体外诱导间充质干细胞向成纤维细胞分化的研究

成纤维细胞(Fibroblast,FB)在美容医学和再生医学中展现出前所未有的潜力,然而成纤维细胞的获取以及数量有限是限制其临床应用的瓶颈。使用实验室自主设计的成纤维细胞诱导分化培养基DFM诱导间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)向成纤维细胞分化,并以诱导后的总细胞扩增倍数、成纤维细胞相关基因和蛋白的表达以及细胞的迁移能力为指标,建立了一个全面的分化效果评价体系。结果表明:成纤维细胞诱导分化培养基DFM中细胞的累计扩增倍数显著高于对照组;成纤维细胞相关基因和蛋白的表达显著高于对照组;细胞迁移能力也较对照组有显著提升。

气升式生物反应器在杂交瘤细胞培养中的应用

在前述研究工作基础上,设计开发了10L规模的动物细胞培养用气升式生物反应器。应用该生物反应器悬浮培养杂交瘤细胞,通过平行试验,考察了该反应器设计的合理性和可靠性。结果显示该反应器不存在限制细胞生长、代谢和产物生成的因素,而且细胞破损被彻底消除,表明该气升式生物反应器给细胞生长、代谢和产物生成提供了理想的培养环境,其设计是成功的。

搅拌生物反应器中杂交瘤细胞生长与破损的初步研究

采用连续悬浮培养技术，在３种培养基组成下实验考察了生物反应器中机械搅拌强度和气泡对细胞生长和破损或伤害的作用，发现杂交瘤细胞在无血清培养基中培养时，１２０ｒ／ｍｉｎ的机械搅拌强度对细胞产生了生理伤害作用，而造成细胞破损的主要是气泡。血清和ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８对细胞均有保护作用，它们的存在能保护细胞免受流体剪切的生理伤害作用，适应更高的机械搅拌强度，ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８能有效地防止气泡对细胞的破损作用。另外，对它的保护作用机理也作了讨论。

动物细胞培养用生物反应器设计原理

动物细胞培养用生物反应器设计和放大的关键问题是细胞破损与供氧和混合的矛盾,在分析细胞破损机理基础上,提出了动物细胞培养生物反应器的设计原理——设计模型和有关设计条件,从而清楚地确立了细胞死亡速度与培养基组成、反应器设计和操作参数间的定量关系,以及反应器设计应遵循的保证细胞生长和满足传质要求的条件。还对强化传质和抑制细胞破损这一矛盾作了简要分析和讨论。

血清和Pluronic F68对悬浮培养杂交瘤细胞的保护作用

报道了生物反应器中血清和ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８对杂交瘤细胞的保护作用及其物理机理。实验发现当生物反应器中流体主体Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ湍流涡旋尺度与细胞大小相当或小于细胞时，血清和ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８未能对细胞提供保护作用。而当气泡是导致细胞破损的主要根源时，它们对细胞的保护作用均十分显著，尤其是ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８，在其浓度为１ｇ／Ｌ时，完全防止了气泡对细胞的破损作用。通过泡沫分馏实验、热力学分析和表面张力测定，证明它们对细胞的保护作用建立在表面活性基础上。通过改变系统的界面特性阻止细胞在气泡表面的吸附，从而有效地消除气泡对细胞的破损作用。

动物细胞在鼓泡式生物反应器中的死亡速率

通过实验测定,证明生物反应器中细胞死亡速率与气体鼓泡速率成正比而与反应器体积成反比。实验发现气泡大小对细胞死亡速率具有两种作用,一种作用在于影响气泡表面积生成速率;另一种作用则在于影响细胞在气泡表面的吸附程度,其最佳直径为5mm左右。血清和Pluronic P68能显著降低细胞死亡速率,当Pluronic F68浓度达到0.1％时,k_d趋于零。所有这些实验结果均与前文提出的生物反应器设计模型具有很好的一致性。

