重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建和鉴定

目的构建重组人HIF-1α真核表达载体质粒,为进行治疗性血管再生研究做准备。方法从Hela细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板培养基筛选菌落,抽提质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体。结果获得重组的人HIF-1α真核表达载体质粒,经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同,插入pcDNA4/HisMaxA载体部位正确。结论重组的人HIF-1α,所选用的pcDNA4/HisMax可高表达目的基因,为利用其进行治疗性血管再生研究奠定了基础。

血压参数脉压对院内心血管病死率的相关分析

目的 :研究血压参数脉压对心血管病死率的相关作用。方法 :住院患者 14 4例入选 ,其中因心血管病死亡 2 4例 (病死组 ) ,选择连续病例 12 0例 (对照组 ) ,使用双变量相关分析判断年龄、糖尿病、收缩压、舒张压、平均动脉压和脉压与心血管病死率的相关性。结果 :两组间方差分析 :年龄、脉压差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,提示脉压增高可能是死亡的危险因素。其余参数差异没有显著性 (P>0 .0 5 )。相关分析结果表明死亡与年龄、脉压显著相关 ,而脉压有随着年龄增大而增大的相关趋势。结论 :与其他血压测值比较 ,脉压与心血管病死率呈明显相关性 。

靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较

目的:研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系.方法:设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体,转染大鼠神经胶质瘤C6细胞,并在不同时相收集转染的细胞,进行RT-PCR和Westernblot检测.结果:转染24h之后,各处理组均未见AT1mRNA水平有明显减少.与对照组相比,Pb组在转染后48h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到(55.7±7.6)%,72h后达到最低点(43.7±8.2)%.其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P>0.05).抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似.与对照组相比,Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24h和48h分别减少至(46.9±4.2)%和(37.0±3.7)%,最大减少在转染后72h(28.1±4.0)%.结论:选择有效的shRNA序列时,除了一般的原则之外,靶位mRNA的环状结构及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用.

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中。酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGloxΔ1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒。重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体。

靶向大鼠AT1-R基因的短发夹RNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠AT1-shRNA腺病毒载体并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pGenesil-1-AT1-shRNA真核表达载体中用RT-PCR法扩增出AT1-shRNA片段,将其克隆入PUC18质粒中。酶切构建好的pUC18-AT1-shRNA载体并克隆进入穿梭质粒pDC316中,将构建好的穿梭质粒pDC316-AT1-shRNA载体和骨架病毒pBHGloxΔ1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶、PCR检测和GFP表达证实成功地构建了携带AT1-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带AT1-shRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步抗血压研究奠定了基础。

阿托伐他汀对巨噬细胞肝X受体表达及胆固醇外流的影响

目的:他汀类药物是目前治疗脂代谢的有效药物,通过研究阿托伐他汀对巨噬细胞的肝X受体(LXR)及其下游的一些目的基因的表达和胆固醇外流的影响,探讨他汀类药物对LXR信号系统的作用。方法:分离人外周血的单核细胞,并转化为巨噬细胞。在阿托伐他汀的作用下,观察巨噬细胞的aopA-I介导的胆固醇外流的变化和LXR以及其下游目的基因ABCA1、SREBP2、CETP、PLTP、apoE、MMP-9和MIP-1α的mRNA及蛋白LXRα、ABCA1、MMP-9和MIP-1α的表达。结果:阿托伐他汀上调LXRα、ABCA1、SREBP2、CETP、PLTP基因的表达,而下调MMP-9和MIP-1α基因的表达,同时增强aopA-I介导的胆固醇外流。结论:巨噬细胞在阿托伐他汀的作用下,胆固醇外流增强,这种效应与阿托伐他汀上调LXR及其下游的影响胆固醇代谢的目的基因有关,同时,也抑制一些炎症反应的基因的表达。提示他汀类药物的治疗作用,与其影响巨噬细胞LXR信号途径有关,从而影响泡沫细胞的形成。

粒细胞集落刺激因子对内皮前体细胞的动员

目的:研究重组人粒细胞集落刺激因子(GCSF)在不同时相对内皮前体细胞(EPC)的动员作用。方法:将16只体重为2～2.5kg的雄性新西兰兔随机分为两组,即正常对照组和GCSF组,每组8只。用药后1、2、3和4周测量外周血EPC含量。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养瓶、板中,培养3d收集贴壁细胞,用流式细胞仪计数EPC,PECD34/FITCCD133双阳性细胞为EPC;荧光显微镜鉴定FITCUEA1/DilacLDL双染色阳性细胞为EPC。用药第3周测血清一氧化氮(NO)、血脂。结果:用药1、2、3和4周两组外周血EPC曲线:正常对照组为一低水平基线;GCSF组持续稳定于高水平,两组间差异有显著性意义(P<0.01)。第3周检测血清NO及血脂,两组血脂均在正常范围内,NO亦无显著性差异。结论:GCSF对EPC有显著而持续的动员作用,该作用与血清NO无关。

