禽流感大流行不是危言耸听

对禽流感是否真的大流行,各种预测、众说纷纭。这个话题也一直是老百姓关注的焦点。禽流感是否将大流行的确值得我们关心．但更值得我们关心的应该是如何阻止它的发生,如何在发生之前作好应对的准备。到底结果会是怎样,通过权威专家的分析,我想多少能从本文得到一些启示。

霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析

目的分析广东霍乱弧菌（VC）代表菌株主要毒力基因和管家基因序列。方法PCR扩增霍乱弧菌的主要毒力基因（ctxAB和tcpA）和管家基因（dnaE、hlyA、mdh和recA）、基因测序、对序列进行生物信息学分析。结果不同年代分离的2株埃尔托型（EVC）产毒株和1株0139群VC产毒株的主要毒力基因序列与国内外相关报告比较，ctxA基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为99．7％～100％和98．8％～100％．ctxB基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为98．8％～100％和96．8％～100％，tcpA基因序列与EVC国际标准株N16961 100％同源。3株产毒株的dnaE、hlyA、mdh和recA基因序列同源性分别为99．8％～100％，100％，99．5％～99．8％和100％，氨基酸序列同源性分别为100％．100％，98．5％～99．3％和100％；3株产毒株和O139群VC非产毒株的管家基因序列同源性分别为97．0％～97．2％，91．8％，94．1％～94．4％，96．9％，氨基酸序列同源性分别为100％，94．6％，94．3％～98．5％和99．7％。结论广东省不同年代EVC产毒株和O139群VC产毒株的群体遗传学关系高度密切，而与O139群VC非产毒株较远，O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株。

不同群型霍乱弧菌recA、dnaE和mdh管家基因序列分析

目的不同群型霍乱弧菌(VC)recA、dnaE和mdh管家基因序列分析。方法PCR扩增、基因测序及生物信息学分析。结果18株不同群型霍乱弧菌recA基因500bp序列中共44个位点发生变异,只有3个位点变异导致氨基酸变异;dnaE基因600bp序列中共32个位点发生变异,只有1个位点变异导致氨基酸变异;mdh基因367bp序列中共21个位点发生变异,只有1个位点变异导致氨基酸变异。O1群埃尔托生物型(EVC)产毒株和O139群VC产毒株遗传学关系高度密切;不同群型非产毒株之间遗传学关系较远;不同群型产毒株和不同群型非产毒株遗传学关系较远。结论我国不同地区流行的EVC产毒株和O139群VC产毒株可能分别来自同一克隆群,O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株。

新成人腹泻轮状病毒J19株的全基因组克隆和VP4、VP6和VP7基因序列分析

为了进一步了解新成人腹泻轮状病毒J19株的基因和蛋白特征,利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法扩增J19株的11个基因,克隆到pMD18-T载体中并进行测序。在此基础上,将主要抗原蛋白VP4、VP6和VP7的蛋白序列与其它轮状病毒的相关蛋白序列进行比较分析并对VP6蛋白序列做遗传进化分析。结果获得J19株11个基因的全长基因序列。基因序列分析表明J19株的第3、6和第9基因分别长2 512bp、1 287bp和820bp,它们分别预测编码抗原蛋白VP4(823aa)、VP6(396aa)和VP7(258aa)。组成J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列对B组轮状病毒的CAL株、IDIR株以及ADRV株的相关蛋白序列的一致性分别是27.6%、38.5%和22.3%。对分组抗原蛋白VP6的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置靠近外群蛋白分支以及A、B和C组轮状病毒分支的根部,而且它比较偏向于B组轮状病毒的分支。J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列与其它轮状病毒的相应蛋白序列存在显著差异。VP6蛋白序列的遗传进化分析表明J19株可能是一个新组轮状病毒的代表性毒株;同时,它也可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一。关于新成人腹泻轮状病毒J19株11个基因的克隆及VP4、VP6和VP7基因的序列分析,这是第一次报道。

霍乱弧菌4种新类型tcpA基因发现及序列分析

目的研究中国霍乱弧菌(VC)毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型(EVC)产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA基因均与EVC国际标准株N16961株为同一类型(t2型).50株EVC非产毒株中只有3株携带tcpA基因,1株为t2型,另2株为2种新类型.20株O139群VC非产毒株均不携带tcpA基因.20株非O1非O139群VC中只有2株携带tcpA基因,且为2种新类型.4种新类型tcpA基因与国外发现的4种类型比较,基因序列及推测的氨基酸序列同源性分别为58.3%～77.5%和61.0%～85.5%;5′端约102bp基因序列基本一致,推测的氨基酸序列完全一致;3′端约210bp基因序列变异最大,推测的氨基酸序列变异也最大.抗原表位分析,C末端差异最大.结论建立快速准确区分不同类型tcpA基因的方法,并发现4种新类型.

