银杏内酯B对谷氨酸诱导脑皮质神经元凋亡及Ca^(2+)超载的影响

目的:观察银杏内酯B对谷氨酸诱导培养脑皮质神经元凋亡的拮抗作用,并探讨这种作用与神经细胞内游离Ca2 + 浓度改变的关系。方法:采用改良的方法原代培养胎小鼠脑皮质神经元,用噻唑兰(MTT)法检测神经元的存活情况;细胞凋亡采用形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳法和Hoechst332. 5 8核染色方法进行分析;用Fura - 2 /AM荧光指示剂法测定细胞内Ca2 + 浓度。结果:谷氨酸(0 .8mmol/L)能诱导神经细胞凋亡和胞内Ca2 + 超载,银杏内酯B(10 - 2 5 0 μmol/L)能减轻谷氨酸所致的细胞损伤,表现为神经元存活率提高,细胞形态的恢复和DNA断裂减少。结论:银杏内酯B可拮抗谷氨酸所致的神经细胞毒性作用,这可能与其能竞争PAF受体并降低神经细胞内[Ca2 + ]从而抑制谷氨酸诱导的神经元凋亡有关。

人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

【目的】 构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础?【方法】 以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5 mut1基因,将其克隆进表达载体pET-22b(+)中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b(+)/K5 mut1 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2+-His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定?【结果】 PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mut1基因片段,正确插入pET-22 b(+)载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量Mr≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L?【结论】 成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白?

银杏内酯B对H_2O_2诱导PC12细胞氧化损伤的影响

目的 :探讨银杏内酯B(ginkgolideB)对过氧化氢 (Hydrogenperoxide ,H2 O2 )引起PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法 :用噻唑兰 (MTT)检测PC12细胞的存活率 ;乳酸脱氢酶法检测PC12细胞损伤 ;用硫代巴比妥酸法测定细胞脂质过氧化物 ;同时检测细胞内抗氧化酶的活性。结果 :PC12细胞在 5 0～ 30 0 μmol LH2 O2 作用 3h后 ,细胞的死亡率及乳酸脱氢酶 (LDH)释放明显增加 ,抗氧化酶如超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase ,SOD)、谷胱甘肽过氧化酶 (glutathioneperoxidase ,GSH Px)活性显著降低 ,而脂质过氧化物生成增多。银杏内酯B 10～ 10 0 μmol L能显著降低细胞死亡率、LDH释放及丙二醛 (MDA)的生成 ,且能明显提高抗氧化酶的活性。结论 :银杏内酯B可拮抗H2 O2 引起的PC12细胞损伤 ,其机理可能与银杏内酯B减少脂质过氧化物的生成 。

纤溶酶原Kringle5的抑制血管增生作用

纤溶酶原Kringle 5是纤溶酶原中与血管抑素相连的另一个联环结构域 ,它能抑制内皮细胞的增殖、迁移 ,并能诱导内皮细胞凋亡和细胞周期停滞 ,具有很强的抑制血管生成活性 ,是抑制活性最强的纤溶酶原水解片段。同时它具有分子量小、性质稳定、毒副作用小、特异性高等优点 。

银杏内酯B对谷氨酸诱导大鼠大脑皮质神经元氧化损伤的影响

【目的】探讨银杏内酯B(ginkgolide B)对谷氨酸(glutamate)引起原代培养的脑皮质神经元氧化损伤的保护作用。【方法】采用改良的方法原代培养胎鼠脑皮质神经元,用噻唑蓝(MTT)及乳酸脱氢酶法分别检测神经元的存活率和损伤情况;用硫代巴比妥酸法测定细胞脂质过氧化的程度;并同时检测了细胞内抗氧化酶的活性。【结果】银杏内酯B(10～100μmol/L)能剂量依赖性地抑制谷氨酸(0.8 mmol/L)引起的细胞存活率下降和细胞损伤,同时提高细胞内抗氧化酶活性和减轻细胞脂质过氧化。【结论】银杏内酯B可拮抗谷氨酸所致的神经细胞毒性作用,这可能与其能提高神经细胞内抗氧化酶活性和清除氧自由基有关。

