自噬相关基因在小鼠月经样模型子宫内膜崩解过程中的动态表达

目的探究小鼠子宫内膜崩解过程中自噬相关基因表达的动态变化。方法建立小鼠月经样模型,孕酮撤退后0 h、8 h、16 h和24 h分别处死小鼠取其双侧子宫组织,通过苏木素伊红(HE)染色观察小鼠子宫组织的形态特征变化,采用蛋白质印迹(WB)检测小鼠子宫内膜崩解过程中LC3B和p62蛋白的表达动态变化,实时定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠子宫内膜崩解过程中Lc3b、p62、Beclin1、Atg3、Atg5和Atg7的mRNA水平变化。结果孕酮撤退后0 h、8 h、16 h和24 h子宫大体颜色逐渐由浅粉色变为深红色,子宫内膜崩解坏死区域逐渐扩大,24 h时蜕膜化的子宫内膜完全崩解坏死。WB结果显示:孕酮撤退后16 h时,p62的蛋白表达水平较0 h和8 h时显著升高(P<0.05),24 h时p62的蛋白表达水平较其他时间点显著升高(P<0.01);LC3B-Ⅰ蛋白在孕酮撤退后0 h到8 h无显著变化(P>0.05),8 h到24 h其表达量显著降低(P<0.05);孕酮撤退后子宫内膜崩解过程中LC3B-Ⅱ的蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。RT-qPCR结果显示:p62 mRNA水平在孕酮撤退后0 h到16 h无显著变化(P>0.05),而24 h时p62 mRNA水平较8 h和16 h显著降低(P<0.05);Lc3b mRNA水平在孕酮撤退后16 h时较0 h和8 h显著上调(P<0.01),而24 h时Lc3b mRNA水平显著低于撤退后16 h(P<0.01);Beclin1 mRNA水平在孕酮撤退后8 h、16 h和24 h的表达较0 h均显著下降(P<0.05),且撤退24 h后Beclin1 mRNA水平相较8 h和16 h显著降低(P<0.01);Atg3、Atg5和Atg7的mRNA水平孕在酮撤退后0 h到16 h无显著变化(P>0.05),而24 h时的mRNA水平显著低于其他时间点(P<0.05)。结论孕酮撤退后,子宫内膜崩解过程中自噬水平下降,提示自噬参与负调控子宫内膜崩解过程。

五子衍宗丸和金匮肾气丸对动物生精功能影响的比较研究

目的:研究五子衍宗和金匮肾气两种经典补肾中药的作用机理。方法:利用白消安小鼠无精子症动物模型,给予两种中药单一和联合灌胃给药78天(2个生精周期),以造模后自然恢复、二甲基亚砜溶媒和正常动物为3种对照。结果:两种中药对睾丸生精能力影响的明显不同表现为,五子衍宗主要作用于睾丸的生精上皮细胞,金匮肾气主要作用于睾丸的间质细胞。结论:两种经典补肾中药均具有较强的、明确的促进生精功能恢复的作用。

五子衍宗丸和金匮肾气丸促进小鼠生精能力恢复基因表达谱的研究

目的:对五子衍宗丸和金匮肾气丸促进无精子症模型小鼠生精能力恢复的睾丸全基因表达谱进行比较分析,获得2中药改善生精能力的差异表达基因。方法:白消安致小鼠无精子症模型灌胃给予五子衍宗丸(生药0.048g/日/只)和金匮肾气丸(生药0.04g/日/只)78天(2个生精周期),以正常动物为对照,通过基因芯片技术进行数据分析。结果:在检测的31722个基因中,给药小鼠与正常对照组比较,有32个共同上调的基因,12个共同下调的基因;五子衍宗丸组均表现为以基因下调为主,金匮肾气丸组均表现为以基因上调为主。利用KEGG进行Pathway分析五子衍宗丸和金匮肾气丸基因表达谱的数据,差异表达基因主要分布于脂肪细胞因子信号通路、细胞周期、MAPK信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、Ecm受体作用、Jak-Stat信号通路、细胞因子-细胞因子受体作用等8个信号通路。结论:两种经典补肾中药均具有较强的、明确的促进生精功能恢复的作用,但对睾丸生精能力的恢复作用明显不同。五子衍宗丸可能通过刺激小鼠的免疫功能,促进生精能力的恢复,而金匮肾气丸通过影响细胞增殖相关的多个信号通路刺激生精细胞的再生。