尼古丁对巨噬细胞肝X受体α表达及胆固醇外流的影响

目的通过研究尼古丁对巨噬细胞的肝X受体α(LXRα)及其下游的一些目的基因表达和胆固醇外流的影响,探讨尼古丁对LXR信号系统的作用。方法分离人外周血单核细胞,并转化为巨噬细胞。在尼古丁的作用下,观察巨噬细胞的aopA-Ⅰ介导的胆固醇外流的变化和LXR以及其下游一些目的基因mRNA表达。结果尼古丁明显影响巨噬细胞中一些涉及胆固醇代谢及炎症反应的基因表达,同时降低aopA-Ⅰ介导的胆固醇外流。结论巨噬细胞在尼古丁的作用下,由aopA-Ⅰ介导的胆固醇外流降低,这种效应与尼古丁下调LXRα及其下游的影响胆固醇代谢的目的基因有关,同时,也促进一些炎症因子基因的表达。提示尼古丁在动脉粥样硬化中的作用与其影响巨噬细胞LXR信号途径有关,从而影响泡沫细胞的形成。

编码大鼠AT_1-R mRNA的shRNA真核表达载体的构建

目的构建编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备。方法根据大鼠AT1-R mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠AT1受体的shRNA表达载体质粒。结论构建的编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体可进入哺乳细胞内表达短发夹RNA,经Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA,而达到基因干扰的作用。为利用其进行自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础。

阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬作用中Beclin-1和Map1lc3基因mRNA表达的影响

目的观察不同时相使用阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬的影响,探讨其保护血管内皮细胞的可能机制。方法用Hanks’液替代培养基进行饥饿诱导血管内皮细胞发生自噬的方法。分别在诱导自噬前和诱导过程中,使细胞分别与含或不含阿托伐他汀的正常培养基或Hanks’液共孵育,RT-PCR技术检测组间Beclin-1和Map1lc3两基因的表达。结果与空白对照组相比,诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组和仅在诱导中应用阿托伐他汀组的Beclin-1和Map1lc3两基因mRNA表达均明显降低(P<0.01)。诱导前应用阿托伐他汀组的表达低于对照组,但无统计学意义(P>0.05)。诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组的表达低于仅在诱导中应用阿托伐他汀组,但无统计学意义(P>0.05)。结论阿托伐他汀可以抑制血管内皮细胞自体吞噬,这一作用可能与阿托伐他汀改善血管内皮功能的机制有关。

阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬作用的影响

目的观察不同时相使用阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬的影响,探讨其保护血管内皮细胞的可能机制。方法采用Hanks液替代培养基进行饥饿诱导血管内皮细胞发生自噬。在诱导自噬前和诱导过程中,使细胞分别与含或不含阿托伐他汀的正常培养基或Hanks液共孵育,随机分为空白对照组、诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组、仅在诱导中应用阿托伐他汀组和仅在诱导前应用阿托伐他汀组,并应用透射电镜检测各组细胞发生自噬的情况。结果电镜下各组细胞均出现典型自噬细胞形态学改变。与对照组相比,诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组和仅在诱导中应用阿托伐他汀组的自噬泡占胞质总面积的比值均明显降低(P<0.01)。诱导前应用阿托伐他汀组的该比值低于对照组,无明显差异(P>0.05)。诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组的该比值低于仅在诱导中应用阿托伐他汀组,无明显差异(P>0.05)。结论阿托伐他汀可以抑制血管内皮细胞自体吞噬,这一作用可能与阿托伐他汀改善血管内皮功能的机制有关。

干细胞移植治疗病态窦房结综合征

病态窦房结综合征是指窦房结及其周围组织病变和功能减退而引起一系列心律失常的综合征。传统的治疗方法是植入电子起搏器,随着分子生物学技术的发展,生物起搏为病态窦房结综合征的治疗开辟了一个全新的领域。生物起搏是指利用细胞分子生物学及其相关技术对受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代,使心脏的起搏和传导功能得以恢复。生物起搏包括基因生物起搏,细胞生物起搏和基因工程干细胞生物起搏。现就干细胞移植用于治疗病态窦房结综合征的研究取得的进展与存在问题做一综述。

