数字PCR和荧光定量PCR检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数方法的建立及其应用

传统的检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法是Southern杂交,该方法成本高、周期长,难以满足高通量检测外源基因拷贝数的育种需求,因此,本研究旨在建立快速且高通量检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。本研究从番木瓜基因组中筛选出2个单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770,以已知外源基因为单拷贝整合的转基因番木瓜为参照,利用数字PCR鉴定其拷贝数,进一步以其为内参基因,以番木瓜转基因育种常用的筛选标记基因NPTⅡ为外源目的基因,建立利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。结果表明:Cpa03g018830和Cpa03g018770均为单拷贝基因;建立的数字PCR方法对转基因番木瓜中的外源基因拷贝数的检测准确可靠,而荧光定量PCR对转基因番木瓜中外源基因单低拷贝整合的检测准确度较高,对外源基因多拷贝整合的检测准确度则较低,因此,荧光定量PCR适合用来在大量转基因植株中初筛出单低拷贝整合的植株。本研究鉴定的单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770可作为转基因番木瓜中外源基因拷贝数检测的内参基因,且建立的利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法,操作简单,速度快,适合批量检测,可为番木瓜转基因抗病育种中单低拷贝株系的选育提供新的方法。

基因沉默番木瓜环斑病毒复制酶基因(PRSV-Nib)获得抗病毒病番木瓜的研究

番木瓜是重要的热带经济水果。番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是番木瓜的重要病毒病,经常导致严重的产量损失和质量恶化。自从1998年第一例转基因番木瓜问世以来,使得基于“致病菌衍生的抗病性(pathogen-derived resistance,PDR)”的抗病育种策略获得成功广泛应用。然而依赖于序列同源性的抗病性与病毒突变导致多样性增加之间的矛盾成为番木瓜育种科学家的新挑战。本研究拟采用RNAi策略针对复制酶(nuclear inclusion b.Nib)获得广谱抗PRSV番木瓜新种质。通过团队已建立的胚性愈伤诱导-农杆菌介导转化-再生苗诱导的番木瓜遗传转化体系,共获得经过抗性筛选的再生苗52株,通过特异性PCR进行筛选共计获得24株转基因阳性植株。通过对T0代田间自然发病试验中,转基因番木瓜株系抗病性明显高于非转基因对照,其中NibB5-2田间抗病性最优。通过hiTAIL-PCR方法确定NibB5-2插入位点位于第2号染色体supercontig_30的1976766的位置。T1代接种试验中,无病毒积累且无发病症状,初步确认具有良好的病毒抗性,为番木瓜抗病育种提供新思路。

番木瓜赖氨酸基序类受体激酶LysM-RLK基因家族鉴定及生物信息学分析

本研究采用生物信息学方法在番木瓜全基因组范围系统鉴定了7个LysM-RLK家族基因,并解析了其染色体分布特征、基因结构特征、蛋白理化性质和亚细胞定位信息。基因家族进化分析表明番木瓜的7个LysM-RLK基因可划分为3个亚组(Lym-II,Lym-III,Lym-IV),并分布于4条染色体上。基因复制是番木瓜LysM-RLK家族进化的主要驱动力,基因复制分析鉴定得到7对复制基因。启动子序列调控元件分析发现其包含多个光响应元件及参与低温应答和逆境相关激素信号应答的元件。大规模比较转录组分析系统地解析了LysM-RLK在番木瓜生物胁迫、非生物胁迫条件下及不同组织中的基因表达模式,揭示其特异性的表达模式及潜在的生物学功能。复制基因对的表达分化、结构域组成差异和蛋白质三级结构的变化,暗示其在进化过程中的亚功能化现象。生物和非生物胁迫条件下的核心共表达网络分析鉴定了27个与LysM-RLK3强关联的核心基因,揭示了LysM-RLK3潜在的转录调控模式。相关结果为番木瓜LysM-RLK家族起源演化、功能分化及其在逆境响应和生长发育过程中的角色提供重要依据。

