两种AH100-ATS高压均质机在汉逊酵母细胞破碎中适用性的研究

目的 评价150型AH100-ATS高压均质机和40型AH100-ATS高压均质机在汉逊酵母细胞破碎中的适用性。方法 用2种AH100-ATS高压均质机分别重复破碎3组汉逊酵母,每组细胞破碎3次,光学显微镜下观察并比较2种高压均质机破碎汉逊酵母细胞前后的形态;SDS-PAGE电泳检测破碎后细胞中目的蛋白的释出;血球计数板计数且计算破碎后的细胞破碎率;Bradford法检测及计算蛋白释出度;计时破碎所需要的时间。结果 光学显微镜下,2种高压均质机破碎汉逊酵母细胞前后的细胞形态均可见明显差别;150型AH100-ATS高压均质机破碎汉逊酵母细胞后释出蛋白的粒径分布体积比高于40型AH100-ATS高压均质机,差异有统计学意义(P<0.05);SDS-PAGE电泳结果显示,150型AH100-ATS高压均质机破碎汉逊酵母后目的蛋白的灰度值高于40型AH100-ATS高压均质机,差异有统计学意义(P<0.05)。150型AH100-ATS高压均质机破碎汉逊酵母细胞3次后,细胞破碎率分别为24.16%、35.63%、48.67%,总细胞破碎率为65.70%;蛋白释出度分别为41.69%、38.29%、15.80%,破碎完成后总蛋白释出度为62.63%;平均使用时间分别为16.7、16.7、19.0 min,破碎完成后总时间为52.3 min。40型AH100-ATS高压均质机破碎破碎汉逊酵母细胞后细胞破碎率分别为16.10%、11.40%、28.78%,总细胞破碎率为58.41%;蛋白释出度分别为24.72%、21.04%、9.57%,破碎完成后总蛋白释出度为55.48%;平均使用时间分别为61.0、59.7、60.7 min,破碎完成后总时间为181.3 min。每次破碎的细胞破碎率、蛋白释出度、所需时间,以及总细胞破碎率、总蛋白释出度、总破碎时间,2种高压均质机差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 150型AH100-ATS破碎汉逊酵母的释出蛋白的粒径分布体积比、目的蛋白、细胞破碎率和蛋白释出度均高于40型AH100-ATS,150型AH100-ATS破碎所需的时间远少于40型AH100-ATS。150型AH100-ATS高压均质机可以用于中试大规模研究中汉逊酵母细胞的破碎,且较40型AH100B-ATS高压均质机破碎需要更短的时间,且具有更好的破碎效果。

两种汉逊酵母细胞高压匀浆破碎方式的比较

目的比较分步和循环2种高压匀浆破碎方式对汉逊酵母细胞的破碎效果,以期为今后汉逊酵母细胞工业化规模生产破碎方式的选择提供实验依据。方法采用分步和循环2种高压匀浆破碎方式对3批汉逊酵母细胞浓缩发酵液进行破碎,取破碎前后样品,置光学显微镜下观察细胞形态,检测宿主蛋白含量、细胞破碎率、蛋白释出度、释出蛋白粒径分布等指标,并进行比较。结果分步和循环破碎2种高压匀浆破碎方式破碎3批汉逊酵母细胞浓缩发酵液后,完整细胞数量减少,细胞碎片增多,但细胞形态未见明显差异;宿主蛋白含量(平均灰度值分别为115.259和109.125)、细胞破碎率(均值分别为60.29%和58.96%)、蛋白释出度(均值分别为39.55%和37.28%)、释出蛋白粒径分布(分步方式破碎后释出蛋白粒径平均分布在90.41和525.07 nm处,分别占样品蛋白含量的31.37%和68.63%;循环方式破碎后释出蛋白粒径平均分布在109.11和547.37 nm处,分别占样品蛋白含量的29.93%和70.07%)的差异均无统计学意义(F分别为1.054、1.159、4.245、8.875,t分别为1.0360、0.5041、0.6050、0.1397,P均<0.05)。结论循环和分步2种高压匀浆破碎方式对汉逊酵母细胞的破碎效果相当,但循环破碎方式更简便,且可避免污染风险,更适用于工业化规模生产汉逊酵母细胞的破碎。

国产碟式离心机在规模化生产中酵母发酵液菌体分离纯化适用性的研究

目的 探究国产碟式离心机在规模生产中酵母发酵液菌体分离纯化工艺中的效果,摸索国产碟式离心机对酵母发酵液菌体分离纯化的适用性。方法 检测离心过程中上清液A_(600 nm)值,判断离心工艺分离的效果;检测离心后菌体固含量,评价离心效果是否满足菌体分离的要求;通过计算最终菌体回收率来判断在国产碟式离心机离心过程中菌体可能的损耗;对比国产碟式离心机和大容量离心机离心工艺时间,以菌体固含量和菌体形态检测等指标评价国产碟式离心机在生产规模中的适用性;对比国产碟式离心机离心前后酵母形态的完整性,评价碟式离心机剪切力对酵母分离纯化的影响。结果 国产碟式离心机和大容量离心机离心后酵母发酵液的上清液A_(600 nm)值差异无统计学意义(P=0.053 3,P>0.05);国产碟式离心机离心后菌体固含量均>80%,接近大容量离心机离心后菌体固含量;国产碟式离心机和大容量离心机离心后菌体回收率差异也无统计学意义(P=0.066 4,P>0.05);规模生产中相同体积的酵母发酵液用国产碟式离心机比大容量离心机能够大幅度缩短离心工艺时间,差异有统计学意义(P<0.000 1);国产碟式离心机离心前后酵母形态的完整性结果显示,离心剪切力对酵母几乎没有影响。结论 在酵母发酵液菌体分离中,国产碟式离心机与大容量离心机离心效果接近,但离心纯化时间较短,在规模生产时较适用于本研究中酵母发酵液菌体分离的应用,后续可用于其他规模化生产工艺研究及应用。

响应面法优化高压均质破碎重组汉逊酵母细胞的工艺条件

目的响应面法优化高压均质破碎重组汉逊酵母细胞的工艺条件。方法以均质压力(A)、均质次数(B)、均质酵母质量分数(C)3个因素为影响因素,酵母细胞破碎率(Y)为响应值,应用Design-Expert软件,根据Box-Behnken中心组合试验设计方案,用响应曲面法建立二阶数学模型,确定最佳破碎工艺参数,基于二次多项式回归模型建立设计空间,并进行规模化工艺验证。结果方差分析结果显示,模型P<0.01,且失拟值>0.05,表明模型与检测结果拟合较好。最终获得的操作空间为:均质压力1125~1200 bar,均质次数3~4次,均质酵母质量分数12%。3批重组汉逊酵母细胞发酵液中酵母细胞破碎率均达到65%以上,该值在响应值设计空间范围内。结论响应面法优化的高压均质破碎重组汉逊酵母细胞的工艺具有较好的稳健性和适应性。