抗梅毒螺旋体重组蛋白Tp0453单克隆抗体的制备及应用研究

目的利用基因重组抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0453的单克隆抗体(mAb),评价其在早期梅毒Tp抗原诊断中的应用。方法以重组蛋白Tp0453免疫BALB/c小鼠,将免疫后的小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,用间接ELISA和Western Blot检测杂交瘤细胞分泌的抗体,并对阳性细胞经亚克隆建株;体内诱生腹水法制备抗体,用硫酸铵沉淀法对mAb进行纯化并测定其亚类和效价;以自制的mAb建立间接免疫荧光法(IIF)检测梅毒患者分泌物标本,并与镀银染色的检测结果进行比较。结果获得4株稳定分泌抗重组蛋白Tp0453的杂交瘤细胞株,分别命名为15B2、8B9、9C6和2F8,其mAb效价分别为1∶25000、1∶8000、1∶50000、1∶10000;2F8杂交瘤细胞分泌的mAb为IgG2b,其他3株交瘤细胞分泌的mAb均为IgG1;4株mAb腹水经SDS-PAGE均显示出一条分子量约为50kDa的重链条带和一条分子量为26kDa的轻链条带;4株杂交瘤细胞染色体数在90～108范围内变化。IIF显示自制的mAb能与天然的Tp抗原结合,检测86例分泌物标本,IIF与镀银染色的符合率为95.3%。结论本实验成功获得了抗Tp0453重组蛋白的mAb,该mAb能识别天然的Tp0453抗原,有望应用于早期梅毒感染的抗原检测。

苍白密螺旋体苍白亚种单克隆抗体的制备及应用

苍白密螺旋体苍白亚种,俗称梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)是严重危害人类健康的性传播疾病——梅毒的病原体。由于Tp体外培养至今尚未成功,从而制约了Tp的基础研究。自从Tp单克隆抗体(TpMcAb)问世以后,已应用于Tp感染的临床诊断、抗原性质分析等方面的研究,其制备方法的完善和改进将对梅毒的诊断和防治提供新的方法。本文对Tp McAb的制备和应用作一综述,以展示近年来Tp McAb的最新研究进展。

实时荧光核酸恒温扩增技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染

目的评价实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT)检测沙眼衣原体(CT)核酸试剂盒(RNA恒温扩增)的敏感性和特异性。方法对229例临床疑似患者的尿样及拭子标本同时进行SAT检测和"金标准"沙眼衣原体细胞培养检测,检测结果有差异的标本采用PCR方法对拭子标本进行复测,根据实验结果评估SAT技术在尿样及拭子标本检测中的敏感性和特异性。结果结合细胞培养和PCR的实验结果作为"扩大金标准",得出SAT技术对临床拭子标本的检测敏感性为97.1%,特异性为100%;对尿样标本检测的敏感性为89.4%,特异性为99.2%。拭子和尿样标本检测结果的符合率为95.2%,经卡方检验,差异无显著性(χ2=3.27,P>0.05)。结论 SAT技术检测CT试剂盒对拭子及尿样标本敏感性及特异性均较好,适用于临床实验室对CT的检测。

尼古丁对SZ95人皮脂腺细胞增殖、凋亡及脂质合成的影响

目的观察尼古丁对永生化SZ95人皮脂腺细胞增殖、凋亡及脂质合成的影响,探讨吸烟与皮脂腺活性及痤疮发生的关系。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法结合显微镜观察不同浓度尼古丁作用24,48及72h后对SZ95细胞毒性及增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测尼古丁作用48h后对细胞凋亡的影响;尼罗河红荧光染色及油红光学染色法定量并定性观察尼古丁作用48h后SZ95细胞内中性脂质含量的变化。结果 MTT法及光学显微镜观察显示,尼古丁在1.0×10-2mol/L时对SZ95细胞有毒性效应,1.0×10-3mol/L及以下浓度对细胞增殖无明显影响。FCM示尼古丁作用48h后细胞凋亡比例较对照组呈剂量依赖性增加,以晚期凋亡增加为主,早期凋亡变化不明显。尼罗河红荧光染色结合油红光学染色法示:尼古丁在1.0×10-3mol/L及1.0×10-4mol/L时呈剂量依赖性,显著促进SZ95细胞内中性脂质合成(P<0.05)。结论尼古丁体外对SZ95细胞呈剂量依赖性诱导细胞凋亡,促进细胞脂质合成,提示香烟可能通过促进皮脂腺脂质分泌参与了皮脂腺相关疾病,如痤疮的发生。

肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的血清学诊断价值初探

目的克隆、表达肺炎嗜衣原体(Cpn)蛋白酶样活性因子(CPAF)的免疫优势区基因(CPAFm),初步评价其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX6p-2/CPAFm重组质粒,诱导表达重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定结果;将纯化蛋白免疫新西兰兔,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其免疫原性;与人抗Cpn抗血清反应分析其免疫反应性。间接ELISA法检测CpnIgG和沙眼衣原体(Ct)阳性血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为51.3×103的重组蛋白,蛋白质印迹法(Western blot)证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的新西兰兔体内,特异性IgG抗体的滴度为1∶16000以上,间接ELISA法检测40例CpnIgG参考血清,阴性和阳性结果的符合率均为100.0%(20/20);与微量免疫荧光法(MIF)对照,检测300例临床血清标本中的IgG抗体,符合率为98.3%;检测Ct阳性血清未见交叉反应。结论表达的Cpn CPAF免疫优势区重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。

中度与重度寻常痤疮患者非皮损区毛囊菌群分析:一项单中心横断面研究

目的·研究中度、重度寻常痤疮患者与健康者非皮损区毛囊菌群群落结构和载量的差异,探讨微生物与寻常痤疮及其严重程度之间的关系。方法·采用横断面研究,选取2022年8月—2023年8月在上海交通大学医学院附属仁济医院皮肤科就诊的中度、重度寻常痤疮(简称痤疮)患者和健康志愿者。取中度、重度痤疮患者及健康志愿者面部非皮损区毛囊内容物进行16S rRNA高通量测序以及实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测,分析不同严重程度痤疮患者毛囊细菌菌群多样性、物种组成差异和菌群载量差异。结果·纳入10例中度痤疮患者、11例重度痤疮患者及11例健康志愿者,3组间年龄、性别等一般资料差异均无统计学意义。中度痤疮组和重度痤疮组相对于健康组细菌α多样性均显著下降(P=0.020,P=0.013)。主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)图表明健康组人群样本分布较为集中,组内差异较小,而中度痤疮组及重度痤疮组人群样本分布有一定的趋势但较为离散,组内之间存在较大差异。3组样本趋势分布差异明显,组间微生物群落结构差异较大。相似性分析结果显示健康组与中度痤疮组(P=0.027)、健康组与重度痤疮组(P=0.017)组间β多样性有显著差异,物种组成相似度低。中度痤疮组与重度痤疮组(P=0.160)组间物种相似度较高。门水平上3组的优势菌群均为放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)以及拟杆菌门(Bacteroidetes)。属水平上健康组优势菌为丙酸杆菌属(Propionibacterium)、未分类的放线菌属(unclassified Actinomycetales),2组痤疮组优势菌均为葡萄球菌属(Staphylococcus)、丙酸杆菌属。相对于健康组,中度痤疮组和重度痤疮组非皮损区毛囊中的葡萄球菌属相对丰度均显著增加(P=0.010,P=0.019),毛囊菌群载量均显著增加(均P=0.001)。与中度痤疮组相比,重度痤疮组毛囊样本中细菌载量显著升高(P=0.017)。结论·中度、重度痤疮患者与健康者非皮损区毛囊微生物群落结构不同,痤疮组微生物多样性明显下降。中度痤疮组及重度痤疮组非皮损区毛囊中的葡萄球菌属相对丰度较健康组均显著增加。随着痤疮严重程度的增加,非皮损区毛囊内细菌载量显著增加。研究提示痤疮的发生以及严重程度可能与毛囊菌群的群落结构和载量有关。