不同剂量阿托伐他汀对内皮前体细胞的动员

目的:探讨不同剂量的阿托伐他汀在不同时相对内皮前体细胞(EPC)的动员作用。方法:将雄性新西兰兔随机分为4组:正常对照组、阿托伐他汀2.5mg、5mg、10mg组。用药后1、2、3、4周分别测量外周血EPC含量。用流式细胞仪计数EPCs,PE-CD34／FITC-CD133双阳性细胞为EPC；荧光显微镜鉴定FITC-UEA-1/Dil-acLDL双染色阳性细胞为EPC。用药第3周测血清一氧化氮(NO)、血脂。结果:用药后1、2、3、4周四组外周血EPCs的曲线:正常对照组为一低水平基线；阿托伐他汀5mg组、阿托伐他汀2.5mg组(按作用从大到小排列)为锯齿样曲线,第二周最低,第三周最高,第四周较第三周低；阿托伐他汀10mg组与正常组接近,仅第四周增高(P<0.05)。阿托伐他汀5mg组对EPCs有持续动员作用,于第三周时效果最佳,约为第一周的3倍,是正常组的近20倍；阿托伐他汀2.5mg组在第三、四周有作用。在第四周,三个用药组EPCs均较正常组高,且用药三组间无统计学差异。与正常组相比,阿托伐他汀5mg组血清NO增高,阿托伐他汀10mg组NO降低。各组血脂均在正常范围内。结论:不同剂量阿托伐他汀对EPCs均有动员作用,其效果为:5mg组>2.5mg组>10mg组。阿托伐他汀5mg组在第三周效果最佳。阿托伐他汀对EPCs的动员可能与NO有关。

应用siRNA抑制神经胶质瘤C6细胞受体表达的探讨

目的构建编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA的短发夹RNA真核表达载体质粒,研究体外培养的哺乳细胞中siRNA抑制靶基因表达的有效性,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备。方法根据大鼠AT1受体mRNA序列设计并合成siRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1。用构建完成的pGenesil-1-siRNA质粒和重新洗牌的对照质粒转染大鼠胶质瘤细胞,并在不同时相收集转染的细胞,进行RT-PCR和Westernblot检测。结果AT1R基因短发夹RNA抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似。与对照组比较(100%),在转染后48h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到35.5%±3.0%,72h后达到最低点(20.7%±4.0%)。而与对照组相比,血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24h和48h分别减少至46.9%±4.2%和37.0%±3.7%,最大减少在转染后72h(28.1%±4.0%)。结论成功地构建了编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA的短发夹RNA真核表达载体后,在体外转染哺乳细胞中表达siRNA可有效地抑制靶基因的表达,并导致其蛋白的翻译受到抑制,达到基因干扰的目的。为利用RNAi从转录后水平对心血管疾病进行治疗做有益的探索,为进一步研究基因沉默在自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础。

热量限制对老龄大鼠血清SOD及MDA的影响

目的研究热量限制对老龄大鼠血清SOD及MDA的影响,为完善人类健康的饮食方式提供实验基础。方法45只24月龄雌性健康SD大鼠随机分成3组:对照组(正常饮食组)、1∶1组(隔日喂养组)、5∶2组(进食5d,禁食2d组)。不同饮食方式干预3月后采集标本,测定大鼠血清SOD活性和MDA含量。结果与对照组相比较,1∶1组和5∶2组SOD活性显著增高(P分别<0.01,<0.05),MDA含量均显著降低(P<0.01)。1∶1组与5∶2组相比较,SOD活性及MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论对老年大鼠进行热量限制,能明显提高SOD活性,降低MDA含量,改善氧化应激水平。