双波长法测定木薯的直链和支链淀粉含量

直链淀粉和支链淀粉含量及其比例是木薯淀粉品质的重要指标。采用双波长法对30个木薯株系的直、支链淀粉的含量进行了测定,根据碘分别与直链和支链淀粉反应生成复合物的吸收光谱,我们最后确定了直链淀粉的和支链淀粉的参比波长和测定波长分别是609和469.5 nm、542和721 nm。根据回归方程得到了30个木薯株系的直链淀粉和支链淀粉的含量。本实验中用于测定木薯的直链淀粉浓度在0～26μg/m L,支链淀粉浓度在0～100μg/m L范围内符合比耳定律。结果表明：SC8不同株系的直链淀粉含量变化范围：14.879%～21.905%,支链淀粉含量变化范围：47.864%～56.955%;SC6不同株系的直链淀粉含量变化范围：15.494%～24.726%,支链淀粉含量变化范围44.292%～57.465%。该方法准确性高、重复性好、效率高,工作量小,适于批量木薯样品分析。

水稻4个生长时期茎部可培养内生菌多样性分析

为了解水稻不同生长时期内生细菌的动态变化及其多样性,以水稻品种明恢63(MH63)为研究对象,种植于海南省三亚市连作水稻试验田中,分别于水稻幼苗期、分蘖期、开花期和结实期(2014年1月到4月份)分离茎部可培养内生细菌。结果表明:共获得了细菌域4个门6个纲51个属99个种共计529株分离菌株,其中幼苗期分离到23个属33个种,分蘖期分离到30个属44个种,开花期分离到15个属20个种,结实期分离到20个属29个种。上述4个生长时期均分离到伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、草螺菌属(Herbaspirillum)和黄杆菌属(Flavobacterium),且以伯克霍尔德氏菌属为优势菌属。多样性指数排序:分蘖期>幼苗期>结实期>开花期;优势度指数排序:开花期>结实期>幼苗期>分蘖期。水稻茎部内生细菌具有较丰富的遗传多样性,不同生长期的种群数量、优势度存在差异,开花期优势菌群集中,优势属突出,优势度较高;而分蘖期优势度较低,但种群种类较丰富,且分布均匀。

基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证

根据RNAi原理构建的抗海南番木瓜环斑病毒(PRSV)植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。描述转化植株的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。实验结果显示:转基因株系474为单拷贝插入的杂合子,插入位点在第7号染色体supercontig_61的717 141位置;抗病毒试验中,在接种病毒后28 d内非转基因株系1280有高浓度的病毒积累并很快表现出明显的病症,而转基因株系474基本无病毒积累且无发病症状。表明转基因株系474具有较好的PRSV抗性,有待于进一步田间试验。

南繁区转基因水稻田杂草种类调查

为了弄清南繁区转基因水稻田、非转基因水稻田和空白对照田杂草种类及发生情况,采取5点取样法,对3种田的田间杂草种类及危害情况进行了调查。结果表明:转基因水稻田有杂草19种,隶属11科,优势杂草为空心菜、牛毛毡、水莎草、莲子草、水苋菜、千金子,相对多度分别为37.58%、28.51%、26.24%、21.70%、21.62%、20.84%;非转基因水稻田主要杂草包括17种,隶属10科,优势杂草为空心菜、水莎草、牛毛毡、莲子草、水苋菜,相对多度分别为40.14%、29.83%、29.83%、24.11%、21.70%;空白对照田主要杂草包括12种,隶属8科,优势杂草为空心菜、水莎草、水苋菜、碎米莎草、莲子草、鳢肠,相对多度分别为60.28%、36.76%、34.98%、33.80%、29.11%、23.25%;水稻田(转基因水稻和非转基因水稻)中各优势杂草的危害程度明显低于空白对照;除了千金子,转基因水稻田中的优势杂草(空心菜、牛毛毡、水莎草、莲子草、水苋菜、碎米莎草、鳢肠)的危害程度均略低于对应的非转基因水稻。