洗洁精对雄性大鼠生殖功能的影响

目的:评价家庭日常生活用洗洁精对雄性大鼠的生殖毒理。方法:将2种市售民用洗洁精(LB、BM)以1/万、1‰、1%3个剂量溶于饮水中,10周龄SD雄性大鼠自由摄取连续100d,以饮用正常水大鼠为对照组,进行比较分析。结果:LB和BM洗洁精3个剂量下,对动物生长发育和体重均无明显影响,对生殖系统的附睾和会阴复合体组织重量无明显影响,在1%剂量下睾丸组织明显减轻(P(0.05),比对照组分别下降12.3%和11.7%。2种洗洁精在3个剂量下的储精囊和前列腺均水肿,重量明显增加,表现出明显的剂量效应关系;精子功能分析中运动性、精子数目、精子形态等指标,均明显下降(P(0.05～0.0001),且表现出明显的剂量效应关系;睾丸组织形态分析显示LB在1%剂量下生精功能受到明显抑制和阻断。实验结果表明生殖毒性LB强于BM。结论:雄鼠在大剂量长期摄入LB和BM洗洁精可产生明显的生殖毒性作用。

五子衍宗丸对无精子症模型小鼠生精能力恢复作用的基因表达谱研究

目的:研究五子衍宗丸对无精子症模型小鼠生精能力恢复作用的睾丸全基因表达谱。方法:利用白消安无精子症小鼠动物模型,给予五子衍宗丸灌胃给药78天(2个生精周期),以造模后自然恢复、溶媒和正常动物为3种对照,通过基因芯片技术进行数据分析。结果:五子衍宗丸对睾丸生精能力具有明显促进作用,在睾丸全基因表达谱中具有明显调节作用的基因中,差异表达2倍以上的基因842个(占2.65%,上调355个,下调487个),具有较强烈作用的差异表达4倍、5倍以上的上调基因和下调基因分别27个、9个和72个、23个,提示五子衍宗丸在促进生精过程中的基因表达以负向抑制/下调作用为主,以正向促进/上调作用为辅;主要通过对黏附功能、细胞周期、细胞因子-细胞因子受体作用、Hedgehog信号通路、Jak-Stat信号通路、Mapk信号通路、Notch信号通路、Toll样受体信号通路、Wnt信号通路等9个信号通路系统的干预调节实现生精能力提高的效果。结论:五子衍宗丸对无精子小鼠生精能力的恢复作用,主要是对生精干细胞的诱导分化和细胞增殖分裂相关基因的负向下调作用的调节并通过多途径实现的。

小剂量洗洁精对雄性小鼠生殖功能的影响

目的:对现代生活家庭用品洗洁精的雄性生殖毒理作用进行动物实验研究。方法:2种市售民用洗洁精以1/万、1/10万、1/100万的剂量稀释于NIH小鼠饮水中,连续自由摄取30d,以正常饮水动物为对照组,进行比较分析。结果:2种洗洁精在3个剂量下对动物生长发育和体重、心肝脾肺肾5种器官的组织重量、生殖器官重量和精子运动性、精子数目、精子形态等生殖功能指标、睾丸组织形态学等,均无明显不良影响。结论:2种市售民用洗洁精在本实验剂量条件下无不良雄性生殖毒理作用。

