造血干细胞的血管分化及其在肢体缺血性疾病中的治疗作用

造血干细胞是最早发现、研究最深入的组织干细胞,造血干细胞移植已成功治疗了多种血液及免疫性疾病。很早以前,有人推测造血干细胞和血管干细胞来自共同的干细胞-血液血管母细胞。近年研究显示,造血干细胞具有分化血管内皮细胞的能力。动物实验显示,缺血部位造血干细胞移植可以促进血管新生,改善肢体缺血。临床小规模试验研究表明,应用骨髓和外周血造血干细胞移植可以显著促进缺血下肢的血管重建。本文简要介绍骨髓、外周血、脐血造血干细胞的血管分化功能及其在肢体缺血性疾病中的治疗作用。

干细胞研究及临床应用的伦理分类管治

分析了干细胞的种类不同所涉及伦理问题的差异性以及干细胞技术临床应用的社会环境。强调干细胞研究及临床应用伦理共同体的责任、管理缺位的危害性。探讨建立既能促进干细胞科技发展,又能保护研究者、病人和受试者各方权益的机制的必要性。

血液干细胞研究进展

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞。血液干细胞是最早证实 ,研究最多 ,临床应用最成熟的组织专能干细胞。血液干细胞的移植已成功地应用于治疗多种血液系统和相关系统疾病。近年来 ,血液干细胞在胚胎时期的发生、发育过程和发育中的定向迁移及移植过程中的动员、归巢机制得到进一步阐明。干细胞的概念有所突破 ,发现血液干细胞具有跨系统分化潜能。这不仅开拓了干细胞研究内容 ,也极大地拓展了血液干细胞在临床上的应用范围。本文同时对国内。

血小板第4因子(PF4)抗血管新生的机理初探

目的研究血小板第4因子(PF4)抑制血管新生的机制。方法通过研究PF4与纤维母细胞生长因子 -2(FGF2)及其受体间的相互作用来探讨PF4抑制血管新生的机制。结果FGF2与低亲和力和高亲和力位点的结合受PF4抑制 ,这种抑制呈浓度依赖性。5～10μg/ml的PF4能最大限度地抑制FGF2与低亲和力或高亲和力位点(FGF受体)结合。0.72μg/ml的PF4能使FGF2与低亲和力位点结合减少50 % ,0.6μg/ml的PF4能使FGF2与高亲和力位点结合减少50 %。2μg/ml的PF4能完全抑制内皮细胞的增殖。在该浓度下 ,PF4使125I-FGF2的内化下降近3倍。结论 :PF4抑制血管新生的机制之一是抑制FGF2与其受体结合。

癌症的造血保护和抗血管新生治疗研究

已知肿瘤放、化疗造成的造血功能抑制是肿瘤治疗失败的主要原因.此外,无论是实体或血液肿瘤,其持续生长都必须依赖新生血管的形成,因此本项目从造血保护和抗肿瘤血管新生两方面着手,研究探索新的抗肿瘤治疗技术,着重研究:降低造血干细胞对化疗药物和辐射的敏感性,阻止化疗药物和辐射引起的造血细胞凋亡,从而可以增大治疗剂量,最大限度地杀死肿瘤细胞而不引起造血功能严重受损;刺激造血干细胞的增殖、粘附和归巢,促使造血全面恢复;抑制肿瘤血管新生,阻断营养血管导致肿瘤细胞缺血性坏死,增大肿瘤放、化疗的治疗效应.研究发现血小板第四因子(PF4)和凝血酶敏感蛋白(TSP-1)这两种蛋白质具有很好的造血功能保护和抗肿瘤血管新生双重作用.

巨核细胞和血小板的病理生理学特征及其生长调节

血小板是维持体内正常血液凝固和血管壁完整性所必须的血细胞,其功能质量和数量的异常会导致血液和血栓性疾病的发生.血小板减少的发生率很高,患者因经常性出血需长期治疗,给身心健康和经济上带来很大的负担,出血严重将危及生命.

