乙型肝炎病毒基因分型及其应用的研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)基因分型作为HBV感染的分子流行病学调查,鉴定传染源,确定传播关系及发病机制和临床流行病学研究的一种有力工具,日益受到广泛重视。随着HBV基因分型方法的日趋完善及新基因型的发现,人们对HBV基因型有了进一步认识。本文就HBV基因型的分型和地理分布,HBV基因型与血清亚型的关系,HBV 基因型和变异的关系及与临床治疗和转归的关系等相关研究进展作一综述。

三种猪病相关microRNAs的研究

本实验旨在探索繁殖与呼吸综合征(PRRS)、口蹄疫(FMD)和传染病胃肠炎(TGE)感染猪的micro RNA(mi RNA)变化,为疫病监测提供新途径。采用生物信息学方法预测可能的相关病毒mi RNA,在MARC-145细胞系中转染10种mi RNA mimic和inhibitor。相关实验结果发现过表达mi R-125b、mi R-147和mi R-181降低了PRRSV的繁殖,而敲低mi R-125b、mi R-147和mi R-181能促进PRRSV复制;感染猪口蹄病毒的样本中let-7a表达量明显上升,而mi R-146b表达量明显下降;对照组中mi R-142的表达量高于患有传染性胃肠炎样品。说明相关micro RNAs可能参与病毒调控,可用作检测参考指标。

多表位丙型肝炎病毒抗原的表达和分析

目的目前常用的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)血清学检测试剂都基于3~6个重组蛋白或合成多肽,抗原制备繁琐且诊断效果参差不齐。制备一种诊断效能优良的HCV抗原势在必行。方法利用原核表达系统和层析纯化技术制备涵盖我国HCV主要流行株(1b和2a)的6个免疫显性区域的多表位HCV抗原(命名为H65),并以此建立HCV-IgG的血清学检测方法,通过对部分HCV阴阳性血清的检测,初步评价了H65抗原的免疫活性。结果融合Trx标签的H65抗原为可溶性形式表达,纯化后蛋白浓度可达2.991mg/ml,纯度为94.53%;Western blot法检测实验初步证实了蛋白H65的抗原性;应用某商品化试剂盒与H65抗原血清检测方法,对50份HCV阴阳性血清进行检测,McNemer检验显示,新制备诊断抗原与“金标准”比较,P>0.05,Kappa>0.75,且与某商品化试剂盒比较,P>0.05,Kappa>0.75,提示一致性优异。结论H65具有良好的免疫活性,为进一步应用多表位HCV抗原为基础的HCV-IgG体外诊断试剂提供了依据。

甲型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的比较

目的比较本实验室内部建立的甲型肝炎病毒核酸定量体系和另外两个商品化实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测效果。方法本实验室内部建立的HAV核酸检测系统选取HAV基因组的高保守区段5'非编码区作为扩增靶点,定量标准品采用体外转录获得的RNA分子,HAV疫苗株储存液倍比稀释成10-8～10-1后提取RNA作为模板用以比较该反应体系与市售商品化试剂盒的准确性、灵敏度以及特异性。结果本实验室内部建立的HAV核酸检测体系十分适宜于HAV的检测,最低检测极限达到10 TCID50/ml,比国内某厂商生产的HAV定量PCR检测试剂要灵敏,然而Qiagen公司的RealArt HAV LC RT-PCR检测试剂效果最好,其检测极限可以达到5 TCID50/ml。结论本实验室内部建立的HAV核酸定量体系可重复性好,敏感度高,特异性强,在临床样本,环境样本以及食品样本的检测方面具有广阔的应用前景。

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立一种活性植物乳杆菌定量检测的PMA-qPCR方法。方法首先进行引物探针特异性验证,优化PMA反应条件,建立标准曲线,验证灵敏度,然后将该方法用于检测人工添加奶粉、米粉、酸奶样品以及冻干样品中的植物乳杆菌。结果最佳PMA浓度为2μg/mL,最佳曝光时间为10 min,建立的PMA-qPCR方法可以快速、高效、特异地检测植物乳杆菌,利用细菌纯培养物与对应Ct值建立标准曲线,可以看出纯培养物浓度与Ct值之间存在对应线性关系,相关系数(r^(2))为0.9992,最低检测限为15拷贝/反应体系,人工添加样品以及冻干样品检测中PMA-qPCR和平皿计数法结果的对数值进行配对t检验,显示在不同的人工添加样本以及冻干样品中均无显著性差异(P>0.05)。结论本研究建立的PMA-qPCR检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量检测活性植物乳杆菌。