大规模培养动物细胞生产药物

细胞融合与重组DNA技术取得的巨大成功为动物细胞培养技术开辟了许多新的领域。目前各类具有明确疗效的生物制品(如病毒疫苗、基因工程蛋白质和单克隆抗体等)的工业化生产已成为动物细胞培养技术发展的主要动力。动物细胞大规模培养技术的研究开发,除了要解决如何高效地大量生产这些药物之外,其生产过程必须确保产品质量能适合人体治疗,且不含有害物质,尤其是病毒和DNA。经过十几年的努力,符合上述要求的生产方法已初步建立,本文拟就此作一简要综述。

体外扩增过程中人骨髓间充质干细胞的增殖与分化规律

目的系统考察体外扩增过程中人骨髓间充质干细胞(MSC)的增殖与分化规律,为MSC在组织修复以及细胞治疗中的应用提供参考。方法以全骨髓贴壁法分离成人肋骨骨髓MSC,在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、细胞周期、成骨、成软骨及成脂肪能力的变化情况。结果随代次增加,MSC增殖能力、成骨、成脂肪能力均有所下降,而成软骨能力无明显降低;成骨、成软骨及成脂肪能力均保持到细胞衰老。在扩增过程中,MSC始终保持较高的纯度,CD29、CD44、CD105的阳性率均在90%以上,CD14、CD34和CD45的阳性率均在4%以下。结论在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失,其中向骨、脂肪方向的分化潜能较软骨方向更易失去;而多向分化能力的保持较之自我更新能力更为持久。MSC在7代以前可作为基础研究及临床应用的良好对象。

体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

背景:兔是软骨组织工程研究中应用非常广泛的实验动物模型,关节软骨细胞的去分化现象已经被广泛认可。目的:观察体外传代培养过程中兔关节软骨细胞的去分化现象。方法:将从新西兰大白兔膝关节分离获取的原代软骨细胞进行传代培养至第7代,对细胞生长、形态、基质分泌以及基因表达等方面分别采用细胞计数,显微镜观察,F机动蛋白染色、番红O染色,糖胺聚糖定量测定以及半定量聚合链式反应进行鉴定和比较。结果与结论:光学显微镜下,兔关节软骨细胞在体外传代培养过程中细胞形态由小且圆形或多角形,逐步转变大且为成纤维细胞样的梭形形态,对F机动蛋白的染色进一步佐证了这样的形态变化。细胞计数结果表明,细胞增殖能力随代次增加显著下降,特别是第3代以后的软骨细胞基本无明显增殖;经过番红O染色以及定量测定糖胺聚糖的含量,发现软骨特性胞外基质分泌量从第2代细胞开始就呈现显著的降低。半定量聚合链式反应检测结果表明,随着传代次数的增加,特别是第3代以后,软骨相关特征分子(包括Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白和SOX9等)基因表达水平下调;而与去分化相关的特征分子Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖基因表达水平上调,同时,细胞表面分子CD90基因表达上调,而CD14基因表达未见明显变化。结果证实,兔软骨细胞在体外传代过程中可出现快速地去分化现象,呈现出特征基因表达水平的变化,第3代以内的软骨细胞适合应用于软骨组织再生修复。

不同培养条件下CIK细胞纯度变化的研究

目的为了研究不同培养条件对 CIK细胞 ( cytokine- induced killer cells,CIK细胞 )纯度的影响。方法分别从脐血和成人外周血单个核细胞定向诱导 CIK细胞的产生 ,用流式细胞分析法对不同培养条件下 CIK细胞的纯度进行了分析。结果培养到第 14、2 1d时 ,脐血来源的 CIK细胞纯度分别为 3 8.68%和 5 3 .11%。成人来源的 CIK细胞纯度分别为 3 3 .90 %和 63 .2 6% ,说明培养时间对 CIK的纯度具有明显影响。 CIK细胞培养 14 d后 ,在无细胞因子或受到再次激活的条件下继续培养 7d,与连续培养的 CIK细胞相比 ,两种来源的 CIK细胞的纯度都没有明显的变化。结论这一结果对于