霍乱弧菌JS94484株CTX^(EVC)_φ和nct-CTX^(new)_φ基因组变异区序列分析

目的对霍乱弧菌JS94484株CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组变异区进行序列分析。方法采用聚合酶链反应、基因测序及序列分析。结果JS94484株CTXEVCφ基因组的ig1、rstR、ig2和ctxAB基因与EVC标准株N16961的高度同源。JS94484株nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因,与目前发现的3种类型的同源性均较低,趋异性均较高。CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组zot基因末端约60bp的基因序列差别较大,推测的氨基酸序列差别也较大。JS94484株的tcpA基因序列与EVC标准株N16961的完全一致。结论霍乱弧菌nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因为新类型,基因功能有待于进一步研究。

不携带霍乱毒素基因的CTXΦ类前噬菌体基因组克隆与分析

霍乱弧菌的霍乱毒素基因ctxAB由其溶原性噬菌体CTXΦ编码 ,由此携带毒素基因在产毒株与非产毒株间水平转移。从无ctxAB的ElTor型菌株中 ,发现不同时间、地点来源的部分菌株仍带有CTXΦ基因组的其它基因 ,在研究菌株染色体上呈双拷贝串联排列。克隆后测序发现基因组全长 5 70 8bp ,其抑制基因rstR却与古典型菌株来源CTXΦ的相同 ,因此从E1Tor菌株中发现整合有古典型来源的这类噬菌体。其它各基因与CTXΦ序列基本一致 ,但nct CTXΦ的zot基因末端及下游间隔区与CTXΦ的相差很大 ,进一步的序列测定与比较表明nct CTXΦ中无ctxAB应是其固有结构 ,而不是ctxAB丢失所形成的。将这种独特的前噬菌体命名为nct CTXclassΦ。研究菌株染色体上nct CTXΦ基因组上下游也各存在TLC因子和RTX毒力基因簇的同源序列 ,揭示它们与nct CTXΦ基因组有与CTXΦ相同的联系。从序列分析上认为nct CTXΦ与CTXΦ在遗传分化上有不同 ,可能是CTXΦ的前体形式 ,这对CTXΦ的来源。

霍乱弧菌JS9803株CTX^(EI Tor)φ和nct-CTX^(newO139)φ基因组克隆、测序及序列分析

目的霍乱弧菌JS9803株CTXEITorφ和nct-CTXnewO139φ基因组克隆、测序及序列分析。方法基因亚克隆、测序及序列生物信息学分析。结果霍乱弧菌9803株CTXEITorφ基因组与EITor类型的高度同源,RS区为双拷贝,核心区为单拷贝,RS侧和核心区侧染色体部分序列分别为TLC和RTX基因簇。nct-CTXnewO139φ基因组与已报道的其它类型比较,rstR基因及推测的氨基酸序列同源性分别为27.6%～50.5%和14.1%～48.4%,间隔区ig-2基因同源性25.2%～29.6%,表明rstR-ig2为新类型,该基因组附近染色体部分序列也为新发现的基因。结论在霍乱弧菌中发现新类型rstR-ig2的nct-CTXnewO139φ基因组,并和CTXEITorφ基因组共存。

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs间的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNApol)基因的进化树分析。结果:VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G+C含量为50.56%,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G+C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNApol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp 1和芽孢杆菌噬菌体GA 1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。

新成人腹泻轮状病毒J19株VP2、VP3的编码基因序列分析

利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法,从新成人腹泻轮状病毒J19株的核酸中扩增基因,克隆至pMD18-T中并进行测序和基因序列分析。J19株的VP2、VP3的编码基因为基因2、4,分别长2 969bp、2 204bp,它们分别编码973个氨基酸和719个氨基酸。J19株的VP2蛋白序列对B组人轮状病毒IDIR株的一致性为47.2%;J19株的VP3蛋白序列对C组人轮状病毒Cowden株一致性为25.1%。对J19株VP2的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置靠近外群蛋白以及A、B和C组轮状病毒分枝的根部,并且它比较偏向于B组轮状病毒的分枝。这与VP6的遗传进化分析结果相一致。根据上述结果推测J19株可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一;同时,这表明VP2在研究轮状病毒的遗传进化上具有重要价值。关于新成人腹泻轮状病毒J19株VP2、VP3的编码基因的序列分析,这是首次报道。