摄入不同剂量碘对雄性大鼠生殖系统的影响

目的研究碘过量对雄性大鼠生殖功能的潜在影响。方法离乳雄性大鼠喂饲添加高碘0.5、1、2.5、5倍饲料为实验组,以喂饲正常饲料(碘含量200μg/kg)为对照组,连续130～136 d,观察生殖器官组织和精子质量的变化。结果实验组动物睾丸重量降低且具有剂量效应关系,高碘1倍以上3组降低明显(P<0.05～0.01);精子活动性指标未见明显影响(P>0.05);精子浓度和总数均呈下降趋势,分别降低6.59%、22.53%、17.36%、18.06%,但仅在高碘1倍组降低明显(P<0.05);高碘各组正常精子形态明显降低(P<0.05);高碘5倍组睾丸组织细胞形态可见轻度改变。结论碘过量对大鼠可能具有潜在的雄性生殖毒害作用。

ROS对子宫内膜崩解的作用

为探讨ROS在小鼠月经样模型中的作用,将雌性C57小鼠去势,序惯性的给予雌二醇(E2)或孕酮(P4),模拟增殖期和分泌期,花生油注射至宫腔以人工诱导蜕膜化,将孕酮皮埋管移除以造成孕酮的撤退,建立小鼠月经样模型,并在孕酮撤退前1、3、7h给予抗氧化剂NAC消除ROS,利用大体变化、阴道细胞学涂片和组织形态学方法检测子宫的状态,并利用氮蓝四唑(NBT)染色的组织超氧阴离子色度法检测ROS的含量,以研究ROS在月经发生过程中对子宫内膜崩解的作用。阴道细胞学涂片显示,350 mg/kg和500mg/kg NAC能够抑制子宫内膜的出血,而200mg/kg NAC则不能,子宫大体和组织形态学结果显示,350mg/kg和500mg/kg NAC能够抑制子宫内膜的崩解,而200mg/kg NAC则不能,同时,350mg/kg和500mg/kg NAC能够显著抑制ROS的产生,而200mg/kg NAC则没有。说明350mg/kg是抑制子宫内膜崩解的合适剂量,且ROS对子宫内膜的崩解起至关重要的作用。

金属基质蛋白酶在月经发生中的作用

子宫内膜在精确的雌激素和孕激素的作用下,经历了增殖,分化以及在分泌晚期孕酮撤退情况下的子宫内膜周期性的崩解、脱落以及其后的再生修复过程。子宫内膜的快速崩解脱落现象是月经发生的显著特征。孕酮撤退是引发月经发生的始动因子,金属基质蛋白酶则是最终作用因子。金属基质蛋白酶(MMP)为水解酶,其家族成员众多。将对金属基质蛋白酶结构种类、剪切与活化、调节以及其在月经发生中灵长类和小鼠月经样模型中子宫内膜中的定位、表达与酶活进行阐述。

白细胞在小鼠药理性孕酮撤退月经样改变模型中的作用

探讨小鼠药理性孕酮撤退月经样改变模型中白细胞的作用。方法雌性去势NIH小鼠在蜕膜化后给予米非司酮,间隔8 h检测白细胞的数量和定位以及基质金属蛋白酶(MMP)-9的定位。结果白细胞在双侧子宫角崩解前(给予米非司酮后16 h)和修复期(给予米非司酮后32 h)较多,其在月经中的作用可能依赖于蜕膜化状态。与生理性孕酮撤退月经模型存在差异,可能是由于内分泌环境造成的,源自嗜中性粒细胞的MMP-9定位存在区域性分布特征。结论在此模型中,白细胞对子宫内膜崩解和修复重建起作用。

金属基质蛋白酶MMP3和MMP7在小鼠药理性孕酮撤退月经模型中的定位

目的本研究旨在研究金属基质蛋白酶(MMPs)在小鼠药理性孕酮撤退月经模型中的定位。方法卵巢切除的小鼠在诱导蜕膜化之后给予米非司酮处理,免疫组化检测金属基质蛋白酶MMP3和MMP7定位。结果 MMP3从米非司酮处理后0 h到24 h,存在于腔上皮下的局部基质、上皮、蜕膜化区域以及基底层和功能层的交界处;从32 h到48 h存在于腔上皮以及其下基质区域。MMP7从0 h到24 h存在于基底层,上皮和中间蜕膜化区域,从32 h到48 h与MMP3的定位相一致。结论 MMP3和MMP7蛋白质在此模型中定位呈区域性分布。