5%阿莫罗芬甲涂剂治疗兔甲真菌病的疗效观察

目的建立甲真菌病动物模型,观察局部使用5%阿莫罗芬甲涂剂治疗模型甲的疗效。方法我们将须癣毛癣菌接种在新西兰白兔的后肢趾甲上,构建兔甲真菌病模型,感染成功后予组织病理学检查观察真菌在甲内的生长形态和方式,并外用5%阿莫罗芬甲涂剂治疗模型甲4周,用真菌学半定量培养评估其疗效。结果在免疫抑制的情况下,须癣毛癣菌感染新西兰白兔的甲真菌病模型构建成功,接种1周后趾甲近端即出现白色、淡黄色云雾状的改变,与人甲真菌病的临床改变相似。组织学可以看到有隔分支菌丝穿入甲板,到达甲床。接种后2、4、6周,模型甲总体感染率分别为52.78%、77.78%和83.33%。外用5%阿莫罗芬甲涂剂治疗2、4周时真菌学有效率分别是22.22%和66.67%。结论成功建立了甲真菌病的动物模型,并用此模型评估了外用抗真菌药的疗效,5%阿莫罗芬甲涂剂治疗兔甲真菌病4周的真菌学有效率为66.67%。

聚合酶链反应检测带状疱疹患者外周血和疱液中水痘-带状疱疹病毒

目的:分析聚合酶链反应(PCR)检测外周血在带状疱疹诊断中的临床意义。方法:收集30例初诊的带状疱疹患者的外周血和疱液标本,通过PCR的检测外周血细胞和疱液中带状疱疹病毒,并通过免疫荧光、免疫病理进行验证。结果:PCR检测结果显示,30例患者外周血和疱液中带状疱疹病毒的核酸检测均为阳性。结论:PCR能检测外周血中的水痘-带状疱疹病毒,可用于带状疱疹的实验室诊断。

抗肺炎衣原体蛋白酶样活性因子单克隆抗体在冠状动脉硬化患者肺炎衣原体感染诊断中的初步应用

目的制备抗肺炎衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的单克隆抗体,检测冠状动脉硬化患者的外周血单核细胞和冠状动脉瘤斑块中肺炎衣原体特异性抗原。方法以肺炎衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白免疫小鼠,与SP2/0细胞融合后,采用间接ELISA和Western blot筛选阳性杂交瘤细胞,经亚克隆建株;小鼠体内诱生腹水法制备单克隆抗体,用硫酸铵沉淀法对腹水中的单克隆抗体进行纯化,测定其亚类和效价;检测肺炎衣原体标准株以鉴定其特异性。建立间接ELISA方法检测冠状动脉硬化患者外周血单核细胞和冠状动脉瘤斑块标本中的肺炎衣原体抗原。结果获得4株稳定分泌抗蛋白酶样活性因子重组蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为3F8、7B9、8C4和11B5,其效价分别为1∶28000、1∶16000、1∶38000和1∶12000;经亚类鉴定,3F8和7B9杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG2b,其它2株均为IgG1。以制备的单克隆抗体建立间接ELISA检测肺炎衣原体抗原,与经典PCR方法的检测结果比较,检出率具有较高的一致性。结论成功获得了抗肺炎衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的特异性单克隆抗体,能特异地识别天然肺炎衣原体蛋白酶样活性因子抗原,有望应用于冠状动脉硬化患者肺炎衣原体感染的抗原诊断。

白细胞介素6体外对SZ95人皮脂腺细胞脂质合成的影响

目的研究白细胞介素(IL)-6体外对SZ95人皮脂腺细胞脂质合成的影响。方法CCK8法及尼罗河红染色法检测IL-6对细胞增殖和细胞脂质合成的影响,实时荧光聚合酶链反应(PCR)及蛋白印迹法检测IL-6对脂质合成相关基因(PPARG、SREBP1和FAS)表达的影响。结果10 ng/ml IL-6作用24 h和48 h后细胞活力百分率分别为120%和126%,10 ng/ml及1 ng/ml IL-6作用48 h后细胞中性脂质百分率分别为125%和116%,均显著高于对照组(P<0.05);伴随PPARG、SREBP1和FAS mRNA及蛋白表达上调。结论IL-6体外促进SZ95人皮脂腺细胞脂质合成,显示IL-6可能通过促进皮脂腺细胞脂质合成而参与寻常痤疮等相关疾病的发生。

药疹患者外周血淋巴细胞亚群的检测及其意义

目的分析药疹患者外周血淋巴细胞亚群的变化。方法将18例初诊药疹患者作为药疹组,根据致敏药物的不同将其分为头孢菌素组(n=9)、青霉素组(n=5)及中药组(n=4),将20例健康体检者作为对照组。应用流式细胞仪检测其外周血T淋巴细胞(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+)、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T淋巴细胞(NKT)所占百分比及其绝对计数。结果药疹组患者外周血T淋巴细胞(CD3+、CD3+CD4+)、B淋巴细胞和NKT细胞所占百分比与对照组的差异有统计学意义(P<0.05);药疹组患者CD3+CD8+淋巴细胞所占百分比与对照组的差异无统计学意义(P>0.05),而其T、B淋巴细胞亚群的绝对计数与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论药疹患者外周血CD3+、CD3+CD4+淋巴细胞所占百分比降低,NKT细胞所占百分比增高,这可能与患者免疫调节有关。