O139霍乱弧菌的分子流行病学特征

利用ｃｔｘＡ，Ｚｏｔ，Ａｃｅ，ＲＳ１，ｓｔ和ｉｇａ等基因探针检测５７８株霍乱弧菌，发现其中１株埃尔托型霍乱弧菌和６株Ｏ１３９霍乱弧菌不含ｃｔｘＡ，进一步分析证明这７个菌株中，除１株含ＲＳ１序列外，其他毒力基因检测均为阴性，这为菌苗候选株的筛选提供了依据。用１６ＳｒＲＮＡ基因探针检测不同地区分离的６２株Ｏ１３９菌株和Ｏ－１群埃尔托型菌株，将其分为９个１６ＳｒＲＮＡ基因型。结合ｃｔｘＡ探针检测结果，认为我国流行的Ｏ１３９霍乱弧菌有两种类型，与印度、孟加拉国分离的菌株不尽相同。本文首次报导，通过１６ＳｒＲＮＡ基因检测，可区分Ｏ－１群埃尔托型霍乱弧菌与Ｏ１３９霍乱弧菌，并建议将ｃｔｘＡ、１６ＳｒＲＮＡ两个基因作为确定Ｏ１３９霍乱弧菌分子流行病学特征的指标。

嗜酸乳杆菌DOMLa菌株thyA基因突变株的筛选

为构建以ｔｈｙＡ基因为选择标记的嗜酸乳杆菌染色体－质粒致死平衡系统。我们建立了嗜酸乳杆菌ｔｈｙＡ基因突变菌株的筛选方法。从含有三甲氧卞氨嘧啶（ＴＭＰ）２０μｇ／ｍｌ和胸腺嘧啶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）５０μｇ／ｍｌ的改良ＭＲＳ培养基中筛选了１００株突变株，从中确定一株生物学性状稳定的菌株ＤＯＭＬａＦ８４作为进一步研究的受体侯选菌株。

El Tor型CTXΦ对O1群不同霍乱弧菌的转染性研究

研究丝状噬菌体CTXΦ对O1群不同霍乱弧菌的水平转移效率及菌株的噬菌体免疫能力.利用带有氯霉素抗性基因遗传标记的CTXETΦ感染颗粒对O1群的4株不同霍乱弧菌进行体外和体内转染实验,根据氯霉素抗性筛选转染子,通过Southern Blot等方法进行验证并判断CTXΦ基因组的存在形式,计算比较不同菌株的转染率,分析转染及噬菌体免疫机制.带有遗传标记的CTXETΦ对古典型霍乱弧菌1119的体内转染率高于体外;体内转染实验中,古典菌株1119的转染率远高于其它3株El Tor型霍乱弧菌;在El Tor型霍乱弧菌中,不含rstR基因的IEM101的转染率高于另外两株带有rstR基因的霍乱弧菌2～3个数量级.古典型霍乱弧菌比El Tor型菌株对CTXETΦ噬菌体颗粒更易感,TCP菌毛的表达和rstR基因介导的噬菌体免疫影响CTXΦ在霍乱弧菌中的水平转移.

霍乱弧菌抑制子基因及间隔区(rstR-ig2)多态性研究

目的研究霍乱弧菌CTXφ基因组抑制子基因及间隔区(rstR-ig2)多态性。方法聚合酶链反应(PCR)及限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、型特异性引物PCR分型。结果霍乱弧菌(VC)O1群古典型(CVC)5株均为class类型。VCO1群埃尔托型(EVC)155株共分为4个类型:class、ET、class+ET、class+newET,后2个类型为首次发现。不同地区分离的EVC均以ET类型为主,以class和class+ET类型为辅。O139群VC82株共分为4个类型:ET、ET+newO139、ET+calc、ET+calc+newO139,后3个类型为首次发现;福建省分离的菌株以ET+newO139类型为主,其它地区分离的均以ET类型为主。结论EVC和O139群VC的rstR-ig2基因均以ET类型为主,首次发现5种不同类型rstR-ig2基因共存的新类型。

霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体基因组结构研究

目的研究霍乱弧菌埃尔托型（EVC）新类型溶源性噬菌体（CTXφ）和核心区不含ctxAB基因的溶源性噬菌体（nct-CTXφ）基因组的结构。方法采用基因扩增、测序及序列生物信息学等方法进行观察与分析。结果在我国EVC中,存在仅携带古典型（class）nct-CTXφ、CTXφ或埃尔托型（ET）CTXφ基因组类型,并发现nct-CTXclassφ和CTXETφ共存、nct-CTXnewETφ和CTXclassφ共存的新类型。CTXφ和nct-CTXφ基因组zot基因3′末端,60bp序列中40%位点不同,推测的氨基酸序列中60%位点不同。class、ET和newET类型ig 1、rstR和ig 2基因序列同源性分别为77.0%~97.4%,10.4%~17.9%,9.6%~64.8%,RstR同源性9.2%~24.1%。CTXφ基因组均位于染色体TLC基因簇附近。上述不同类型EVC的tcpA、TcpA、ctxA、ctxB、CtxA和CtxB与GenBank中EVC和O139群产毒株的同源性分别〉99%,99%,99%,98%,98%和96%。结论首次在EVC中发现nct-CTXclassφ和CTXETφ、nct-CTX^newET φ和CTX^classφ共存的新类型。

霍乱弧菌O1群菌株多位点酶电泳分析

为更准确区分霍乱弧菌Ｏ１群不同菌株的流行病学意义，应用多位点酶早泳法对来自不同国家，地区，时间和人群的霍乱弧菌Ｏ１群菌４７１株进行分型和分子生物学数值分类分析。结果；通过１１种酶基因位点的检测，４７１株Ｏ１群霍乱弧菌可以分为７１个ＥＴ型，ＥＴ１－ＥＴ２８为噬菌体－生物分型所区分的流行株，其中ＥＴ１－ＥＴ６为古典型菌，ＥＴ７包括大多埃尔托流行株和部分古典型菌株；

霍乱弧菌不同群体菌株的群体遗传特征比较

应用ＭＥＥ法对５９２株霍乱弧菌的１５个酶基因位点进行检测，分析和比较霍乱弧菌不同群体的群体遗传特征。结果：古典型菌株（ＣＶＣ）、埃尔托流行株（ＥＳＥＶＣ）和Ｏ１３９菌株（Ｏ１３９）的群体平均遗传多态值和平均杂合度都很低，ＨＣＶＣ＝０．１０６、ｈＣＶＣ＝１．５，ＨＥＳＥＶＣ＝０．０５６、ｈＥＳＥＶＣ＝２．３（Ｏ１３９包含在ＥＳＥＶＣ之中），被检测的基因位点多为非多态位点；而同为Ｏ１群菌的埃尔托非流行株（ＮＳＥＶＣ）的平均遗传多态值和平均杂合度要高得多，接近非Ｏ１群菌株（ＮＯ１）的群体遗传学指标，分别为ＨＮＳＥＶＣ＝０．４２５、ｈＮＳＥＶＣ＝５，ＨＮＯ１＝０．６２７、ｈＮＯ１＝６．５，被检测的基因位点几乎全是遗传多态位点。结果表明：ＥＳＥＶＣ和ＮＳＥＶＣ虽然都是Ｏ１群菌，但在群体遗传学特征上存在巨大差异；ＣＶＣ、ＥＳＥＶＣ和Ｏ１３９为遗传学性状稳定、群体遗传结构紧密的群体。

霍乱弧菌非O1群菌株的毒力基因检测和染色体酶切图谱分析

非Ｏ１群霍乱弧菌（不包括Ｏ１３９菌）是腹泻病原菌，由于它们分布较广，因此对人们的健康具有较大的威协；应用核酸技术对９８株非Ｏ１菌的主要毒力基因进行检测，并从ＤＮＡ和基因水平对５株非Ｏ１菌的分子特征进行研究。结果：所选菌株的染色体酶切图谱与Ｏ１群霍乱弧菌相比有很大差异，尤其与Ｏ１群流行株的差异更大，非Ｏ１菌相互之间的差异也很大；对９８株非Ｏ１菌进行ｃｔｘ、ｚｏｔ、ａｃｅ、ＲＳ１基因检测，结果有２株为上述基因阳性，仅为２％左右。结果显示：非Ｏ１菌群体遗传结构复杂，变异程度高；其与Ｏ１菌，尤其是流行株（包括Ｏ１３９菌）的遗传关系较远；