肿瘤坏死因子在小鼠药理性孕酮撤退月经样模型中的定位和表达

目的在药理性撤退小鼠月经样模型中,观察孕酮撤退后,肿瘤坏死因子(TNF-α)的定位和表达情况。方法卵巢切除的小鼠在诱导蜕膜化之后给予米非司酮即通过拮抗孕酮受体的方法(药理性撤退),导致孕酮撤退,并用免疫组化的方法观察米非司酮处理的不同时相,TNF-α在小鼠子宫内膜的定位;用实时PCR的方法观察TNF-α表达情况。结果免疫组化结果显示米非司酮处理后0～8 h,TNF-α主要存在于腔周围的血管内皮细胞;12～16 h,主要存在于内流的白细胞;24～48 h,主要存在于崩解组织边缘的间质细胞区域和修复好腺上皮细胞周围的间质细胞。实时PCR结果显示TNF-αmRNA在孕酮撤退后24 h内都有表达,并且TNF-α表达量逐渐增高,在12 h、16 h达到峰值。结论在此小鼠月经样模型中,米非司酮处理即孕酮撤退后TNF-α在此模型子宫中定位呈区域性分布,并诱导TNF-α表达升高,可能参与了子宫内膜的崩解。

利用假孕小鼠建立小鼠行经模型的研究

目的利用假孕小鼠建立小鼠行经模型,并与以往的小鼠行经模型做对比。方法NIH雌鼠与输精管结扎的NIH雄鼠晚间合笼交配,翌日晨见阴栓为假孕第0天。第3.5天于左侧子宫角注射25μl花生油诱导蜕膜化,右侧子宫角为对照;第5.5天切除双侧卵巢(作为0 h),分别在0、8、12、16、24、32和48 h各时点行颈椎脱臼处死小鼠,收集子宫,观察组织形态学,阴道细胞学涂片观察出血情况。结果子宫在0 h可见广泛蜕膜化;8 h上皮有部分脱落,部分蜕膜化细胞出现核固缩;12 h子宫腔上皮基本脱落,核固缩凋亡坏死的区域继续扩大;1 6 h可见蜕膜化组织崩解;24 h崩解组织剥离;32 h组织开始修复;48 h组织修复完好。血清孕酮(P)浓度在切除卵巢后8 h开始快速下降,48 h降至0 h浓度的1/7。结论利用假孕小鼠人工诱导蜕膜化后,切除双侧卵巢可以模拟子宫内膜崩解脱落和再生。