Lewis肺癌细胞趋化因子受体CXCR4表达的研究

目的:观察趋化因子受体CXCR4在Lewis肺癌细胞和肿瘤组织中的表达,为探讨CXCR4与肿瘤转移的关系提供研究基础。方法:体外培养Lewis肺癌细胞,并建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤模型与自发性转移模型,采用RT-PCR和蛋白质印迹法分析培养细胞和肿瘤组织中CXCR4 mRNA及蛋白质表达水平;应用免疫组化方法分析Lewis肺癌原发瘤和转移瘤中CXCR4表达,并通过迁移实验观察CXCR4特异性配体SDF-1α对Lewis肺癌细胞的趋化作用。结果:培养Lewis肺癌细胞及肿瘤组织中均功能性地表达趋化因子受体CXCR4,且其表达水平与细胞所处氧环境有关;低氧能够促使Lewis肺癌细胞CXCR4蛋白表达增高,与对照组相比差异有统计学意义,t=4.051,P=0.009。12h细胞趋化运动实验显示,CXCR4特异性配体SDF-1α可剂量依赖性诱导Lewis肺癌细胞的趋化运动,在低氧条件下,同对照组相比SDF-1α质量浓度为25ng/mL时开始促进细胞迁移,t=3.053,P=0.031;SDF-1α质量浓度为50ng/mL时可明显提高细胞迁移率,t=4.521,P=0.004。结论:Lewis肺癌细胞功能性表达趋化因子受体CX-CR4,可能与肿瘤细胞迁移和转移有关。

人纤溶酶原K5体内抑制Lewis肺癌肿瘤生长与转移

【目的】通过体内实验探讨人纤溶酶原Kringle 5(K5)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长与转移的抑制作用。【方法】采用腋下接种肿瘤细胞的方法建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤小鼠模型,分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,制备小鼠体质量-时间曲线和肿瘤体积-时间曲线;采用皮下种植瘤剔除术建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,术后分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组小鼠肺组织转移瘤数量,取肺组织进行病理学分析。【结果】在皮下种植瘤模型中,与对照组相比,K5治疗组小鼠肿瘤体积-时间曲线变化平缓,肿块增长缓慢,肿瘤质量明显降低[分别为(4.57±0.79)g和(1.15±0.31)g,P=0.006];在Lewis肺癌转移瘤模型中,K5治疗组小鼠肺表面转移瘤结节数[分别为(15.75±9.79)个和(6.60±3.39)个,P=0.029]以及肺湿质量明显少于对照组,高倍镜下治疗组肺微转移灶数目亦较少。【结论】人纤溶酶原K5能显著抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,并能明显抑制Lewis肺癌细胞转移。

“中心法则”演绎的哲学思维

科学思维的过程就是假说演变为理论的过程。假说是理论产生的根源 ,是科学发展的动力。“中心法则”作为现代分子生物学和分子遗传学的基本理论 ,它的产生、修正与发展演绎了一个假说向理论升华的过程 ,从中人们可以理解许多哲学思想和方法在科学研究中的应用。

分子生物学网络课程的设计与构建

分子生物学因其深奥的理论和抽象的思维,让教师觉得难教,让学生觉得难学。因此,借助网络教学支撑环境和现代教育技术建立一门形象、直观、简洁、易懂的《分子生物学》网络课程将有助于提高教师的教学质量和学生的学习效果。本研究以《现代远程教育资源建设技术规范》为指导,以分子生物学规划教材和大纲为制作依据,进行网络课程内容和形式的设计与构思。