木薯淀粉分支酶活性测定方法比较研究

旨在找到木薯淀粉分支酶活性有效测定方法。以成熟期的木薯块根为材料,对现有的淀粉分支酶活性测定方法从酶液提取液、酶液浓度、反应体系、反应时间和酶反应终止方式作了比较和改进。木薯淀粉分支酶活性测定的有效方法:取0.5 g成熟木薯块根,加入提取液研磨成浆,离心后上清为粗酶液,粗酶液稀释后加0.5%可溶性淀粉,37℃恒温水浴中保温10 min后置沸水浴中终止反应,再加碘液显色反应10 min后测定波长660 nm处吸光度值,每降低一个百分率的碘蓝值即为木薯淀粉分支酶SBE的一个活性单位(U)。改良后的淀粉分支酶活性测定方法能很好的区分木薯不同株系淀粉分支酶活性差异,实验重复性好,操作简单、快捷。

用Golden Gate法构建广谱抗番木瓜环斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表达载体

分子生物学育种是目前防治番木瓜环斑病毒(PRSV)最有效的方法。早期转基因番木瓜抗病毒的策略是根据"致病菌衍生的抗病性"(PDR)原理,将病毒来源的基因全长序列,转入番木瓜并获得抗性。PDR策略最主要特点依赖于靶目标病毒基因序列相似性,不能有效解决海南的番木瓜环斑病毒遗传多样性复杂的株系。本研究着眼于创制广谱的抗PRSV新策略,用最新的CRISPR/FnCas9基因编辑技术和Golden Gate载体构建系统,依据不同PRSV株系的保守序列分析结果,将5个sgRNA(2个CP sgRNA,2个Nib sgRNA和1个HC-Pro sgRNA)串联在一个载体上,实现一个载体可识别剪切5个位点,从而达到广谱抗PRSV的效果,应对海南地区PRSV株系复杂的问题。目前载体已经进行了测序验证,并在番木瓜上进行了叶片局部瞬时表达,初步表现出对PRSV的抑制效果,这为获得广谱抗番木瓜环斑病毒的番木瓜品种奠定良好基础。

基于CRISPR基因编辑系统抗番木瓜曲叶病毒的植物转化载体的构建

双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点,一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高,见效低,而且还可能对环境造成负面影响,因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究结合最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术和Golden Gate克隆技术,设计并构建了抗番木瓜曲叶病毒基因编辑串联多切点表达载体。表达载体转入农杆菌AGL1后经注射本氏烟草叶片进行瞬时表达,48 h后通过激光共聚焦显微镜能观察到有绿色荧光的出现,定位的位置为细胞核与细胞质膜。本研究为番木瓜抗曲叶病毒研究提供理论基础。

红心火龙果不同发育时期果肉呈色相关基因表达模式研究

火龙果属于仙人掌科量天尺属,是具有重要经济和营养价值的热带水果之一,其果实富含花青素和甜菜红素。在果实成熟后期甜菜红素的大量积累引起红心火龙果果实转色的现象。果肉色泽是评价火龙果果实品质的重要指标之一,然而其果实转色背后的基因表达调控模式并不清晰。深入研究火龙果果实发育过程中果肉颜色调控的分子机理有助于丰富火龙果品质形成的理论基础。本研究以‘美红一号’红心火龙果为实验材料,采集果实发育过程中9个不同时期的样品,通过比较转录组学共识别了96种差异表达的基因,最后分析发现15个与色素代谢通路相关的基因在果实发育不同阶段显著差异表达。GO功能富集分析发现差异表达基因主要富集在与结合活性、催化活性、转运活性和结构分子活性相关的功能分类上,且与色素代谢都有重要联系;KEGG代谢途径富集结果显示,次生代谢物合成途径、氨基酸和核酸代谢途径、酪氨酸代谢途径富集基因较多。利用实时荧光定量PCR技术对15个与色素相关的差异表达基因进行了验证,其结果与转录组分析结果一致。生理分析和转录组分析结果表明,红皮红肉火龙果发育过程中伴随大量甜菜色素的合成,且甜菜色素合成途径中DODA基因逐渐上调,在果实转色其中在P4时期明显的上升趋势,其它关键基因表达逐渐下调。本研究发掘火龙果中与果实转色相关的相关基因,为后续火龙果遗传改良提供了重要的目标基因和遗传基础。