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。

胰酶对皮肤角质细胞分离和传代的影响

考察不同的胰酶浓度及其作用时间对角质细胞分离和传代的影响。实验发现在胰酶浓度 0 2 5 %时作用5min可获得的总活细胞量和有克隆形成能力的细胞量均优于其它培养条件 ;而在胰酶浓度 0 0 5 %时作用 5min可获得最大的原代角质细胞贴壁率。随着胰酶浓度的提高 ,传代角质细胞的贴壁率和贴壁速率常数以及克隆形成率均随之增加 ,因此在传代培养时使用 0 2 5

猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究

通过孔板培养系统以及微载体和转瓶培养系统,研究了感染复数(MOI)、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对细胞生长和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)繁殖的影响。结果表明,MOI影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量,TOI影响细胞对病毒的敏感程度以及胞内病毒的增殖速率;丰富的维生素、氨基酸等物质有利于病毒效价的提高;采用微载体和生物反应器系统生产TGEV,病毒效价可达11.3lgTCID50/0.2mL,比方瓶培养系统提高约100倍。

高分子量透明质酸的发酵研究

采用兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)进行分批补料发酵生产透明质酸(HA)。结果表明:采用葡萄糖初始浓度为4%,分批补加葡萄糖,使其浓度控制在2%,可使HA的产量达到3.4g/L,平均分子量2.45×106Da。若加入0.75g/L尿苷一磷酸,HA的产量可提高20.6%,达4.1g/L,平均分子量2.87×106Da。

谷氨酰胺限制对杂交瘤细胞生长、代谢和单抗生产的影响

利用批培养和流加培养方式以及不同的流加培养成分,考察了谷氨酰胺限制对杂交瘤细胞生长、代谢和单抗生成的影响。谷氨酰胺限制降低了最大细胞密度和单抗比生产速率,说明谷氨酰胺限制阻碍了细胞生长和单抗生产。谷氨酰胺限制流加培养的YLac/Gluc和YLac/Cells高于批培养和谷氨酰胺非限制流加培养的,说明谷氨酰胺限制促进了葡萄糖向乳酸的生成,增强了葡萄糖的溢流代谢。与批培养和谷氨酰胺非限制流加培养相比,谷氨酰胺限制流加培养的氨和丙氨酸浓度及其比生成速率较低,而且YAmm/Gln高,YAla/Gln和YAla/Cells低,说明谷氨酰胺限制使得较多的谷氨酰胺参与脱氢反应,提高了谷氨酰胺的利用率,降低了细胞对氨和丙氨酸的生成,从而削弱了氨对细胞生长和单抗生产的毒害。在流加培养中应严格控制谷氨酰胺的流加浓度及与葡萄糖的配比,要避免谷氨酰胺过分限制导致的葡萄糖溢流代谢和对细胞生长和单抗产率的不利效应。

rCHO细胞在葡萄糖限制流加培养过程中的生长与代谢特性

以调控rCHO细胞的葡萄糖代谢为主要研究目标,通过在2L生物反应器中进行的批培养和葡萄糖限制恒速流加培养的方法,考察了在培养过程中葡萄糖浓度对rCHO细胞生长、葡萄糖和谷氨酰胺消耗,以及副产物乳酸、氨和丙氨酸生成的影响。结果表明:葡萄糖限制的流加培养过程中,活细胞密度XV达到2.35×106cells·mL-1,较批培养提高一倍;而乳酸生成大幅减少。在葡萄糖限制培养阶段,qLac和YLac/Gluc持续降低至零,而qo2/qGluc由0.7mmol·mmol-1上升至4.3mmol·mmol-1,说明更多葡萄糖进入高效释能代谢途径。同时谷氨酰胺的消耗增加,YAmm/Gln增大,YAla/Gln下降,证明谷氨酰胺的能量利用率也有所提高。

表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化

在自主研发无蛋白培养基的基础上,考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对CHO细胞生长、代谢与抗体合成的影响。结果表明,对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充,虽然不能促进细胞生长,但有利于培养后期细胞活性维持与抗体合成;B族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间;作为重要的碳源和能源,葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长,而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成,维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间,从而有利于提高抗体产量。通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基,CHO细胞在该培养基中的最高密度达到52.6×105cells mL 1,抗体产量达到274 mg L 1,与初始培养基相比分别提高了33%和63%。总之,在细胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分,以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。