乙型肝炎病毒表面抗原基因点突变对HBsAg抗原性的影响

目的研究乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）常见基因点突变对HBsAg抗原性的影响，了解我国目前常用的HBsAg检测试剂对HBVS基因突变株的检测灵敏性，减少漏检，有效控制乙肝病毒（HBV）感染的传播。方法构建HBsAg重组野毒株和重组变异株表达质粒，分别将重组野毒株HBsAg表达质粒pSS1adw2及pSS1adr和重组变异株HBsAg表达质粒pSS1adw2-145Arg、pSS1ad-126Ser和pSS1adr-126Asn转染COS-7细胞，进行瞬时转染。采用市售HBsAg ELISA检测试剂盒对细胞上清进行抗原性检测。结果野毒株HBsAg和两种126位变异株HBsAg具有较好的抗原性；145位点突变后导致HBsAg的抗原性下降。结论推测是由于145位点变异影响了“a”抗原决定簇的空间结构，从而降低了其与抗-HBs的结合能力。

常见乙型肝炎病毒表面抗原突变体的抗原性分析

目的 研究乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原突变株和野毒株对表面抗体结合能力的差异 ,探讨免疫漏检基因变异株的机制及对策。方法 应用基因重组技术构建HBsAg常见基因突变株和野毒株表达质粒 ,分别在COS 7细胞中瞬时表达 ,定量后用常规HBsAg免疫诊断试剂盒检测 ,观察重组抗原与不同抗 HBs的结合能力。结果 T 12 6S变异与单克隆抗体的结合力增高 ,G 145R ,K 141E和 2株三位点同时变异株则明显下降 ,对M 13 3T变异与单克隆抗体的结合力影响不大。变异株与多克隆抗体的结合力也有变化 ,但仍能检测到大部分变异株抗原。结论 “a”抗原决定簇氨基酸的置换影响了HBsAg与抗 HBs的结合能力 ,并且氨基酸的置换位置和特性对抗原性的影响各有不同。因此 ,建议应用HBsAg多克隆抗体或开发研制“免疫逃逸突变株”的特异性抗体 ,以完善HBsAg免疫诊断试剂的抗体组成 。

自发生物素化风疹病毒重组诊断抗原的制备

目的 获取原核表达过程中自发生物素化的风疹病毒（Rubella Virus,RV）重组抗原E1（RV-E1）,并初步评价其抗原性.方法 将2×BirA酶底物（BSP）插入到RV-E1抗原优势表位区域aa 148-295的羧基端,硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX）插入到RV-E1的氨基端,密码子优化后全基因合成;在大肠埃希进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化获取生物素化的RV-E1抗原;利用Western Blotting技术对目的蛋白进行鉴定,并建立风疹病毒IgM抗体检测方法,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.结果 获取高度均质的生物素化的可溶性RV-E1抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被RV-E1抗原和TRX抗原单克隆抗体识别,而且可以被标记HRP的链霉亲和素所识别.分别对50份风疹病毒感染阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.结论 RV-E1诊断抗原携带BSP,可以在大肠埃希菌表达过程中自发共价结合生物素分子,并可以作为新型诊断抗原应用于生物素-亲和素ELISA血清学检测中.

抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备具有中和活性的抗肠道病毒EV71型外壳蛋白VP1的单克隆抗体。方法人工合成SP55和SP70（分别包含VP1的第163～177，208—222位氨基酸）两段VP1的多肽，分别免疫BALB／c小鼠，常规杂交瘤技术进行细胞融合，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价。用分泌的单抗和EV71病毒在RD细胞上进行中和试验以检验其中和活性。结果得到2株能稳定分泌抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，2株单抗的中和效价分别为1：8和1：16。结论成功制备出2株具有中和活性的抗肠道病毒EV71型VP1蛋白单克隆抗体，为其下一步应用打下基础。

人白细胞介素12在哺乳动物细胞中的稳定表达及其生物活性的研究

目的采用遗传基因工程方法获得具有生物活性的人白细胞介素12，探索其治疗肿瘤和慢性肝炎的可行性。方法采用已克隆的国人IL-12基因序列，利用内部核糖体切人位点（IRES）完成IL-12P35、P40双亚基共表达载体的构建，通过转染CHODHFR缺陷细胞，双抗夹心ELISA法筛选阳性克隆，MTX加压扩增，PCR检测其基因整合，T淋巴细胞增殖和诱生γ干扰素实验检测其生物活性。结果获得了稳定高效表达人IL-12的工程细胞系，表达产物为70×10^3左右的糖蛋白。结论本研究得到的基因重组人IL-12具有良好的生物活性，有强的诱导产生γ干扰素的能力和诱导活化T淋巴细胞增殖能力。