转基因番木瓜生物育种现状与展望

转基因番木瓜于1998年被允许商业化生产,是世界上第一例被允许商业化生产的热带水果,目前已在多个国家广泛种植.当前所有的转基因番木瓜主要是基于致病菌衍生抗性原理,通过RNA沉默途径,使入侵的病毒不能够复制从而导致病毒的群体下降.本文回顾了转基因番木瓜的研究进展,并对转基因番木瓜抗病毒策略、遗传转化体系、功能基因挖掘、生物育种技术研发和转基因番木瓜生物安全评价进行了讨论.本篇综述还重点分析了番木瓜生物安全的其他相关问题,如异壳体化病毒、重组、合成、基因飘逸、对非靶标生物的影响、食品安全以及各种可能的致敏性等.通过对这些问题的综述与探讨,为开展我国具有自主知识产权的热带水果的生物技术育种提供理论支持.

浅谈在社会主义市场经济体制中的港口能源管理

党的十五大以来,随着国有企业体制改革的不断深化,为满足社会主义市场经济竞争的需要,派生出来各种形式的企业组合方式。作为我国企业改革先行官的港口企业也不例外,股份制、合作制、中外合资制、经济承包制等港口企业不同的组合方式已在国内部分港口施行。在社会主义市场经济新的体制下港口能源管理如何运作。

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒(PRSV)海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白(CP)、辅助成分-蛋白酶(HC-Pro)和复制酶(Nib)基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以p UCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入p CAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、p CAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、p CAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。

山蚂蝗慢生根瘤菌的遗传多样性及系统发育

【目的】研究我国亚热带和温带地区与山蚂蝗共生的慢生根瘤菌遗传多样性和系统发育。【方法】采用BOX-PCR和多位点基因序列分析(nifH,nodC和recA基因)方法对分离自我国不同地区的29株山蚂蝗慢生根瘤菌进行遗传多样性和系统发育分析。【结果】BOX-PCR分析表明供试的山蚂蝗慢生根瘤菌形成25个基因遗传型,具有丰富的基因组多样性。多位点基因序列分析发现代表菌株位于慢生根瘤菌的3个分支上,分别与埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii),大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和圆明慢生根瘤菌(Bradyrhizobium yuanmingense)亲缘关系近。【结论】我国山蚂蝗慢生根瘤菌具有丰富的遗传多样性,共生基因系统发育分析表明它们多与持家基因共同进化,并以垂直进化为主。

西红柿(Solanum lycopersicum)潜在内源性致敏蛋白的生物信息学筛选与分析

食物过敏是由于接触特定过敏原引起的异常免疫反应。西红柿营养价值丰富并且可作为天然抗氧化剂,已被人们熟识并广泛食用的蔬菜。为了对西红柿中的内源性致敏蛋白有全面的认识和了解,本工作利用全序列比对的方法比较了西红柿蛋白与已知致敏原之间的序列相似性,获得了西红柿潜在致敏蛋白序列,并分析及描述了它们的保守结构域、分子作用功能、系统发育情况以及在染色体的位置。结果表明:共鉴定120个西红柿内源性致敏蛋白,其中包括9个已被数据库收录的西红柿致敏原;保守结构域分析显示它们分别属于43个蛋白家族,主要分布于Gelsolin、Chloroa_b-bind和Thaumatin等家族,其中的HATPase_c结构域未在已知致敏蛋白中发现;Chloroa_b-bind和Thaumatin家族蛋白在绿色植物较特有,将这2个家族蛋白进行系统发育分析则分别揭示了西红柿的遗传多样性;而且预测的致敏蛋白在西红柿染色体上有成簇状分布的趋势。

