人CD226基因SNP和启动子序列分析

目的 研究人CD2 2 6 (PTA1)启动子及其 5’上游调控序列。方法 应用计算机软件预测启动子序列 ,并分析人CD2 2 6基因 5’上游调控序列以及通过RT -PCR的方法研究开放读框中的单核苷酸多态性。结果 CD2 2 6基因在 -375bp处和 - 130bp处可能有两个启动子 ,含有AP - 1、Ets- 1、Sp1、P30 0、PU .1、PEA3等转录因子结合序列 ,在编码胞浆区的序列中存在一个单核苷酸多态性位点。结论 CD2 2 6基因表达受到多种转录因子和 5’端上游调控序列的调控。

CD226基因5′上游调控序列研究

目的:研究CD226基因5′上游调控序列对CD226基因表达调控的影响。方法:通过基因克隆的方法将CD226基因5′上游调控序列,克隆到荧光素酶报告基因载体中(pGL3basic),用脂质体转染Jurkat细胞,48小时后检测荧光素酶活性。结果:CD226基因存在两个启动子P1和P2,分别位于与-843～-319bp和+1～+181bp,PMA可以上调P1的启动子活性,对P2有一定的抑制作用;A23187均可以上调两个启动子的活性,但对P2的作用更为明显。结论:CD226基因存在两个启动子,其活性受到PMA和A23187的调控,并呈与蛋白水平表达调控相类似的模式。

识别不同结构域的PTA1/CD226的mAb与活化血小板的关系

目的:研究识别不同PTA1/CD226分子结构域的mAb与刺激血小板活化的关系。方法:采用识别不同结构域的抗PTA1/CD226的mAb(FMU17),应用免疫荧光染色、流式细胞术和血小板凝集试验,研究识别不同结构域mAb对血小板的活化作用。结果:识别CD226第1个结构域的3株mAb(FMU1、2和3)可以与血小板结合,并可刺激血小板发生凝集,而识别CD226第2个结构域的mAbFMU6、FMU7以及识别两个结构域之间序列的FMU4和FMU5既不能与血小板表面天然的CD226分子结合,也不能刺激血小板活化。结论:抗PTA1/CD226mAb刺激血小板活化与抗体识别的结构域有关。

AP1对人CD226/PTA1启动子的调控作用

目的:确定血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)基因的转录起始点,及激活蛋白1(AP1)对PTA1启动子的调控作用.方法:采用5′RACE方法确定PTA1基因的转录起始点;将含AP1的真核表达载体和含有PTA1启动子的荧光素酶的报告基因载体共转染人肝癌细胞系HHCC,培养48h后检测其荧光素酶活性.结果:人PTA1基因的转录起始点定位于ATG上游229bp处,AP1可以显著地增强PTA1启动子P1和P2的活性,转录因子ets1对AP1上调P1和P2活性有不同的调控作用.结论:PTA1的转录起始点位于ATG上游229bp处,AP1可能参与调控PTA1的表达.

LAIR-1/LAIR-2(CD305/CD306)推定配体分布的研究

目的:研究LAIR-1(CD305)及LAIR-2(CD306)推定配体在多种细胞系上的分布,为鉴定LAIR-1/LAIR-2推定配体提供了实验依据。方法:建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系。以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色,用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达,并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点。结果:LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达,在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达。LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合,可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体(mAb)FMU-LAIR-2.2和FMU-LAIR-2.1阻断。结论:LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致,主要表达于WISH、C32、293T和ECV304细胞系。LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体。

CD226在TPO诱导胎肝Lin-细胞增殖分化过程中的表达

目的研究CD226在造血干/祖细胞上的表达分布。TPO诱导胎肝造血干/祖细胞增殖分化过程中，CD226表达的变化及可能的信号调控途径。方法采用鸡尾酒单抗阴性分离富集Lin－造血干/祖细胞，培养于含TPO的无血清培养体系中，用PD98059阻断MAPK信号转导途径，流式细胞仪双荧光分析CD226、CD34、CD41a和CD61的表达。结果CD226在Lin－CD34＋细胞和Lin－CD34－细胞上均有表达。TPO可诱导Lin－CD41a－CD226－细胞先分化为CD41a＋CD226－细胞，再进一步分化为CD41a＋CD226＋细胞，TPO也可诱导Lin－CD226＋细胞表达CD41a和CD61。在培养的早期，PD98059可抑制CD34＋CD226＋细胞的减少，在晚期则可抑制CD41a＋CD226＋细胞的增多。结论CD226与造血干/祖细胞和巨核细胞的增殖分化可能具有密切的关系。

人壳三糖酶基因在巴氏毕赤酵母中的真核表达和纯化

目的用巴斯德毕赤酵母系统表达人壳三糖酶,并进行亲和层析纯化,获得具有天然构象的人壳三糖酶。方法从pUC19-Chit融合载体中扩增编码人壳三糖酶基因,并将其克隆入真核表达载体pPIC9K,以电穿孔法转化酵母GS115。用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,几丁质亲和层析法对表达上清进行纯化,并进行SDS-PAGE分析。结果构建了人壳三糖酶融合真核表达载体pPIC9K-Chit。SDS-PAGE显示人壳三糖酶分子量约为50000Da,表达量约为24mg/L,纯度为97%。结论人壳三糖酶在毕赤酵母中的成功表达和具有天然构象的人壳三糖酶获得为进一步研究其抗真菌作用提供了物质基础。

人角蛋白17的序列分析及辅助性T细胞表位预测

目的 :本文对角蛋白 17的序列和辅助性T细胞抗原表位进行了分析预测 ,为一定遗传背景下T细胞介导的自身免疫紊乱引发银屑病这一观点提供了研究基础。方法 :以氨基酸组成、疏水性和亲水性分析以及氨基酸替换和二级结构分析的结果为参考 ,以HLADR限制性预测方法为主 ,进行K17的辅助性T细胞表位综合预测。结果 :与HLADR7相关的T细胞辅助性表位可能在 5～ 15肽段、15 0～ 190肽段、2 70～ 30 0肽段和 315～ 35 5肽段 ;与HLADR4相关的T细胞辅助性表位可能在 1～ 10肽段、5 0～ 70肽段、110～ 170肽段、2 70～ 35 0肽段和 4 0 0～ 4 2 0肽段。结论 :本研究为下一步人工合成多肽或表达相应肽段筛选银屑病反应性辅助性T细胞表位打下了一定的理论基础。

LAIR-1／LAIR-2（CD305／CD306）推定配体分布的研究

目的：研究LAIR-1（CD305）及LAIR-2（CD306）推定配体在多种细胞系上的分布，为鉴定LAIR-1／LAIR-2推定配体提供了实验依据．方法：建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系．以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色，用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达，并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点．结果：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达，在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达．LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合，可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体（mAb）FMU-LAIR-2．2和FMU-LAIR-2．1阻断．结论：LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致，主要表达于WISH、C32、293T和ECV304细胞系．LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体．