同型半胱氨酸对外周血内皮前体细胞的影响及粒细胞集落刺激因子的干预作用

目的观察高蛋氨酸饮食对外周血内皮前体细胞数量的影响及粒细胞集落刺激因子对该影响的干预作用。方法雄性新西兰兔随机分为四组:正常对照组、同型半胱氨酸组、粒细胞集落刺激因子组、同型半胱氨酸+粒细胞集落刺激因子组。正常对照组及粒细胞集落刺激因子组普食,同型半胱氨酸及同型半胱氨酸+粒细胞集落刺激因子两组饲以1%蛋氨酸饮食,粒细胞集落刺激因子及同型半胱氨酸+粒细胞集落刺激因子组予以粒细胞集落刺激因子50μgd,腹腔注射。观察1、2、3、4、8、12周外周血内皮前体细胞数量的变化。第12周测血清一氧化氮、同型半胱氨酸。结果①外周血内皮前体细胞数量变化:正常对照组基本稳定于低水平;粒细胞集落刺激因子组相对稳定于高水平;同型半胱氨酸组前4周呈下降趋势,第8、12周升高,但与正常对照组无统计学差异;同型半胱氨酸+粒细胞集落刺激因子组呈下降趋势,前2周高于正常对照组(P<0.01),第2周开始低于粒细胞集落刺激因子组(P<0.01)。②血清一氧化氮值:同型半胱氨酸组低于正常对照组(P<0.01),而同型半胱氨酸+粒细胞集落刺激因子组高于同型半胱氨酸组(P<0.05)。③血清同型半胱氨酸值:同型半胱氨酸组和同型半胱氨酸+粒细胞集落刺激因子组显著高于正常对照组和粒细胞集落刺激因子组(P<0.01)。结论同型半胱氨酸开始使内皮前体细胞下降,随后升高;并可致血清一氧化氮下降。粒细胞集落刺激因子前2周可升高同型半胱氨酸组内皮前体细胞,以后不增高;并可拮抗同型半胱氨酸引起的一氧化氮下降。粒细胞集落刺激因子改善同型半胱氨酸引起的内皮功能损害,可能与其动员内皮前体细胞有关。粒细胞集落刺激因子对血清同型半胱氨酸无影响。

血浆必需氨基酸浓度与细胞自噬程度相关性分析

目的探讨血浆必需氨基酸浓度对细胞自噬程度的影响。方法老龄大鼠按体重随机分为A组(正常饮食对照组)、B组(1d自由饮食1d禁食)、C组(5d自由饮食2d禁食)3组,每组10只。饲养5个月后活体状态下取1mm3肝脏组织4℃保存;心脏采血,经抗凝、离心、去蛋白后取上清液-70℃保存。透射电镜观察各组肝脏细胞自噬泡的数量;高效液相色谱法(HPLC)检测各组血浆必需氨基酸含量;Spearman秩相关分析两者之间的相关性。结果与A组相比,B组和C组自噬泡占细胞质总面积的比值均明显提高(P<0.01),而两组间该比值差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示缬氨酸浓度与细胞自噬程度的相关性最大(r=-0.779,P<0.001);赖氨酸的相关性最小(r=-0.517,P<0.01)。结论某些血浆必需氨基酸的浓度与细胞自噬的程度呈负相关,通过调节血浆氨基酸的水平来调控细胞自噬程度将是细胞自噬在临床应用中的一个方向。

四种无创性检查与冠脉造影诊断冠心病的对照研究

四种无创性检查与冠脉造影诊断冠心病的对照研究山西省心血管疾病研究所（０３０００１）李保刘卓敏王绪太李运乾邱龄梁峰温静霞王惠仙芦丽芳目前临床诊断冠心病的检查方法仍以无创性检查方法为主，这些方法的可靠性有限，都存在一定的假阳性和假阴性，并且各种文献报道其...

冠状动脉内支架置入术对复杂性冠脉病变的治疗作用

探讨经皮冠状动脉腔内支架置入术治疗复杂性冠状动脉病变的疗效。对６１例６９支病变冠状动脉置入支架７２枚。置入前降支４５枚、回旋支５枚、右冠脉２２枚。结果：术后经冠脉造影证实疗效满意，支架置入的成功率为１００％，术后１例发生亚急性支架血栓形成，１例出现穿刺部位出血。结论：经皮冠状动脉内支架置入术治疗复杂性冠状动脉病变是一种安全有效的介入性治疗技术，其成功率高。

饮食限制对老龄大鼠寿命生存曲线的影响

目的观察不同饮食方式下老龄大鼠发生细胞自噬的差异,分析其自然寿命及生存曲线,探讨其抗衰老的生物学效应及机制。方法 45只24月龄雌性健康SD大鼠随机分成三组:对照组、隔日禁食组和两日禁食组。不同饮食方式干预第85天采集标本。透射电镜观察肝脏细胞自噬泡并对细胞的自噬活性进行定量分析;对各组自然死亡大鼠绘制生存曲线,进行生存分析;对细胞自噬活性和大鼠生存时间进行关联性分析。结果隔日禁食组和两日禁食组大鼠肝脏细胞自噬泡占胞质总面积的比值以及生存率与对照组比较增高,差异均有统计学意义(P<0.01),而此两组间差异无统计学意义。细胞自噬活性和大鼠生存时间之间呈线性正相关(rs=0.903,P<0.01)。结论细胞自噬呈高活性状态有利于大鼠寿命的延长;饮食限制导致寿命延长与细胞自噬相关。