纤溶酶原K5抗血管增生活性依赖其完整Kringle结构域

根据K5蛋白(Pro451—Ala541)的结构特征和二硫键分布特点,设计K5的两个缺失突变体K5 mut1(Cys461—Cys540,保留K5 kringle环3个完整二硫键但去除N端和C端多余氨基酸)和K5mut2(Cys482—Cys535,打开kringle环,只保留2个二硫键).以野生型人纤溶酶原K5 cDNA为模板,用PCR方法得到编码缺失突变体的DNA片段,定向克隆入pET22b(+)质粒载体,重组体转化进大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达,产物经亲和层析和高浓度甘油透析纯化后进行鉴定和生物活性测定.K5 mut1蛋白特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖,且活性强度是完整的K5蛋白2倍;K5mut2对人视网膜微血管内皮细胞无显著抑制作用.结果提示,完整的Kringle结构(包含3个二硫键)是维持人纤溶酶原K5抗血管增生活性的必需结构域,而K5分子中Kringle结构域外的N端和C端氨基酸臂则并非其活性所必需.

人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)抑制小鼠肝癌的血管生成和肿瘤生长

【目的】体内、体外实验观察人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)对肝癌血管生成和肿瘤生长的影响。【方法】大肠杆菌中表达,组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5蛋白,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定K5蛋白的表达;MTT法分析K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞(BRCEC)和肝癌细胞株Bel-7402、HepG2增殖的影响;建立皮下种植肝癌鼠模型,瘤内注射K5,检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度(MVD)。【结果】SDS-PAGE及Westernblot鉴定获得K5纯化蛋白;K5特异性地抑制BRCEC的增殖,IC50=160nmol/L,而对肝癌细胞株Bel-7402、HepG2的增殖无抑制作用;K5显著抑制小鼠肝癌生长,治疗组肝癌组织MVD明显低于对照组。【结论】K5抑制移植性小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长,特异性抑制血管内皮细胞的增殖可能是K5抑制肝癌血管生成的主要机制。K5具有治疗肝癌的潜在临床价值。

Leptin对缺氧诱导胎肺Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响及机制

目的:观察瘦素(LEP)对缺氧诱导胎鼠肺Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)凋亡的拮抗作用,并探讨其机制。方法:采用改良免疫黏附法原代培养胎鼠AECⅡ细胞,并用SP-A免疫细胞化学法和透射电镜进行鉴定;用含5mmol/L连二亚硫酸钠(Na2S2O4)培养液培养AECⅡ细胞12h建立缺氧诱导细胞凋亡模型,处理组含不同浓度LEP(100-1600μg/L);噻唑兰(MTT)比色法检测细胞存活情况;流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期;蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测凋亡蛋白caspase3的表达。结果:采用免疫黏附法获得高纯度原代培养的AECⅡ细胞,免疫细胞化学法示SP-A阳性表达,电镜下可见细胞内特征性板层小体;5mmol/LNa2S2O4能诱导AECⅡ细胞凋亡和caspase3活化,LEP(100-1600μg/L)能减轻Na2S2O4所致的细胞损伤,表现为AECⅡ存活率提高、增殖指数(PI)增高及凋亡峰下降、细胞形态恢复和caspase3活化受抑制。结论:LEP可拮抗缺氧所致AECⅡ细胞凋亡,这可能与其促使细胞周期从G1期进入S期及抑制凋亡蛋白caspase3活化有关。