建立大鼠代谢综合征模型及其胎盘和成年个体中糖脂代谢性别差异研究

目的构建代谢综合征实验动物模型并探究糖脂代谢异常在胎盘和成年个体的雌雄差异。方法采用高热量饮食+5%果糖饮水诱导大鼠妊娠期代谢综合征(GMS)模型。雌性大鼠GMS模型及妊娠:16只雌性Wistar大鼠随机分为对照组(正常饮食饮水+妊娠;NC组,n=8)和GMS模型组(高热量饮食+5%果糖饮水+妊娠;HDF5组,n=8)。雄性及雌性大鼠代谢综合征(MS)模型:雌、雄性大鼠各14只分别随机分为2组,即雌性大鼠MS组(F-HDF5组,n=7)、雄性大鼠MS组(M-HDF5组,n=7),雌、雄性大鼠对照组(F-NC组,n=7;M-NC组,n=7)。分别在适应1周后的基线时(W0)到饮食/饮水干预第5周(W5)内每周监测记录各组大鼠的体重、收缩压(SBP)和舒张压(DBP),于W0和W5检测其空腹血糖(FBG)值并进行口服葡萄糖糖耐量试验(OGTT),并采集空腹血清检测甘油三酯(TGs)和总胆固醇(T-CHO)浓度。在W5时收集各组大鼠的空腹血清和肝脏组织,于妊娠第20.5天(GD20.5)收集胎鼠及胎盘组织,检测胎盘组织TGs和T-CHO浓度、脂蛋白脂肪酶(LPL)活性和游离脂肪酸(FFA)含量以及胎盘组织HE和油红O染色。结果(1)在经饮食/饮水干预5周后,相较于NC组,HDF5组的体重(P<0.001)和BMI(P<0.05)、FBG(P<0.001)和OGTT血糖变化曲线下面积(AUC)(P<0.05)、TGs和T-CHO(P<0.001)、SBP(P<0.001)和DBP(P<0.05)的指标均显著升高,提示成功构建雌性大鼠GMS模型,且妊娠期血压升高(P<0.05);与NC组比较,GD20.5时HDF5组FBG、TGs和T-CHO均显著增加(P<0.001),雄性胎盘重量显著增加(P<0.01),雌雄性胎盘LPL活性均显著降低(P<0.01),TGs、T-CHO、FFA含量显著增加(P<0.05)且雄性胎盘中的含量及脂滴显著高于雌性胎盘(P<0.05)。(2)在成年的雌雄大鼠MS模型中,经5周干预后,相较于M-NC组,M-HDF5的BMI无显著增加(P>0.05),而其余各项与MS相关的指标在F-HDF5组和M-HDF5组均显著升高(P<0.05),F-HDF5组以血糖升高更为显著(P<0.05),而M-HDF5组以血脂升高更为显著(P<0.001);两组大鼠肝脏重量和FFA含量升高均以雄性表现更为显著(P<0.05),LPL的酶活性在F-HDF5组肝脏中显著降低(P<0.05)而在M-HDF5组中显著升高(P<0.05)。结论高热量饮食和5%果糖饮水可以在5周内诱导雌雄大鼠出现MS表型,糖脂代谢紊乱表现在胎盘和成年个体均具有与性别相关联的差异,也存在器官特异性。

利用假孕小鼠建立小鼠行经模型的研究

目的利用假孕小鼠建立小鼠行经模型，并与以往的小鼠行经模型做对比。方法NIH雌鼠与输精管结扎的NIH雄鼠晚问合笼交配，次日早晨见阴栓为假孕第0天。第3．5天往左侧子宫角注射花生油诱导蜕膜化，右侧子宫角为对照，第5．5天切除双侧卵巢，作为第0h。分别在第0h、8h、12h、16h、24h、32h和48h颈椎脱臼处死，收集子宫，观察组织形态学，并利用阴道细胞学涂片观察出血情况。结果子宫在第0h可见广泛蜕膜化；第8h上皮有部分脱落，部分蜕膜化细胞出现核固缩；12h子宫腔上皮基本脱落，核固缩凋亡坏死的区域继续扩大；16h可见蜕膜化组织崩解，24h崩解组织剥离，32h组织开始修复，到48h组织修复完好。血清中P浓度在切除卵巢后8h开始快速下降，48h达到0h P浓度的1／7。结论利用假孕小鼠人工诱导蜕膜化后，切除双侧卵巢可以模拟出子宫内膜崩解脱落和再生。

