镜检测了（-）黄皮酰胺对synapsin Ⅰ磷酸化的时间、浓度依赖关系，以及确定促进synapsin Ⅰ激活的上游蛋白激酶。结果在整体动物中，（-）黄皮酰胺可明显增加海马齿状回群峰电位，并且脑室给药5min即可促进海马synapsin Ⅰ磷酸化增强，15min时皮层synapsin Ⅰ磷酸化增强最明显。0．1、1、10mμol·L^-1（-）黄皮酰胺可浓度依赖性促进PC12细胞中synapsin Ⅰ激活，且10mμol·L^-1（-）黄皮酰胺在1～2min均可激活突触体和PCI2细胞中synapsin Ⅰ。PKA抑制剂H89可抑制（-）黄皮酰胺对synapsin Ⅰ的磷酸化。结论（-）黄皮酰胺通过PKA促进synapsin Ⅰ磷酸化而增强基础突触传递活动。

α-synuclein C端截短体的胞内分布

目的研究α-synuclein的4种C端截短体胞内的表达分布情况。方法PCR法获得α-synuclein的4个C端截短体基因片段,分别克隆入pEGFP-N1载体,并转染MN9D细胞、PC12细胞及SH-SY5Y细胞,于Confocal荧光显微镜下观察α-synuclein 4个C端截短体胞内的表达分布情况。结果α-synuclein的不同C端截短体胞内分布明显不一致,表现为随着C端部分的增长,α-synuclein截短体向核分布的趋势增强。结论α-synuclein的胞内定位与其C端密切相关,并且整个C端序列都可能在其核分布中发挥重要作用。

稳定表达α-Synuclein 4种选择性剪接异构体的PC12细胞对神经毒性剂MPP^+的敏感性研究

目的研究稳定表达α-synuclein 4种选择性剪接体的PC12细胞对神经毒性剂MPP+的敏感性。方法 PCR获得α-synuclein的4个选择性剪切体,克隆入pcDNA3.1载体,转染PC12细胞,经G418筛选获得稳定表达这4个剪切体的PC12细胞株,采用细胞毒的方法检测这4个稳定细胞株对神经毒性剂MPP+的敏感性。结果同全长相比,去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synuclein98对神经毒性剂MPP+的敏感性升高,表现为细胞活力的降低。结论去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synu-clein98对神经毒性剂MPP+的敏感性明显升高。抑制外显子5的选择性剪切,从而抑制选择性剪切异构体α-synucle-in114和α-synuclein98的产生可能是阻止神经元退行性丢失的一种策略。

鱼藤酮诱导大鼠帕金森样损伤及其机制的研究

目的本实验从行为学、病理和生化三个方面对鱼藤酮损伤大鼠模型进行了评价,并讨论了帕金森病相关的发病机制。方法通过脑立体定位的方法向单侧大鼠黑质致密部区域注射鱼藤酮,诱导大鼠帕金森样损伤;其行为学损伤采用转棒实验和阿扑吗啡诱导旋转实验评价;病理异常通过免疫组化的方法评价;生化改变通过Western blot方法检测。结果单侧黑质致密部注射鱼藤酮可诱导大鼠出现行为学障碍,导致大鼠在阿扑吗啡诱导实验中出现单侧旋转的现象;病理生化结果显示,鱼藤酮可以引起多巴胺能神经元丢失,α-突触核蛋白磷酸化,小胶质细胞激活,肿瘤坏死因子和环氧合酶-2蛋白含量增加。结论鱼藤酮可以损坏多巴胺能神经元,诱导α-突触核蛋白磷酸化,激活小胶质细胞,增加肿瘤坏死因子和环氧合酶-2的蛋白含量,进而促进帕金森病的发生发展。

α-synuclein过表达下调Nurr1转录活性的机制研究

目的研究α-synuclein过表达对多巴胺能神经元核受体相关因子-1(Nurr1)转录活性的影响及作用机制。方法 PC12细胞转染α-synuclein质粒后,采用双荧光素酶检测方法和Western blot方法分别检测Nurr1转录活性及蛋白水平变化情况。同时检测调控Nurr1转录活性的GSK3β/β-catenin通路中相关信号蛋白水平变化。结果与对照组相比,α-synuclein过表达可明显降低Nurr1转录活性,但对Nurr1蛋白水平无明显影响。通过检测GSK3β/β-catenin中相关信号蛋白发现,α-synuclein过表达可明显降低GSK3β(Ser9)磷酸化水平和β-catenin蛋白水平。结论α-synucle-in可能通过调控GSK3β/β-catenin通路下调Nurr1转录活性。