自体骨髓干细胞原位移植治疗急性心肌梗死的临床研究

目的 :用粒细胞集落刺激因子 (G -CSF)动员自体骨髓干细胞进入心肌梗死部位原位移植以修复梗死心肌组织 ,探讨其对急性心肌梗死患者心肌梗死面积及心功能的影响。方法 :2 5例初次急性心肌梗死患者在入院后随机分为干细胞原位移植组 (n =12 )和对照组 (n =13)。干细胞原位移植组于入院后在常规治疗基础上加用G -CSF动员自体骨髓干细胞进行心肌梗死原位移植 ;对照组按急性心肌梗死常规方法治疗。于入院第 ( 1、2 8d)描记常规 12导联心电图 ,采用Wagner的QRS波群记分法评价心功能 ,于入院 ( 7、2 8d)行核素心肌灌注断层显像 ,测量心肌梗死面积。结果 :G -CSF治疗 4周 ,干细胞原位移植组QRS记分值明显降低 ,显著低于对照组 (P <0 0 5 ) ;心肌梗死面积由 36 0 %± 8 3%下降至 18 0 %± 5 8%,显著小于对照组 (P <0 0 5 )。结论 :用G -CSF动员自体骨髓干细胞来修复坏死心肌组织的“干细胞原位移植”疗法 ,能减小心肌梗死的范围 ,改善心功能。

粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗大鼠急性心肌梗塞

目的 :探讨G -CSF动员的骨髓来源干细胞对急性心肌梗塞动物模型的治疗作用与对缺血濒死心肌的保护作用。方法 :用异丙肾上腺素 (ISO)复制急性心肌梗塞大鼠动物模型 ,于 3h后用G -CSF动员骨髓干细胞释放和迁移至心肌梗塞部位 ,并分别于 2 4h、48h和 2周后杀死大鼠 ,取出心脏 ,检测心肌的病理变化情况。结果 :用ISO后 2 4h对照组可见散在心肌梗塞灶 ,坏死区周围有多量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润 ,而治疗组大鼠心肌坏死程度较对照组轻 ,浸润的细胞以单个核细胞为主 ;48h后对照组心肌梗塞灶进一步扩大 ,呈散在片状分布 ,而治疗组心肌梗塞灶扩大不明显 ,呈散在灶性分布 ,并可见成堆或散在分布的淋巴细胞样细胞 ;2周后 ,治疗组未见明显心肌梗塞后疤痕组织 ,可见新生的心肌细胞生长。结论 :G -CSF对缺血濒死心肌有保护作用 ,用G -CSF动员骨髓来源的干细胞进行“自我移植” ,可用于急性心肌梗塞的治疗。

脐带间充质干细胞体外分化为有功能的低免疫原性肝细胞样细胞

目的观察人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)体外诱导分化为肝细胞样细胞(DHC)后,是否具有肝细胞的生物学特性和功能,以及其免疫原性的变化。方法采用改良的二步法肝细胞分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化,并用RT-PCR和免疫荧光染色法检测诱导后不同时间DHC肝细胞特异性标记的表达;采用ELISA法检测细胞培养液中白蛋白(ALB)和尿素的浓度,以及混合淋巴细胞培养检测DHC对淋巴细胞增殖能力的影响。结果 UC-MSCs低表达甲胎蛋白(AFP)、ALB和细胞角蛋白-19(CK-19)的mRNA和蛋白,成肝诱导分化后14和28dDHC均高表达肝细胞标志AFP、ALB、CK-19以及色氨酸2,3-加双氧酶基因。诱导后的DHC能够以时间依赖方式产生ALB和分泌尿素,不表达人白细胞DR抗原,而且能够抑制淋巴细胞增殖。结论 UC-MSCs在体外能够分化为有功能的DHC且具有低免疫原性的特征。

脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)体外诱导分化为肝细胞的可行性和方法,观察分化后的细胞白细胞表面抗原表达的改变。方法采用酶学法从脐带全层组织中分离UC-MSCs,采用改良的肝分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化。诱导后2、4周,观察细胞形态,免疫荧光细胞化学染色法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB);RT-PCR检测肝细胞标志性基因AFP、ALB和CK19 mRNA。ELISA法检测诱导后的细胞培养液中ALB水平。流式细胞仪检测诱导后细胞白细胞表面抗原HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ。结果从人脐带基质中分离培养的UC-MSCs在向肝细胞诱导分化培养体系的培养下,细胞形态由长梭形逐渐转化成为多角形或类圆形,并且表达AFP、ALB mRNA和蛋白,诱导后的UC-MSCs以时间依赖方式产生ALB,诱导后的细胞不表达HLA-DR。结论UC-MSCs具有向肝细胞分化的潜能,分化后的M细胞仍具有低免疫原性。