HIF1A与VEGF在小鼠月经样模型的表达与共定位

目的在小鼠月经模型基础上,研究低氧诱导因子(HIF1A)与血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA的表达与定位,探索HIF1A与VEGF在月经发生中可能的调控机制。方法建立小鼠月经样模型,假孕小鼠通过花生油子宫腔注射的方法诱导小鼠子宫内膜发生蜕膜化,切除卵巢致孕酮(P4)撤退以模拟月经的发生。在P4撤退后0、8、12、16、24h分别收集小鼠子宫;利用免疫组化与Western blot方法检测HIF1A、VEGF的定位与表达量,利用Real-time PCR检测二者mRNA相对表达量;分析HIF1A与VEGF的表达变化趋势与相关性。结果 P4撤退后,小鼠子宫内膜发生崩解出血,模拟月经发生。免疫组化结果显示,HIF1A蛋白在P4撤退后12、16h,内膜基质蜕膜细胞核中的表达量逐渐升高;HIF1A表达区域与VEGF表达的区域均集中在子宫内膜蜕膜化区域外周,即崩解组织与基底层交界区域。Western blot蛋白定量结果显示,细胞核中HIF1A蛋白表达量在P4撤退后8、12、16h显著增高,VEGF在细胞质中的表达量在P4撤退后0、8、12h较高。HIF1A与VEGF mRNA的表达变化趋势非常相似,即P4撤退后,逐渐升高,在12h达到峰值,随后逐渐下降。结论结果提示月经发生子宫内膜崩解中,HIF1A转录因子功能激活并调节VEGF mRNA的表达。

五凤矿中一采区6中煤层煤与瓦斯突出区域预测

煤层瓦斯赋存规律研究和突出区域预测划分的准确性是确保突出矿井安全生产的关键,同时也是瓦斯治理的基础。以五凤矿为例,通过大量资料的收集、整理及现场瓦斯参数的测定,综合考虑煤体结构参数及煤层瓦斯含量、瓦斯压力等参数,采用单项指标法和综合指标法进行煤与瓦斯突出区域性预测,进而划分出该采区在测定标高(+1 540 m)以上为非突出区域,+1 540 m以下是煤与瓦斯突出危险区域。

锌指蛋白ZNF222在滋养层细胞迁移与侵袭中的功能

目的:研究锌指蛋白ZNF222在滋养层细胞增殖、迁移及侵袭中的功能。方法:免疫组织化学法检测ZNF222在人妊娠早期绒毛、蜕膜组织及非妊娠状态下子宫内膜组织中的表达。小干扰RNA敲降ZNF222的表达。CCK-8法检测细胞增殖能力。Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力。结果:锌指蛋白ZNF222在人妊娠早期绒毛中高表达、蜕膜组织中表达较弱,非妊娠状态子宫内膜组织表达非常弱。在人滋养层细胞系HTR8/SVneo中,敲降ZNF222后,细胞增殖能力无显著变化(ZNF222 siRNA-1,P=0.610; ZNF222 siRNA-2,P=0.277),但细胞迁移(ZNF222 siRNA-1,P=0.0265;ZNF222 siRNA-2,P=0.00586)和侵袭(ZNF222 siRNA-1,P=0.0327;ZNF222 siRNA-2,P=0.0412)能力显著减弱。结论:锌指蛋白ZNF222调控着人滋养层细胞的迁移和侵袭,推测ZNF222在人类胎盘形成过程中发挥重要作用。

顺层长钻孔预抽煤层瓦斯数值模拟研究

以丁集矿11-2煤层为对象,使用COMSOL数值模拟软件模拟在煤层实施顺层长钻孔预抽煤层瓦斯措施后钻孔周围瓦斯压力分布规律。通过模拟不同钻孔长度和不同孔间距条件下的钻孔周围瓦斯压力分布规律来得出不同条件下顺层长钻孔的控制范围,为顺层长钻孔的参数优化提供指导。

瓦斯抽采钻孔负压定点连续测定技术研究

瓦斯抽采负压是影响瓦斯抽采效果的重要因素,钻孔内部不同位置处的负压直接决定了该位置处瓦斯是否能够抽出,需要进行针对性的测试,基于此,研发了瓦斯抽采钻孔负压定点连续测定装置,以白羊岭煤矿15号煤层为研究对象,运用渗流力学和流体力学理论,建立了顺层钻孔抽采负压变化数值模型,研究了不同孔口负压、不同钻孔直径、不同封孔深度、不同抽采时间等因素作用下钻孔内部沿程负压变化规律,得到了最优抽采参数设计组合,并据此对瓦斯抽采系统进行优化,有效提高了本煤层抽采效果。