一种改良的环介导恒温扩增技术在甲型肝炎病毒核酸检测上的应用

目的建立一种更加快速简便的环介导恒温扩增技术（LAMP）检测甲型肝炎病毒（HAV）。方法本研究通过在传统LAMP的基础上加入加速引物建立了一种改进型的LAMP体系。结果精确性和可重复性实验证实改进后的HAVLAMP检测体系稳定可靠，重复性强，并且较传统的LAMP灵敏度更高，检测极限可以达到5TCID50／ml。当该方法用于甲型肝炎患者急性期血清临床样本的检测时，实验结果与TaqMan实时荧光定量PCR的检测结果一致。结论改进型的LAMP技术有望应用于HAV临床样本检测，同时也适用于HAV流行地区的病原学监测和调查。

乙型肝炎表面抗原不同突变体对细胞免疫的影响

目的 研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)不同突变体对细胞免疫的影响。方法 将野生型和变异型HBsAg基因重组质粒NS2 Swt、NS2 S12 6、NS2 S133、NS2 S14 1、NS2 S14 5分别转染CHO细胞,72h收获细胞上清。采用ELISA法检测各组细胞上清preS2 蛋白的表达量。将这些细胞上清刺激PHA活化的人淋巴细胞,MTS法检测不同变异株抗原对淋巴细胞增殖活性以及淋巴细胞分泌IFN γ、IL 10和IL 2的影响。结果 变异和野毒株(wt)各组细胞上清preS2 蛋白的表达量基本一致。变异和wt重组HBsAg刺激T细胞后,其上清MTS显色后的A4 90 值均高于空白组和pCI neo组,说明HBsAg中的蛋白可以促进T细胞增殖;T12 6S氨基酸变异HBsAg能够刺激IFN γ分泌增加;M133T氨基酸变异刺激IL 10分泌增加。结论 这4种乙型肝炎病毒(HBV)变异株感染人体后,机体对它们的细胞免疫反应可能不会有明显的增强或减弱,但也不能忽视T12 6S和M133T变异抗原改变了某些细胞因子的表达,可能对机体细胞免疫造成的潜在影响。

首次从入境旅客耳内发现病媒生物——血红扇头蜱

2009年2月15日,1名中国籍旅客从首都国际机场入境后出现头痛耳鸣等身体不适症状,自行前往航天中心医院就诊,该院医生从其耳内取出1只活体小虫。2月16日经北京出入境检验检疫局医学媒介检测实验室鉴定,该虫为蜱类。后经军事医学科学院微生物流行病研究所请许荣满教授鉴定,结果为血红扇头蜱若蜱。流行病学调查结果显示,该旅客是由马来西亚旅游回国,而血红扇头蜱是马来西亚常见蜱种。这是一起典型的有害生物入侵案,如未及时发现,极有可能造成病原体的输入和外来生物的扩散,口岸检验检疫部门应引起高度重视。

李斯特菌属荧光定量PCR检测方法的建立

目的采用荧光定量PCR技术,建立可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌的快速检测方法。方法选取单增李斯特菌hlyM基因和李斯特菌属23Sr DNA基因为靶基因,分别设计引物和探针,在构建二者的阳性重组质粒基础上,对李斯特菌属和单增李斯特菌进行荧光定量PCR的检测。结果建立的李斯特菌属和单增李斯特菌单重荧光定量PCR检测方法与双重荧光定量PCR的检测方法敏感度一致,分别为18.6拷贝/μl和23.2拷贝/μl。结论建立的双重荧光定量PCR方法可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌。

程序死亡蛋白1基因的克隆及原核表达

目的克隆人程序死亡蛋白（PD-1）基因并构建PD-1蛋白的原核表达质粒，在大肠埃希菌中进行表达。方法用RT-PCR的方法从慢性乙肝患者外周血淋巴细胞总RNA中逆转录得到PD-1基因的eDNA，构建PD-1基因的原核表达质粒，在大肠埃希菌BL21（DE3）中进行表达并纯化。用SDS-PAGE、DNA测序、氨基酸测序等方法对表达蛋白进行鉴定。结果克隆到PD-1基因编码区全长序列eDNA，经DNA测序与已报道的序列同源性达99.8％。构建得到PD-1的原核表达质粒，并在大肠埃希菌中表达，纯化获得纯度较高的PD-1蛋白。氨基酸测序证明表达蛋白的正确性。结论成功克隆人PD-1基因，在大肠埃希菌中获得表达，得到纯化的PD-1蛋白，为进一步研究PD-1蛋白的功能及应用打下基础。