脐带源间充质干细胞对异源性脐带血T淋巴细胞激活与增殖的抑制作用

目的:观察人脐带源间充质干细胞(hUC-MSC)对异源性脐带血T淋巴细胞激活与增殖的影响,探讨其在免疫调控中的作用。方法:建立分离、扩增hUC-MSC的方法,检测其MHC表型;实验分3组:(1)单纯脐带血组(阴性组);(2)脐带血+丝裂原刺激组(对照组);(3)脐带血+丝裂原刺激+MSC共培养组(实验组);流式细胞术检测各组脐带血T细胞及其CD4+和CD8+亚型细胞共培养8h后早期激活标志CD69的表达,MTT法检测各组脐带血T细胞共培养5d后增殖情况。结果:成功建立分离、扩增hUC-MSC的方法,免疫表型分析显示hUC-MSC不表达HLA-Ⅱ抗原,低表达HLA-I抗原;流式细胞术检测示在hUC-MSC共培养情况下,经丝裂原刺激后,脐带血T淋巴细胞CD69表达与对照组[(22.6±5.2)%]的阳性率相比较,下降至(7.8±3.5)%(P<0.01),而且这种抑制对不同亚型T细胞(CD4+/CD8+)均起作用;MTT检测显示在hUC-MSC共培养条件下,丝裂原刺激T细胞增殖受到抑制,抑制的程度与hUC-MSC的剂量呈依赖性。结论:hUC-MSC对异源性脐带血T淋巴细胞激活和增殖具有抑制作用,而且这种作用为非选择性的,呈剂量依赖性。

CD34^+细胞的心肌细胞分化潜能研究

目的 :了解粒细胞集落刺激因子 (G -CSF)动员的CD3 4 +细胞的心肌细胞分化潜能。方法 :用异丙肾上腺素 (ISO)复制急性心肌梗死大鼠动物模型 ,于 3h后用G -CSF动员骨髓造血干细胞进行心肌梗死动物模型的“自身干细胞移植” ,用免疫组化和HE染色方法检测动物模型心梗区的CD3 4 +细胞浸润以及心肌细胞再生情况。结果 :用ISO后 2 4h ,G -CSF处理组大鼠心梗区可见大量CD3 4 +单个核细胞浸润 ,并有CD3 4 +的新生心肌细胞生长 ,2周后疤痕组织不明显 ;而对照组心梗坏死区有大量以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润 ,无CD3 4 +细胞浸润及新生心肌细胞生长 ,2周后出现较大量的疤痕组织。结论 :G -CSF动员CD3 4 +细胞具有向心肌细胞分化的潜能 ,用G -CSF动员造血干细胞的“干细胞自身移植” ,可治疗急性心肌梗死。

人脐血干细胞移植促进大鼠脊髓损伤神经恢复

目的观察移植人脐血CD３４＋干细胞是否可以存活、分化、促进脊髓损伤的行为和功能恢复。方法２６只Wister大鼠随机分成移植组和对照组。移植组行脊髓半切术并移植５-溴脱氧尿核苷（Brdu）标记的脐血CD３４＋细胞，对照组行脊髓半切术后注射PBS液。采用改良Tarlov评分标准对移植组和对照组所有大鼠在术前和术后２４h、１、２、３、４周进行运动功能评价。组织学和免疫组化分析移植细胞的定位和分化情况。结果移植后在脊髓病理切片中出现Brdu标记人脐血细胞，激光扫描共聚焦显微镜通过免疫荧光双标检测到７％Brdu阳性细胞表达神经胶质元纤维酸性蛋白（GFAP），２％Brdu阳性细胞表达神经元核抗原（NeuN）。神经功能检测发现１周后移植组功能恢复较对照组具有显著性差异（P＜０．０５）。结论移植人脐血干细胞可以促进脊髓损伤的行为和功能恢复，为神经损伤治疗提供了有用的细胞源。

