鹅呼肠孤病毒GRV1株分离鉴定及其σC基因特征性分析

从患运动障碍的雏鹅肝脏和脾脏分离到一株鹅源呼肠孤病毒,该病毒经琼脂扩试验可与番鸭呼肠孤病毒(MuscovyDuckReovirus,MDRV)的抗血清发生交叉反应,推测其为呼肠孤病毒,命名为GRV1。参考GenBank禽呼肠孤病毒(AvianReovirus,ARV)和番鸭呼肠孤病毒小外壳蛋白(minorcoreprotein)σC蛋白基因序列设计合成了一对引物,病毒RNA经RT-PCR扩增,产物为810bp,与预期的目的片断大小一致,测序结果表明σC基因在280～1089区间是一个开放性阅读框架,编码269个氨基酸的蛋白,GC含量为49.88%,等电点为6.497,分子量为29.4Ku。核苷酸序列经DNAStar(6.0)软件分析,与法国番鸭呼肠孤病毒89026株核苷酸同源率为93.0%,与鸡呼肠孤病毒σC基因同源率仅为21%～25%,同源性分析表明鹅呼肠孤病毒与番鸭呼肠孤病毒可能来自同一祖先,建议将鹅呼肠孤病毒连同番鸭呼肠孤病毒归属为正呼肠孤病毒属第二个亚群中不同于禽和内尔森贝海湾呼肠病毒的独立基因群。由蛋白质分析软件Anthepro5.0和MultiCoil软件分析表明,抗原区多位于N末端,没有跨膜区,σC为三股螺旋结构,这是我国第一次在鹅体内分离到呼肠孤病毒,同时也是第一次在数据库中提供σC的序列。

鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的表达及抗原性鉴定

为了对多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(OmpH)的免疫学活性进行鉴定,本研究根据已发表的Pm70株序列(AE004439)设计了两对引物,用PCR方法扩增了鸭多杀性巴氏杆菌C48-102株的Omp H,扩增片段为1180bp(ORF为1056bp)。Omp H与GenBank中登录的C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D的序列比对结果表明:Omp H在核苷酸水平上同源性为82.8%～99.2%;在氨基酸水平上同源性为82.1%～99.1%。扩增去信号肽的Omp H基因,构建了原核重组表达质粒pHT-Omp H,转化BL21并诱导表达,SDS-PAGE结果表明:表达蛋白约为41ku,与预期的分子量大小相符;western blot结果表明具有良好的免疫学活性,这为以重组OmpH蛋白建立针对鸭Pm的血清学检测方法奠定了基础。

番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在sf-9昆虫细胞中的表达

采用RT-PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因,将其克隆到pFastBacHTA载体上,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC;将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR筛选,获得重组转座子rBacmid-σC。在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBV-σC;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,在sf-9细胞中表达了分子质量约37 ku的σC蛋白,该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应,这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础。

猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达

参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1-6中分别扩增出NS2长1389 bp和876 bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃,1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为40 ku处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带。Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,该表达产物主要存在于包涵体中。上述结果为NS2基因表达产物在免疫检测中的进一步应用奠定了基础。

鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析

本研究采用PCR技术扩增了鹅和番鸭全长细小病毒基因;其中鹅和番鸭细小病毒非结构蛋白基因(NS)全长为1884bp,编码627个氨基酸;结构基因(VP)全长为2199bp,编码732个氨基酸;序列分析表明:鹅和番鸭细小病毒NS之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.9%～82.9%和89.5%～91.2%,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为93.7%～99.8%和96.8%～99.7%,番鸭细小病毒之间的同源性为98.8%～99.8%和98.6%～99.5%;在核苷酸和氨基酸水平上,鹅和番鸭细小病毒VP1之间的同源性分别为79.7%～88.7%和85.5%～93.3%,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为88.8%～99.6%和91.5%～99.2%,番鸭细小病毒之间的同源性为98.1%～99.6%和97.1%～98.8%;番鸭和鹅细小病毒NS和vp1基因的系统进化树分析表明:番鸭和鹅呼细小病毒来自共同的祖先,但随着宿主的不同而演化为不同的分支。

