外周血造血干细胞不同保存方法的比较

目的:为造血干细胞低温保存选择合适的方法。方法:20例外周血单个核细胞加入DMSO或DMSO加HES,-80℃冰箱(简称冰箱)或程控降温,冰箱或液氮保存,定期检测标本的CFU-GM,LTC-IC,CD34+,TBR,计回收率。结果:冰箱降温并保存,5%DMSO-6%HES为保护剂的CFU-GM、LTC-IC、CD34+、TBR回收率分别为:82.2%±14.7%、83.0%±12.2%、94.2%±4.3%、97.7%±3.9%,比10%DMSO者具体回收率明显高(P<0.05);同一种保护剂下:冰箱降温并保存与程序降温冰箱保存比,差异不显著(P>0.05),冰箱降温并保存、冰箱降温液氮保存及程控降温液氮保存,在一年内,各种回收率差异不显著(P>0.05),二年时,只有冰箱降温并保存者其各种回收率指标明显下降(P<0.05);细胞复温后,标本不稀释也不洗涤,室温下放置,细胞活力的各指标均下降(P<0.05),以含10%DMSO为保护剂者影响最大。结论:造血干细胞优选保存方法是:保护剂用5%DMSO-6%HES,保存时间不超过一年时,用冰箱降温并保存,长期保存时,冰箱降温则需液氮保存,细胞复温后,标本内保护剂应立即稀释(临床应用)或去除。

预激态补骨脂素抑制K562细胞增殖的实验研究

本研究的目的是观察预激态补骨脂素对K5 6 2细胞增殖的影响 ,为补骨脂素的临床应用提供实验依据。取预激态补骨脂素和晚激态补骨脂素处理的细胞 ,在培养后检测台盼蓝拒染细胞数和白血病细胞集落 ,并对它们在台盼蓝拒染细胞抑制率 (TBIR)、细胞增殖抑制率 (CPIR)和集落形成抑制率 (CFIR)方面的差异进行比较。结果表明 :预激态补骨脂素对K5 6 2细胞增殖有抑制作用 ;随着预激态补骨脂素浓度的增加 ,其抑制作用也随之增强 ;预激态补骨脂素与晚激态补骨脂素的TBIR、CPIR、CFIR各值比的差异不显著 ;为使预激态补骨脂素要充分发挥对K5 6 2细胞的抑制作用 ,补骨脂素的紫外线照射时间应在 10分钟以上 ;与K5 6 2细胞作用时间也应大于 12小时 ;抑制作用会因预激态补骨脂素预激后搁置时间的延长而下降 ,在 6小时内作用最强。结论 :预激态补骨脂素和晚激态补骨脂素对K5 6 2细胞的增殖均表现出抑制作用 ,有望作为临床的抗肿瘤用药。

骨髓细胞液氮保存21-25年后的细胞活力体外研究

为探讨适合临床应用的骨髓细胞保存方法,揭示细胞长期低温保存效果,将20人份骨髓加入DMSO-AuP(10%二甲亚砜、10%自体血浆)或DMSO-HES-HuA(5%DMSO、6%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白)保护剂,分装2毫升/管,600-800管/人份,自控程序降温仪或-80℃低温冰箱预冻降温、液氮中保存21-25年。取冷冻骨髓细胞于38℃复温,检测细胞相关指标。结果表明:加保护剂的细胞标本在-80℃低温冰箱中为低速降温,-30℃前,与自控程序降温仪设定1℃/min的低降温速率接近。DMSO-HES-HuA与DMSO-AuP比较,红细胞形态畸形率分别为(3.5±1.5)%和(12.6±4.8)%;溶血率分别为(3.3±1.6)%和(23.1±5.1)%(p<0.05);前者渗透性脆性不变,后者减低;红细胞、血小板、粒单系造血祖细胞、长期培养起始细胞回收率,前后者对比分别为(96.1±1.8)%、(70.0±9.5)%、(49.2±10.9)%、(54.2±13.8)%vs(76.3±5.6)%、(52.7±8.1)%、(43.5±12.3)%、(47.2±13.6)%。用上述保护剂配合上述降温法保存后,细胞在间充质干细胞培养上,生长特性良好。同一保护剂用上述两种降温法保存后,细胞各种回收效果差异不显著(p>0.05)。结论:细胞在液氮中保存21-25年,其细胞形态和回收活力(率)良好;保存如骨髓这种细胞成分并非单一的标本时,用5%DMSO-6%HES-4%HuA为保护剂的-80℃冰箱预冻降温后液氮保存,方法简便、经济、易操作,适合临床应用。