脐带间充质干细胞对T细胞的免疫调控研究

目的:研究脐带源间充质干细胞(UC-MSCs)异源T淋巴细胞的免疫调节作用。方法:从脐带中分离和培养间充质干细胞,流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度;用Brdu法测定细胞增殖率,观察UC-MSCs对异体T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞仪检测共培养体系中CD4+、CD8+水平检测及UC-MSCs对T淋巴细胞转化的影响;且用ELISA法检测共培养上清细胞因子IL-4、IFN-γ的表达水平。结果:从脐带获得的MSC免疫表型分析显示,其不表达HLA-II抗原。对PHA刺激的脐带血T淋巴细胞,UC-MSCs对其的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性;UC-MSC与脐带血单个核细胞共培养体系中,CD8+细胞比例降低,与对照组有显著性差异(P<0.01),CD4+细胞比例无明显变化(P>0.05);UC-MSC抑制了共培细胞养体系中IFN-γ分泌,然而促进了IL-4的分泌,与对照组有显著性差异(P<0.01)。结论:UC-MSCs抑制PHA刺激的T淋巴的增殖,能够改变T细胞亚群及T细胞分泌的细胞因子,这种抑制特性表明,UC-MSCs对免疫反应具负调节作用,可能为GVHD的防治以及自身免疫性疾病治疗提供一条新途径,有助于UC-MSC的临床应用。

粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗大鼠缺血性脑梗死

目的 :探讨粒细胞集落刺激因子 (G -CSF)对大鼠缺血性脑梗死的治疗作用。方法 :采用线栓法制作大鼠缺血性脑梗死模型 ,1h后腹腔注射G -CSF 6 0 μg/kg。TTC、HE染色及免疫组化检测脑梗死灶体积、病理改变及CD34阳性细胞浸润情况。结果 :G -CSF治疗组大鼠脑梗死灶体积明显小于对照组 (P <0 0 1) ;其病理损伤程度较对照组轻 ;脑梗死部位出现CD34阳性单个核细胞浸润 ,并有CD34阳性呈锥状并且带有突起的神经样细胞生长 ,对照组未发现CD34阳性细胞。结论 :G -CSF可减轻大鼠缺血性脑梗死程度 ,减少脑梗死体积 ,其机理可能是G -CSF对缺血神经元具有保护作用 ,并动员自体骨髓干细胞 ,促进脑组织的再生与修复。

IL-27通过信号通路p38 MAPK和PI3K途径调节中性粒细胞Mac-1、fMLP-R及IL-1β表达

本研究探讨IL-27调节人外周血中性粒细胞中黏附分子Mac-1、趋化因子受体fMLP-R和促炎因子IL-1β表达的信号通路。采用Ficoll密度梯度离心及低渗裂解残存红细胞方法分离高纯度的外周血中性粒细胞。用RT-PCR方法检测中性粒细胞IL-27受体(WSX-1/TCCR和gp130)mRNA表达。分别应用IL-27及信号通路p38 MAPK、PI3K和ERK抑制剂SB203580、LY294002、U0126处理中性粒细胞,用实时定量RT-PCR检测作用前后fMLP-R和IL-1βmRNA水平变化;应用放射免疫法检测作用前后培养上清液中IL-1β的水平变化;流式细胞术检测作用前后Mac-1表达水平变化。结果表明:人外周血中性粒细胞协同表达IL-27受体的两个亚单位WSX-1/TCCR和gp130,IL-27下调中性粒细胞表面黏附分子Mac-1表达(p<0.05),SB203580阻断了IL-27对Mac-1的下调作用(p<0.05),而LY294002及U0126无阻断作用(p>0.05)。相反,IL-27上调中性粒细胞中fMLP-R和IL-1βmRNA的表达并能增加IL-1β释放(p<0.05),LY294002阻断了IL-27对fMLP-R和IL-1β的上调作用(p<0.05),而SB203580及U0126无阻断作用(p>0.05)。结论:IL-27与IL-27R相互作用,可能通过p38 MAPK和PI3K信号途径调节人外周血中性粒细胞中Mac-1、fMLP-R及IL-1β表达。

茂原链轮丝菌转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)基因组DNA扩增出微生物转谷氨酰胺酶(MicrobialTransglutaminase,MTG)的基因片段,并构建表达质粒pET_MTG。后者在大肠杆菌(RosettaDE3)中得到高效表达,但表达的MTG存在于包涵体中。经洗涤、变性和复性,并以强阳离子交换层析纯化,获得了SDS_PAGE纯的MTG,并具有与天然酶几乎相同的比活性。此项工作为工业化生产MTG打下了基础。