国内部分地区多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究

为了解国内部分地区不同动物多杀性巴氏杆菌(P.multicida)流行情况,本研究以36株P.multicida为研究对象,通过多重荚膜PCR、多位点序列分型(MLST)和脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)对其荚膜型和基因型进行鉴定。采用多重荚膜PCR方法将36株细菌的荚膜血清型分为A、B和D 3种,其中禽源P.multicida主要以A为主;以LPS-m PCR方法将P.multicida分为L1、L2、L3和L6 4种LPS基因型,禽源P.multicida主要为L1型;通过MLST技术将P.multicida分为ST-129、ST-8、ST-58、ST-5、ST-13、ST-50和ST-122 7种ST型,禽源P.multicida主要为ST-129型。本研究为P.multicida的流行病学监测和基因多样性提供了技术支撑。

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)Henan株的分离与全基因组序列分析

用PCR方法从河南某猪场送检的1头疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的腹股沟淋巴结中检测到了猪Ⅱ型圆环病毒（porcine circovirus type2，PCV2）核酸。将该病料研磨、过滤除菌后接种无PCV1和PCV2污染的PK-15细胞，盲传12代后，用PCR方法仍然能够在接种细胞中检测到PCV2核酸。从接种细胞中收获病毒，经超速离心纯化后电镜负染观察．可见直径约17nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子，表明从发病猪中分离到了PCV2，将该毒株命名为PCV2Henan株。序列分析表明：该株病毒全基因组长1767bp，包含11个读码框，与PCV1同源性为76．2％～77．3％，与其他PCV2株的同源性为95．5％～99．6％。

以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳σC蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,获得了重组质粒pET32a-σC,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞后,经SDS-PAGE和Western-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15 mmol/L IPTG诱导,5 h后融合蛋白σC表达量可达高峰,分子质量为50ku;融合蛋白纯化后被用作包被抗原,建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA,经对检测条件优化,最佳包被浓度为5μg/mL,标准阳性血清的最适稀释倍数为1∶40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测,与琼脂扩散抗体检测法相比,ELISA具有良好的特异性和敏感性。

产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

为快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌毛(K88和K99)和毒素(STa)基因,本研究设计合成了针对K88、K99和STa基因的3对特异性引物,对K88、K99和STa基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、K99和STa的多重PCR方法。该方法对K88、K99和STa基因的扩增产物分别为237 bp,314 bp和166 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的多重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的多重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果 2株为K99/STa阳性,1株为STa阳性。

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组（S1-4）中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明：鸭呼肠孤病毒（DRV）与禽呼肠孤病毒（ARV）的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76．0％～77．1％和78．4％～79．6％，氨基酸同源性分别为89．5％～91．2％和91.6％～92．7％；而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60．3％～64．4%和2．7%～9．9％，氨基酸同源性分别为61．4％～62．0％和22．6％～26．7％；DRV和ARV抗原性存在差异。而DRVS12／S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90．0％、93．6％、87．9％～88．0％和93．1%，氨基酸同源性分别为97．1%、94．3%、95．7%～95．9%和93．7％。进化树分析表明，DRV与ARV形成不同的分支，DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。

3株鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因VP1的克隆及序列分析

通过RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒DHV-1：161/79/V、YH、HN株的VP1基因的核苷酸序列。系统发育分析表明,3株病毒与已发表的DHV-1结构基因VP1核苷酸和氨基酸的同源性分别为92.7%~96.9%和95.4%~96.6%,与DHV-1变异株核苷酸和氨基酸序列的相似性均分别低于75%和88%,表明3株病毒属于DHV-1,与变异株是不同的血清型。强毒DHV-1：161/79/V的VP1蛋白第49和第183位氨基酸为T和H,弱毒DHV-1：YH、HN为S和Q,推测这2处位点的改变可能与病毒的强弱有关 DHV-1和其变异株的VP1蛋白均没有保守的RGD序列 变异株N-DHV：90D、04G在第50和51位比DHV-1多2个氨基酸（Q和D）,在第147和185位各缺失1个氨基酸（E和L）,而在变异株DHV：AP-03337、AP-04009、AP-04114、AP-04203的第145和146位比DHV-1多了2个氨基酸（G、G） 不同血清型的鸭肝炎病毒在46-64位、95-149位、180-223位抗原指数差别较大,推测这些位点的改变可能影响病毒的生物学特性。

犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究以纯化的犬细小病毒(CPV)重组VP2蛋白为包被抗原,建立了检测CPV抗体的间接ELISA方法,其抗原包被浓度为0.158μg/mL;待检血清稀释倍数为1∶100,作用时间为60min;羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1∶2000,作用时间为60min;底物作用时间为10min;判定标准为S/P≥0.282时为阳性,S/P≤0.226时为阴性。该方法与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬副粘病毒病、犬波特氏杆菌病等4种犬常见传染病阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于15%,显示该方法具有良好的重复性;与商品化CPVELISA试剂盒进行比较,符合率为96.5%。本研究为现地免疫犬群抗体监测和进行CPV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314bp;最终确定dNTP终浓度0.4mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。

嵌合猪圆环病毒PCV2-1感染性克隆的构建

根据GenBank中发表的猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)的核苷酸序列,设计3对特异性引物。通过PCR方法,以引物P1和P2从接毒细胞中扩增到猪型圆环病毒(PCV2)全基因组,克隆入pBluescriptⅡ SK(+)载体构建质粒SK-PCV2,以之为模板,用引物P5和P6扩增不包含PCV2-ORF2的部分基因(SK-PCV2△ORF2);另一对引物P3、P4用于特异性扩增猪型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,与前面得到的SK-PCV2△ORF2基因连接,构建嵌合型质粒SK-PCV2-1,以此为基础构建双联体质粒SK-PCV2-1(DB)。体外转染PK-15细胞,盲传4代后,用RT-PCR和间接免疫荧光方法检测,结果表明本试验构建的嵌合病毒PCV2-1克隆具有感染性。

猫杯状病毒的分离鉴定及超变区基因序列分析

为了解猫杯状病毒(FCV)的生物学特性,本研究对猫体内分离到的一株FCV HRB-SS株进行了病毒学、分子生物学鉴定和遗传学分析。结果显示该分离株能够在猫肾细胞系(CRFK)中产生明显的细胞病变,形成蚀斑。FCV的VP1基因超变区核苷酸序列分析结果显示,HRB-SS分离株与疫苗株CVXPOLYCAP同源性最高,为78.2%,而与中国分离株CH-JL和GD的同源性最低,仅为67.9%和68.8%;推导氨基酸序列分析结果显示,HRB-SS分离株与12Q087-5、UTCVM-NH12和FCLF4的同源性最高,为86.7%,而与中国分离株的同源性仅为73.9%。系统发育树分析结果显示,HRB-SS分离株与中国分离株亲缘关系较远。本研究结果表明,FCV HRB-SS与我国FCV具有不同的遗传起源。

某种猪场猪疥螨感染情况调查及治疗试验

采用显微镜直接检查法和虫体浓集法，对河南某种猪场的保育猪、育肥猪和种母猪疥螨感染情况进行了调查，结果其感染率分别为55．0％、67．2％和40．0％，平均感染率为58．82％。分别应用1％伊力佳、阿力佳注射剂按0．3mg／kg体重1次皮下注射，或预混剂按1．5kg／t料混饲连喂1周或2周、或按2kg／t料混饲连喂1周对疥螨病猪进行治疗，用药后15d，螨虫转阴率均达100％，平均病变记分减少率为84．83％（81．6％～88．4％），表明上述2种药物不同剂型和用法、用量对猪疥螨病均具有良好疗效。建议规模化猪场使用1％阿力佳预混剂，按1．5kg／t料，混饲连喂1～2周防治猪疥螨病。

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。

仙台病毒F基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达及抗原性分析

为真核表达仙台病毒(SeV)融合蛋白(F)基因,本研究根据GenBank登录的SeV F基因序列设计合成一对特异性引物,以pMD18-T-F阳性重组质粒为模板扩增F基因,并将其克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac HTa中,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆粒rBacmid-F,经PCR鉴定正确将rBacmid-F转染Sf9细胞,连续传代后,细胞病变明显。经SDS-PAGE分析,成功表达了相对分子量为65ku左右的F蛋白,western blot和ELISA分析表明重组F蛋白具有良好的抗原性。

口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达

将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。

表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK^-/gG^-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z+ 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。