低温冻存对脐血树突状细胞生物特性的影响

目的 :观察低温冻存对脐血来源的树突状细胞 (DCs)培养生物特性的影响 ,为DCs的应用提供冻存方法。方法 :设未冻存脐血细胞 (UFCB)经增殖培养后产生的DCs(UFDCs)为对照组 ,来源于经低温冻存的脐血 (CPCB)的DCs和经低温冻存的DCs(CPDCs)为实验组 ,比较实验组与对照组DCs生物特性 ,包括细胞增殖量 ,不染色和染色的细胞形态 ,台盼蓝拒染回收率 (TBR) ;细胞表面抗原 ;混合淋巴细胞培养剌激指数 (SI)、抗毒 杀灭效应处理率(ER)。结果 :CPCB与UFCB比 ,形成DCs的时间迟 ,细胞增殖量、树突状细胞量、CD1a、CD83、HLA DR表达、SI、ER均低。CPDCs与UFDCs比 ,形成贴壁树突状细胞迟 ,细胞增殖量、树突状细胞量、CD1a、CD83、HLA DR表达、SI、ER均低。CPCB的TBR为 95.8% ,CPDCs的TBR为 88.7%。结论 :脐血细胞和经增殖培养的脐血DCs ,经低温冻存后复温培养 ,DCs的生物特性有一定的损伤 ,但基本功能仍比较完整 ,回收率均 >85%。

来源于骨髓和脐带血的基质细胞基本特性的比较

目的 比较骨髓与脐带血细胞体外培养基质细胞的基本特性 ,为基质细胞的选择应用提供依据。方法 用Dexter长期培养体系培养骨髓和脐带血基质细胞 ,以细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面及基质细胞支持另一骨髓细胞形成的鹅卵石造血区 (CAFC) ,长期培养起始细胞 (LTC IC)为指标 ,比较两者的生长特性、成分及功能。结果 ①细胞生长特性 :出现贴壁细胞时间 ,骨髓细胞为培养 3d ,脐带血细胞为培养 5～ 6d ;细胞融合成片时间 ,骨髓细胞为培养 10～ 14d ,脐带血细胞为培养 12～ 18d ;第 2 1天细胞增殖数 ,骨髓比脐带血细胞增殖少 ;②细胞成分 :2 1d培养后细胞成分 ,骨髓来源者以成纤维细胞为主 ,其次是巨噬细胞与内皮细胞 ,脂肪细胞最少 ;脐带血细胞来源者 ,以巨噬细胞为主 ,其次是内皮细胞、成纤维细胞 ,偶见脂肪细胞 ;细胞化学与上述结果基本一致 ;细胞表面抗原检测 ,CD14、CD4 5的表达骨髓细胞明显低于脐带血细胞 ;③细胞功能 :骨髓来源的基质细胞较脐带血细胞的基质细胞支持另一骨髓细胞形成的CAFC和LTC IC明显多。结论 ①生长特征 :形成贴壁细胞时间骨髓较脐带血短 ,骨髓细胞比脐带血细胞有核细胞数增殖快、持续时间相对短 ;②细胞成分特性 :骨髓来源形成的基质细胞以成纤维细胞为主 。

来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

背景:间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较。目的:课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-12在解放军海军总医院血液科完成。材料:解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20mL与2mL。解放军海军总医院产科10例健康初产妇脐带血细胞,细胞体积为30mL。方法:采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。当细胞生长汇合至80%～90%时胰蛋白酶-EDTA消化,制成5×108L-1细胞悬液,计为P0。重复上述操作,即为P1,依此类推P2～P5。主要观察指标:细胞生长形态观察,细胞瑞氏-吉姆萨染色结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流式细胞仪检测细胞表面标记。结果:①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞;骨髓间充质干细胞培养5～7d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性。②初始培养和传代培养后,骨髓间充质干细胞多为成纤维样细胞,仅有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-巨噬样细胞。③P1～P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均呈阴性。④与P0细胞比较,传代培养至P5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P<0.05)。⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干细胞接种后≤6%,P0～P5为55.9%～92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P0～P5为19.7%～33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P0～P5为35.4%～93.2%。CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种来源的间充质干细胞均极低。CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质干细胞为12.1%～28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%～21.3%。结论:结果显示在体外培养条件下,骨髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含量次之,细胞成分多。