水稻(Oryzasativa L.)潜在内源性致敏原的生物信息学筛选与分析

食物中的蛋白质是最常见的食入性致敏原。为了对水稻中的内源性致敏原有一个全面的认识和了解,本研究利用全序列比对的方法比较了水稻蛋白与已知致敏原之间的序列相似性,获得了水稻潜在致敏原,并对其保守结构域、分子功能、系统发育和染色体分布进行了分析和描述。结果一共发现了122个水稻潜在致敏蛋白,其中包括了22个已被数据库收录的水稻致敏原;保守结构域分析显示它们分别属于37个蛋白家族,其中的HATPase_c_3(Histidine kinase-,DNA gyrase B-,and HSP90-like ATPase,PF13589)结构域未在已知致敏原中发现;系统发育分析则分别揭示了水稻Prolamin蛋白超家族和Dna K蛋白家族的多样性;而且潜在致敏蛋白在水稻染色体上有成簇状分布的趋势。

马铃薯(Solanum tuberosum)潜在内源性致敏蛋白的生物信息学筛选与分析

当接触特定食物时所复发产生的一种特定的、不利于健康的免疫效应称为食物过敏。马铃薯作为世界第四大粮食作物而被广泛食用,随着基因组学的发展以及马铃薯过敏原信息的逐渐积累,它的致敏性引起高度关注。为探究马铃薯致敏性发病机理,本研究将马铃薯全蛋白基因组与致敏数据库收录的致敏序列进行比对,然后对所筛选出来的致敏蛋白进行保守结构域、生物学功能、系统发育以及染色体定位分析,结果显示:筛选出167条潜在内源性致敏蛋白中发现有11条马铃薯致敏原被数据库收录;分析它们的保守结构域发现,72个蛋白家族主要分布在Chloroa_b-bind、Hsp70和Tryp_alpha_amyl等家族中;通过GO注释对预测马铃薯致敏蛋白进行生物学功能描述;对Hsp70和Tryp_alpha_amyl家族蛋白进行系统发育分析表明马铃薯在遗传进化上具有多样性;预测致敏蛋白多以成簇分布在马铃薯染色体上。本研究为马铃薯蛋白致敏以及后基因组学提供了参考依据。

水稻种子蛋白双向电泳方法的建立和质谱初步分析

为了建立适用于水稻(Oryza sativa L.)种子蛋白质组分析的双向电泳方法,本研究比较了三氯乙酸/丙酮法和改良的酚提取法对水稻种子蛋白的提取效果,不同蛋白提取液上样量、不同p H梯度(p H 3~10和p H 4~7)IPG胶条对水稻种子蛋白的分离效果。结果表明:在目前的双向电泳体系下,采用改良的酚提取法,24 cm p H 4~7线性IPG胶条,上样量1 200~1 500μg的条件可以获得分辨率高、重复性好、胶内蛋白点适用于后续质谱分析的双向电泳图谱。最后本实验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对10个随机挑选的胶内蛋白质点进行了初步蛋白质鉴定分析,进一步确定了改良的酚提取法可以适用于水稻种子蛋白质双向电泳分析。

淀粉生物合成及其基因调控研究进展

淀粉是人们生活中不可或缺的重要物质,根据其分子结构不同通常可分为直链淀粉和支链淀粉,其分子结构决定了淀粉品质及用途。随着分子生物学技术的发展,与淀粉合成及结构相关的功能基因被克隆和应用。利用转基因和基因编辑技术对淀粉生物合成关键酶基因进行调控,在提高淀粉品质和产量方面表现出巨大的发展潜力。文章全面综述了主要农作物淀粉生物合成相关酶基因及通过基因操作改良淀粉品质和提高产量方面的最新研究进展,并对其研究方向进行了展望。