带免疫佐剂CEA基因疫苗的构建及其稳定同步表达的研究

背景与目的:基因疫苗是目前肿瘤免疫基因治疗研究的热点。目前癌胚抗原阳性肿瘤的治疗效果不佳,本研究拟利用质粒pVAX1构建带有免疫佐剂白细胞介素2同步表达的癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)基因疫苗,探讨一种新的肿瘤生物治疗方法。方法:利用RT-PCR从患者肿瘤组织中钓取CEA目的基因cDNA;运用分子克隆技术,通过内部核糖体进入位点(IRES),将CEAcDNA和hIL-2cDNA连接于质粒pVAX1中,采用化学发光免疫法和ELISA双抗体夹心法分别检测CEA抗原和hIL-2因子的表达;同时用蛋白质分析软件分析和预测目的抗原的特性。结果:测序结果证实本实验所构建的重组质粒插入DNA序列无错配,质粒上所接入的CEAcDNA与GenBank公布的M29540和M17303的序列99.8%同源,经蛋白质分析软件预测,其抗原性、跨膜结构片段、信号肽位点和二、三级结构特征与同源癌胚抗原基本一致。hIL-2cDNA与母本序列100%同源。检测结果说明该重组质粒在体外CHO细胞株中可同步表达CEA和hIL-2分子。结论:从肿瘤组织中成功地获取了CEAcDNA,所构建的pVCEA2重组质粒能在体外细胞中同步表达CEA和IL-2蛋白分子,这为进一步体内实验研究基因治疗CEA阳性肿瘤提供了新的可能途径。

大剂量葡萄糖诱导人视网膜内皮细胞凋亡

目的检验大剂量葡萄糖水平对培养的原代人视网膜毛细血管内皮细胞(humanretinalcapillaryendothelialcells,HRCEC)的直接影响。方法HRCEC细胞从捐赠人眼中分离得到。细胞在含有5mmol/L或25mmol/L葡萄糖的培养基中培养6d。应用锥虫蓝染色测定细胞活力、流式细胞计数分析细胞周期、TUNEL分析细胞凋亡。结果HRCEC细胞在25mmol/L葡萄糖中培养6d,细胞活力显著下降。通过流式细胞计数和TUNEL测定,凋亡细胞的数目在大剂量葡萄糖培养基中显著升高。结论大剂量葡萄糖可诱导人视网膜毛细血管内皮细胞凋亡,这有可能是促进糖尿病性视网膜病发展的原因。

突变型K5重组蛋白抑制小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长的作用

目的:体内实验观察人纤溶酶原K5缺失突变体Ⅰ(K5 mut1)对HepA小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长的影响。方法:大肠杆菌中表达,组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5 mut1蛋白,SDS-PAGE和Western blot-ting方法鉴定其表达;建立皮下种植肝癌小鼠模型,腹腔注射不同剂量K5 mut1重组蛋白,检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度(MVD)。结果:SDS-PAGE及Western blotting鉴定获得K5 mut1纯化蛋白;K5 mut1剂量依赖性地抑制小鼠肝癌(HepA)实体瘤生长,不同剂量K5 mut1治疗组肝癌组织MVD低于对照组,并随K5 mut1用药剂量增加而降低。结论:K5 mut1具有抑制小鼠肝癌生长的作用,抑制肿瘤血管生成可能是K5 mut1抑制肿瘤生长的主要机制。结果提示K5 mut1具有治疗肝癌的潜在临床价值。

纤溶酶原Kringle5缺失突变体抑制血管内皮细胞增生的研究

目的纤溶酶原蛋白水解片段Kringle 5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值,但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mut1)并检测其体外活性。方法除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以降低其相对分子质量,但同时保留K5分子中的所有3个二硫键以保留完整的外环结构域,并在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,获得突变型K5 Mut1 (Cys1-80);MTT法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞和周皮细胞的抑制作用。结果K5 Mut1以浓度依赖的方式抑制原代培养的视网膜内皮细胞,EC50(抑制50%细胞增生的药物浓度)约为35 nmol/L,是完整K5活性的2倍。在同样浓度范围内,K5 Mut1并不抑制同源的周皮细胞,表明K5 Mut1特异性抑制血管内皮细胞增生。结论K5 Mut1是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子,在糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。