产后出血欣母沛治疗55例临床观察

目的探讨欣母沛对产后出血的治疗作用以及临床用药安全性。方法通过2008年1月～2011年1月55例产后出血的患者,在经过常规治疗无效后只用欣母沛,观察患者子宫收缩的情况。结果 55例患者中48例患者疗效显著,显效率为87.27%,4例有效,总有效率为94.55%。结论欣母沛能够增强子宫的收缩,对由于子宫收缩乏力引起的产后出血有理想的疗效,临床上建议进一步推广运用。

EBV转化带状疱疹患者外周血B淋巴母细胞系的建立

目的体外建立带状疱疹患者永生化的淋巴母细胞系(LCL)。方法用EB病毒感染带状疱疹患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG 2006免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A抑制T淋巴细胞的活性。利用流式细胞术分析LCL膜表面分子CD抗原,利用PCR技术检测淋巴母细胞中EBNA1基因。结果 20例患者PBMC经EBV感染制备淋巴母细胞,13例转化成永生化B细胞来源的LCL,成功率为65%。转化后的LCL膜表面表达CD19和CD45,并存在EB病毒基因EBNA-1基因序列。结论利用EBV感染带状疱疹患者B淋巴细胞形成的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,为体外研究水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染特异性细胞免疫和人源单克隆抗体制备打下基础。

带状疱疹患者淋巴母细胞在传代培养过程中染色体的稳定性分析

目的评价EB病毒转化的淋巴母细胞在传代培养过程中染色体的稳定性。方法采用EB病毒感染带状疱疹患者外周血中的B淋巴细胞,形成的淋巴母细胞(LCL)经过6个月的传代培养,通过核型分析比较淋巴母细胞染色体在培养前后是否存在差异。结果 4株染色体正常的LCL培养6个月后染色体无明显差异,1株染色体异常的LCL在传代培养过程中退化死亡,1株LCL培养6个月后染色体出现了亚二倍体和超二倍体。结论核型正常的LCL在传代培养过程中染色体具有较高的稳定性,选择核型正常的LCL有助于建立稳定的细胞系。

大疱性类天疱疮外周血淋巴细胞亚群分析

目的:分析大疱性类天疱疮(BP)患者外周血淋巴细胞亚群的变化。方法:应用流式细胞仪检测22例BP患者外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16+CD 56+和CD19+淋巴细胞亚群的百分比,并应用Flow Count荧光球进行绝对计数。结果:BP患者CD3+、CD3+CD8+百分率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);而BP患者CD3+CD4+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+百分率与对照组百分率比较差异无统计学意义(P>0.05)。BP患者中T细胞和B细胞绝对计数与对照组比较均降低。结论:患者T细胞亚群存在异常,CD8+T细胞百分比降低,CD4+/CD8+比率增高,T淋巴细胞亚群免疫应答反应出现失衡。

聚合酶链反应在真菌性水(脓)疱诊断难辨认癣中的应用

目的分析聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)在真菌性水(脓)疱诊断难辨认癣中的临床价值。方法纳入34例2020年7月—2021年10月就诊于我院(上海市皮肤病医院)门诊表现为水(脓)疱难辨认癣的患者,对34例患者的疱液标本进行PCR检测,并通过荧光染色镜检、真菌培养等进行对比。结果共收集34例患者的疱液标本,荧光染色镜检、真菌培养和PCR的敏感性分别为100%、77.8%和100%,特异性分别为87.5%、100%和75%,阳性预测值分别为90%、100%和81.8%,阴性预测值分别为100%、80%和100%,准确度分别为94.1%、88.2%和88.2%。疱液提取DNA、PCR扩增和测序比对在12 h内完成,鉴定出6种22例真菌(1例鉴定到属)。结论在真菌性水(脓)疱诊断难辨认癣中,PCR有较好的敏感性和准确度。PCR相较真菌镜检能判定真菌种类,相较真菌培养能缩短时间,能为难辨认癣的临床快速诊断与及时治疗提供参考价值。