CaMKⅡα/β稳定表达的PC12细胞株的构建及其功能的初步研究

目的建立稳定表达CaMKⅡα/β的PC12稳定细胞株,以便进一步研究钙/钙调素依赖性蛋白激酶CaMKⅡα/β不同亚型的生理功能。方法通过脂质体介导的方法将构建的表达载体pEGFP-CaMKⅡα/β转染入PC12细胞中,然后用含G418抗生素的选择性培养基进行长期筛选,挑取耐药单克隆,培养并收集耐药的单克隆细胞;通过MTT法检测转染细胞在体外对PC12细胞增殖与活性的影响;Westernblot分析稳定表达的pEGFP-CaMKⅡα/β不同亚型对PC12细胞中相关突触囊泡蛋白表达的影响;并用高效液相色谱法(HPLC)检测过表达的CaMKⅡα/β对PC12细胞神经递质多巴胺DA释放的影响。结果 MTT细胞活性检测结果显示,转染重组质粒pEGFP-N1-CaMKⅡα/β的PC12细胞稳定株的生长活性与对照组相接近。应用Western blot方法对融合蛋白CaMKⅡα/β-GFP在PC12细胞内的表达进行鉴定,结果显示在PC12-CaMKⅡα/β组中,分子量82/89 ku处检测到该目的基因的大量表达,而在对照组的相应位置则没有任何条带,表明外源性目的基因已在细胞内过表达。West-ern blot方法检测突触囊泡蛋白结果显示CaMKⅡα/β不同亚型的过表达对囊泡蛋白的影响并无差异。HPLC检测结果显示过表达的CaMKⅡα/β对PC12细胞中DA的释放差异具有显著性。结论该实验获得稳定表达pEGFP-CaMKⅡα/β的PC12细胞株。初步探讨了该激酶的不同亚型对细胞功能的影响。

不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选方法比较

目的:建立一种可靠、快速、便捷、经济的乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)抑制剂的筛选方法,为新药发现阶段AChE抑制剂的筛选提供经济可靠的微量筛选方法,然后对植物提取物样品进行筛选。方法:分别采用电鳗AChE、人源红细胞AChE、大鼠海马区、纹状体匀浆液中的AChE为酶源。以96孔板为载体,利用优化的Ellman方法,在生理pH值和温度的条件下,以他克林和石杉碱甲作为阳性对照,检测对不同酶源AChE的抑制作用,确定最佳酶反应条件(最佳底物浓度、反应时间、显色剂浓度),并对植物提取物样品的AChE抑制作用进行检测。结果:采用上述四种酶源的AChE进行AChE抑制剂微量筛选方法操作简便快速、可靠经济。其中应用电鳗AChE进行筛选显示灵敏度较高,他克林和石杉碱甲对电鳗AChE的抑制作用相当,而对人源红细胞AChE、大鼠海马区、纹状体匀浆酶源的抑制作用,石杉碱甲明显优于他克林,所筛选植物提取物对AChE均没有抑制作用。结论:本实验中所建立的筛选方法操作简便、快速、可靠经济,可用于纯化合物的筛选。

鱼藤酮诱导α-synuclein聚集的分子机制--钙/GSK3b途径

散发性帕金森疾病（PD）的发生发展与环境因素有很大关系,而鱼藤酮作为广泛杀虫剂,使PD患病风险增加,常用于PD模型的构建,并在动物模型体内发现α-synuclein的聚集,然而其聚集的机制尚不明确.本实验用PC12细胞对鱼藤酮诱导的α-synuclein聚集进行评价.结果显示,鱼藤酮一方面可增加细胞内钙水平,诱导α-synuclein的聚集和磷酸化,另一方面破坏通过自噬途径,阻碍聚集的α-synuclein的降解;而细胞内钙水平降低,可抑制自噬过程并减少α-synuclein变化.此外,鱼藤酮可通过增加内钙浓度抑制AKT和GSK3b的磷酸化,钙的消除可逆转该现象.用锂盐抑制GSK3b活性,可促进自噬,减少α-synuclein的聚集和磷酸化;而GSK3b过表达则抑制自噬并增加α-synuclein蛋白水平以及诱导其磷酸化.综上,鱼藤酮诱导的α-synuclein聚集由钙/GSK3b信号通路介导.

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

【目的】构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础。【方法】设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoli.DH5(大肠杆菌),大量扩增重组质粒。试剂盒纯化重组质粒。用Lipofectamine TM2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达。【结果】pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Western blotting检测融合蛋白分子量为47kd,符合预期值。【结论】成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-synuclein。