血管抑制因子在前列腺癌及前列腺增生组织中的表达及意义

【目的】探讨前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)组织中血管增生抑制因子,如视网膜色素上皮细胞源因子(PEDF)、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素endostatin的表达情况及其血管依赖性生长的分子机制。【方法】收集正常前列腺、前列腺增生和前列腺癌组织标本,RT-PCR技术检测样品中PEDF、angiostatin、endostatin的mRNA表达量,Westernblot技术检测样品中PEDF蛋白的表达量。【结果】和正常前列腺组织相比,PEDF表达量在BPH中无明显变化(P>0.05),在前列腺癌中普遍显著下降(P<0.05);良性前列腺增生组织中endostatin表达量较正常前列腺组织显著升高(P<0.05),前列腺癌比正常前列腺显著升高(P<0.05),而且前列腺癌组织较良性前列腺增生进一步显著增高(P<0.05);三种组织中均未检测到angiostatin的表达。【结论】良性前列腺增生及前列腺癌组织抑制因子表达变化可能和其血管依赖性生长相关;PEDF可能是前列腺组织最主要的血管增生内源性抑制因子。

开放性实验教学与学生科研创新能力的培养

“以实验为中心安排教学”是近年来美国高校正在开展的一项极有影响力的实验教学改革计划(简称EBE计划),其教学重点不在知识的掌握而在能力的培养。为了更好地强化学生的实验操作和科研创新能力,在全面查阅EBE计划相关文献的基础上,充分结合自身的实际状况并加以改进,创建了一个以技能训练为基础、以研究性实验为核心、以综合能力培养为目标的开放性实验教学模式。在完成分子医学基本实验课程的基础上,以学生实验小组的形式开展灵活多样的研究性实验和学生科研活动。它不仅能最大限度地拓展仪器使用空间为教学服务,更重要的是能体现先进的现代化教学思想,在实验教改上具有重要的推广意义。

交叉酶切联合MALDI-TOF/MS分析重组蛋白二硫键分布的方法建立

以Kringle环为分子模型,应用MALDI-TOF/MS联合特异性蛋白酶酶切技术,探讨建立蛋白质二硫键分布和定位分析的研究方法。采用pET22b(+)原核表达体系诱导表达重组人纤溶酶原K5蛋白(rhK5),经Ni2+-NTA resin亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Western-blot进行初步鉴定;采用MTT法分析rhK5对微血管内皮细胞的抑制活性;联合应用交叉酶切(Trypsin Gold单切或Trypsin Gold及Endoproteinase ASP-N双酶切)和基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)分析rhK5的二硫键分布;并应用生物信息学方法和圆二色谱法进一步验证rhK5二级结构。应用原核体系高效表达具有生物活性的rhK5蛋白,经交叉酶切联合MAL-DI-TOF/MS证实rhK5中的6个半胱氨酸正确配对形成了3对二硫键(Cys462:541,Cys483:524和Cys512:536),圆二色谱法测定发现rhK5为典型的β折叠型结构。上述研究结果为分析基因工程重组蛋白质中半胱氨酸配对及二硫键分布提供了方法学基础。

高浓度花生四烯酸诱导小鼠成纤维细胞L929凋亡的研究

目的 :探讨花生四烯酸是否能诱导小鼠成纤维细胞L92 9凋亡及其可能机制。方法 :噻唑蓝 (MTT)法检测细胞存活率 ,比色法测定乳酸脱氢酶 (LDH)释放率 ,硫代巴比妥酸法测定细胞脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)含量 ,Hoechst 332 5 8染色观察凋亡细胞核形态变化 ,DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解。结果 :L92 9细胞在 4 0 - 16 0μmol/L花生四烯酸作用 2 4h后 ,细胞存活率明显下降 ,LDH释放率和细胞MDA含量显著增加 (P <0 0 1)。经 16 0μmol/L花生四烯酸处理后的L92 9细胞呈现典型的凋亡核固缩表现。琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯带。 结论 :高浓度花生四烯酸 (80 - 16 0 μmol/L)能诱导小鼠成纤维细胞L92 9凋亡 ,可能与其促脂质过氧化作用有关。