MOI对HEK293细胞感染病毒后的生长代谢和腺病毒扩增效率的影响

分别在方瓶贴壁和转瓶悬浮二种培养模式下,考察了感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)对HEK293细胞感染病毒后的生长代谢和腺病毒扩增效率的影响。通过实验发现,感染病毒后的细胞跟未感染病毒相比较,其细胞生长受到严重限制,但仍然保持着旺盛的代谢活动。结果表明:MOI对细胞感染病毒后的生长代谢和腺病毒扩增效率有显著影响。随着MOI增加,细胞死亡速率增加,其代谢速率也普遍上升。同时,MOI增加能有效地提高病毒感染率和单位细胞病毒颗粒数扩增效率,但过高的MOI亦会降低病毒滴度扩增效率,从而影响病毒包装质量。

搅拌式生物反应器中造血细胞的灌注培养

为了消除造血细胞静态培养中存在的浓度梯度和搅拌悬浮培养时换液引起的波动,为造血细胞体外扩增提供更理想的培养环境和操作方式,利用自主开发的造血细胞重力沉降截留系统结合有溶氧和pH控制的生物反应器进行了脐血造血细胞的灌注培养。两次灌注培养中总细胞分别扩增11·5和18·6倍,扩增倍数最大时,CFU_Mix分别扩增23·2倍和20·4倍、CFU_GM扩增13·9倍和21·5倍、BFU_E扩增8·0倍和6·9倍、CD34+细胞扩增17·1倍和15·4倍。培养到12d时,第一次实验由267×106单个核细胞扩增得到1082×106个总细胞,6·31×106个CFU_GM,6·2×106个CFU_Mix和23×106个CD34+细胞;第二次实验由180×106单个核细胞扩增得到1080×106个总细胞,4·65×106个CFU_GM,11·0×106个CFU_Mix和25·0×106个CD34+细胞,这达到了临床规模,由于控制了较低的溶氧和稳定的培养环境,细胞中干/祖细胞含量显著高于方瓶。但灌注培养到后期细胞密度达到较高后,细胞生长受到抑制,这应该是由细胞密度过高本身所引起。搅拌式反应器中进行灌注培养有利于造血干/祖细胞的进一步扩增,培养得到的细胞中干/祖细胞含量较高,培养规模达到了临床要求,但过高的细胞密度将对造血细胞的生长产生抑制。

FL对脐血造血细胞长期液体培养的影响

用脐血进行干细胞移植有许多优点，但有一个主要的缺点是可获得的细胞数量有限，因此脐血干细胞的体外扩增对于其临床应用具有重要意义。考察了Ｆｌｔ３配体（ＦＬ）和干细胞因子（ＳＣＦ）、白介素３（ＩＬ３）、ＩＬ６、粒细胞集落刺激因子（ＧＣＳＦ）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ）的组合对脐血细胞扩增和分化的影响。培养４２ｄ，总细胞最多扩增了３８５３０±１６３．５１倍（ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＧＣＳＦ＋ＧＭＣＳＦ），粒细胞巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵＧＭ）在第２８天达到最高，最高扩增了４０９５２±１８９５０倍（ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６）。ＦＬ与ＳＣＦ等细胞因子具有协同作用，对所有考察的细胞因子组合中，加入ＦＬ都使总细胞和ＣＦＵＧＭ的扩增倍数增加。ＦＬ＋ＳＣＦ培养的总细胞扩增最小，而ＣＦＵＧＭ长时间保持在较高水平，表明这ＦＬ和ＳＣＦ有利于保持造血干细胞的活性，防止细胞分化。在存在ＧＣＳＦ和ＧＭＣＳＦ的培养中，总细胞获得了最大的扩增，但ＣＦＵＧＭ达到最大后很快下降至０，表明ＧＣＳＦ和ＧＭＣＳＦ促进了细胞的分化。结果提示，细胞因子组合对脐血造血细胞的扩增和分化具有重要的作用，ＦＬ和ＳＣ?