Clascoterone对SZ95人皮脂腺细胞增殖、脂质合成和炎症因子表达的影响

目的:明确clascoterone对雄激素作用下人皮脂腺细胞增殖、脂质合成和炎症因子表达的影响,探索其抗痤疮机制。方法:体外培养SZ95人皮脂腺细胞,分为双氢睾酮(DHT)组、clascoterone组,clascoterone+DHT组,CCK8法检测细胞增殖,尼罗红染色检测细胞内中性脂质,蛋白免疫印迹检测脂质合成相关基因表达。酶联免疫吸附检测细胞培养上清液中炎症因子蛋白,RT-qPCR检测细胞因子转录水平。结果:与DHT组相比,clascoterone和DHT共培养24h后细胞数量出现显著下降(P<0.01);在亚油酸(LA)作用下,clascoterone+DHT组细胞内中性脂质低于DHT组(P<0.0001);此外,clascoterone+DHT组PPARγ、PLIN2、FASN、SCD1等脂质合成相关基因的表达、炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及相应蛋白水平低于DHT组(均P<0.05)。结论:clascoterone体外对人皮脂腺细胞增殖、脂质合成相关基因和炎症因子具有调节作用,可能是其抗痤疮治疗机制之一。

慢性光化性皮炎患者24例外周血淋巴细胞亚群及临床分析

目的分析慢性光化性皮炎(CAD)患者外周血淋巴细胞亚群的变化,探讨CAD的临床特点及诊疗方法。方法回顾性分析24例CAD患者的临床资料,根据患者既往系统用药史分为单独抗组胺药(n=7)、联合羟氯喹(n=2)、联合糖皮质激素(n=5)、联合羟氯喹及糖皮质激素治疗组(n=8)。应用流式细胞仪检测其外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK)所占百分比及T细胞的绝对计数。结果 24例患者外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值增高,其中单独抗组胺药治疗组及联合糖皮质激素治疗组中的差异有统计学意义;既往系统使用糖皮质激素治疗的CAD患者中各T淋巴细胞绝对计数低于对照组,而未使用糖皮质激素者数值无显著差异。CAD患者平均发病年龄66.2岁,中老年男性占95.8%。无明显诱发因素,日晒可诱发或加重皮损。皮损分布主要在暴露部位,急性发作期以外用糖皮质激素软膏,内服抗组胺药、羟氯喹为主,必要时加用系统性使用糖皮质激素及免疫抑制剂。结论患者CD4+/CD8+比值增高,T淋巴细胞表达失衡,免疫系统紊乱;CAD的发生与日光照射密切相关,避光是治疗的关键,外用和内服药物对治疗有效。

血清PCT和CRP对老年感染性疾病诊断价值的比较

目的 探讨血清降钙素原（PCT） 与C-反应蛋白（CRP）在老年住院患者感染性疾病中的诊断意义.方法使用VIDAS PCT Assay仪器 （法国梅里埃）定量测定125例老年住院患者和26例对照者的血清PCT水平,并采用激光散射速率法检测CRP水平,同时对患者进行病原学或血清免疫学检查明确感染类型.根据临床表现、实验室检查、病原学检测最终结果,将患者分为细菌感染组和病毒感染组,比较两组间血清PCT和CRP的检测结果.使用ROC曲线下面积评价PCT和CRP对于感染的诊断价值.结果 细菌感染组患者86例,以呼吸系统和泌尿系统感染为主,病毒感染组患者39例.细菌感染组患者的PCT水平（11.401±23.011 ng/ml）明显高于病毒感染组患者的PCT水平（2.544±8.804 ng/ml）,差异有统计学意义（t=2.324,P〈0.05）;细菌感染组患者的CRP水平（51.812±45.858 mg/L）明显高于病毒感染组患者的CRP水平（21.843±26.165 mg/L）,差异具有统计学意义（t=3.805,P〈0.01）.诊断价值方面,PCT和CRP的ROC曲线下面积分别为0.902和0.718（P〈0.05）.PCT〉0.365 ng/ml的诊断灵敏度为98.8%,特异度为73.8%;CRP〉10.20 mg/L的诊断灵敏度为82.6%,特异度为66.7%,说明PCT比CRP具有更高的诊断准确性.结论血清PCT在判断老年患者细菌感染方面,诊断价值优于CRP.