两种嵌合乙型肝炎病毒preSl中和表位的乙肝核心病毒样颗粒的制备与抗原性分析

目的构建嵌合preSl2147位氨基酸（aa）、以全长乙肝病毒（HBV）核心抗原（HBcAg）为骨架的病毒样颗粒H2和嵌合preSlaa37-45、以截断HBcAg为骨架的病毒样颗粒H3，并对比其抗原性。方法将HBVadr血清型preSl中和表位aa2147和aa37-45分别插入到全长HBc（aa1—183）和截断HBc（8a1—144）的第78位天冬氨酸和第79位脯氨酸之间，密码子优化之后全基因合成，目的片段经双酶切（NdeI和XhoI）回收后连接到同样处理的pET43．1a载体上，在大肠埃希菌E．coliBL21（DE3）中表达，精细纯化后通过电镜观察蛋白形态、ELISA以及WesternBlott检测其抗原性。结果成功构建表达质粒H2和H3，并在BL21（DE3）中高效表达和自发组装成病毒样颗粒。纯化后电镜观察H2和H3形态为二十面体立体对称样病毒样颗粒，H2为实心颗粒，直径为（31．61±1．27）nm，H3为空心颗粒，直径为（28．46±1．16）nm。统计分析可得H2直径要比H3直径大（P〈0．01）。ELISA和WesternBlott检测结果证实其插入表位preSl以及载体蛋白HBc的抗原性。结论成功获得两种嵌合HBVpreSl中和表位的病毒样颗粒，为其在疫苗研究中的应用探索奠定基础。

重组风疹病毒外膜蛋白E1的表达及其在血清学中的初步应用

目的在大肠埃希菌中表达重组风疹病毒外膜蛋白E1，用其作为包被抗原，建立一种用于诊断风疹病毒感染的ELISA检测方法。方法通过基因重组的方式构建表达质粒并在大肠埃希菌中表达风疹病毒外膜蛋白E1，蛋白纯化后作为包被抗原，用ELISA的方法检测世界卫生组织（WHO）的风疹检测质控血清以及来自广西桂林的未知血清样本。结果采用WHO用于风疹检测的质控血清对所表达的重组抗原的抗原性进行鉴定，通过试验，特异性、敏感性均为100％。用表达的抗原对来自我国广西的200份未知血清样本进行风疹病毒外膜蛋白抗体的检测，阳性率为93％，与文献报道的我国其他地区风疹病毒抗体阳性率基本一致。结论通过实验我们表达了具有良好抗原性的风疹病毒外膜蛋白E1，为进一步研究风疹病毒感染的实验室诊断技术奠定了基础。

诊断用丁肝抗原的基因优化及其蛋白表达、纯化和鉴定

目的获取有生物活性的丁肝抗原蛋白，探讨其作为诊断试剂的应用价值。方法经密码子优化，合成人工编码的丁肝抗原基因序列；以M48作为表达载体，构建带有硫氧还蛋白的重组表达质粒；在大肠埃希氏菌中经IPTG诱导表达；以亲和层析纯化并以ELISA鉴定该蛋白。结果酶切鉴定构建的质粒正确；SDS—PAGE结果显示表达和纯化的外源蛋白与预期相对分子质量大小一致；ELISA鉴定该蛋白有与丁肝抗体特异性结合的活性。结论成功获得有生物活性的可供诊断用的丁肝抗原蛋白，为丁肝诊断试剂的研发奠定了基础。

肝病毒表面抗原“a”决定簇病毒样颗粒的构建和鉴定

目的 构建一个以乙肝核心抗原为骨架的病毒样颗粒,乙肝表面抗原＂a＂决定簇呈现在该病毒样颗粒的表面.方法 乙肝adr血清型的HBsAg蛋白＂a＂抗原决定簇（aa139～148,CSKPTDGNCT）插入到HBcAg的第78位天冬氨酸和第79位脯氨酸之间,密码子优化之后基因合成,酶切后连接到表达载体上,在大肠埃希菌中进行表达,纯化后对蛋白进行电镜观察、ELISA检测抗原性、免疫兔后检测免疫原性.结果 构建得到预期的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化后电镜观察为病毒样颗粒,ELISA检测证实具有良好的抗原性和免疫原性.结论 成功获得预期的带乙肝表面抗原＂a＂决定簇的病毒样颗粒,为其应用奠定基础.

表位依赖型急性期戊型肝炎诊断抗原的制备与抗原性分析

目的原核表达制备表位依赖型戊型肝炎诊断抗原，并对其抗原性及其在急性戊肝诊断的性能进行评价。方法以包含密码子优化的GST、HEV优势表位的H15质粒为模板，PCR获取GST-HEV优势表位片段，将其插人表达质粒pET43．1a中，在大肠杆菌中进行表达；利用亲和层析和阴离子交换层析纯化目的蛋白；利用Western Blotting技术对目的蛋白抗原性进行鉴定；建立HEV-IgM抗体检测ELISA方法，初步评价其对阴、阳血清样本的鉴别能力。结果获取高度均质的表位依赖型急性戊肝诊断抗原；WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别，还可以被戊肝急性期血清相应抗体所识别；分别对60份戊肝急性期血清、阴性血清进行检测，发现其与临床和实验室诊断结果一致性较高。结论原核表达与层析纯化可以获取抗原性优异的表位依赖型急性戊肝诊断抗原，偶联HRP后可应用于HEV-IgM ELISA血清学检测。