低温保存对白血病源性树突状细胞的影响

本研究观察低温保存对白血病源性树突状细胞(L-DCs)的生物学特性和功能的影响。取急性、慢性髓系白血病骨髓细胞,将其一部分细胞立即检测,一部分细胞立即培养,一部分细胞加入细胞保护剂低温保存一定时间复温后培养。细胞培养时,在细胞培养体系内加入组合细胞因子并培养12天,然后分别检测3组细胞的细胞形态、细胞免疫表型、混合淋巴细胞反应及细胞毒T淋巴细胞(CTL)效应,并对结果进行相互比较分析。结果表明:在细胞形态学方面,急性、慢性髓系白血病患者骨髓细胞在不染色或在瑞氏染色下仅见白血病细胞,而未观察到"树突状"细胞,但经组合的细胞因子培养后,均出现了"树突状"形态的细胞,低温保存前、后二者比较,无明显差异;在细胞表面免疫标志表达方面,经组合细胞因子培养的细胞与未培养的细胞相比,细胞表面表达的CD80、CD54、HLA-DR、CD1a、CD83、CD86明显上调,而CD14表达则明显下调,低温保存前、后的细胞在上述几种细胞表面免疫表达指标方面相比较无明显差异;低温保存后的白血病细胞经培养后,不仅有明显的混合淋巴细胞反应,而且在与T细胞作用后T细胞表面抗原CD8和CD25免疫标记细胞明显增多,明显地表现了CTL杀伤自体白血病细胞的效应。结论:髓系白血病细胞在组合细胞因子培养条件下,可诱生为L-DC;L-DC的诱生在生物学特性方面不受低温保存的影响。

骨髓细胞液氮长期冻存后间充质干细胞活力研究

目的研究骨髓细胞(BMC)液氮长期冻存后间充质干细胞(MSC)活力。方法从98人份经加低温保护剂、程控降温仪降温、液氮冻存23—25年的BMC中,取20人份复温,复温BMC体外行MSC初始和传代培养,传代细胞再行成骨和神经细胞诱导。检测培养全过程细胞的形态、增殖数量、细胞化学、免疫组化染色和抗原表达,计贴壁细胞回收率、相对增殖率和MSC相对回收率。结果 BMC冻存细胞,初始培养d10时旋涡状生长,d14时成纤维样细胞为(88.2±4.3)%;P1—P5传代培养时,d7旋涡状生长,传至P5时细胞扩增>60倍;P3时,成纤维样细胞为(94.7±3.6)%,细胞高表达CD29、CD90、CD44、CD71、CD73、CD105、CD166和HLA-A/B/C,低表达CD34、CD45和HLA-DR。P3细胞成骨诱导后ALP和茜素红染色强阳性,细胞内ALP含量明显增高;P3细胞神经细胞诱导后神经元烯醇化酶和巢蛋白染色阳性。细胞增殖和周期未发生改变。贴壁细胞回收率、相对增殖率和MSC相对回收率的结果分别为(52.1±5.6)%、(98.1±1.1)%和(48.5±8.6)%。结论用传统降温、液氮冻存骨髓细胞,至少在23—25年时,细胞内MSC性质不变、活力良好,达到了长期冻存的目的 。

低温冻存脐血树突状细胞的生物特性研究

目的 考察经低温保存的脐血树突状细胞所表现的生物特性 ,为树突状细胞的应用提供保存方法。方法 取新鲜脐血细胞和脐血细胞培养产生的树突状细胞 ,加 5 %二甲基亚砜 6 %羟乙基淀粉的保存剂 ,- 80℃冰箱降温 ,- 196℃保存 ,4 0℃复温 (前者称“冻存脐血” ,后者称“树突状细胞”) ,再用树状突细胞培养增殖法培养 ,检测 :细胞增殖量 ,台盼蓝拒染回收率 ,不染色和染色观察 ,表面抗原 ,树状突细胞的混合淋巴细胞刺激指数、抗毒 杀灭效应处理率 ,比较其变化。结果 形成树突状细胞的时间冻存脐血培养比新鲜脐血迟 ,细胞增殖量低 ,冻存脐血台盼蓝拒染为 95 8%。冻存树突状细胞形成贴壁树突样细胞比新鲜树突状细胞迟 ,细胞数增殖量低 ,冻存树突状细胞的台盼蓝拒染为 88 7%。冻存脐血与新鲜脐血比 ,冻存树突状细胞与新鲜树突状细胞比 ,其树突样细胞量、CD1a、CD83、HLA DR表达低 ;冻存脐血与新鲜脐血比 ,冻存树突状细胞与新鲜树突状细胞比 ,刺激指数、效应处理率均低。结论 用 5 %二甲基亚砜 6 %羟乙基淀粉低温保存脐血细胞或经培养增殖的脐血树突状细胞 ,复温后培养 ,树突状细胞的生物特性受到了损伤 ,但仍完整 ,回收率 >85 %。

二甲基亚砜与羟乙基淀粉程控降温与低温冰箱降温保存造血干细胞的比较

目的为造血干细胞的低温保存选择合适的保护剂和简便的保存方法。方法血细胞分离机分离的外周血细胞,加入二甲基亚砜或羟乙基淀粉,超低温冰箱降温(保存)或自控程序降温液氮保存,定期检测细胞的粒单系造血细胞、长期培养起始细胞、CD34+细胞、台盼蓝拒染细胞,计回收率。结果超低温冰箱降温保存与自控程序降温在液氮内保存,复温后粒单系造血细胞、长期培养起始细胞、CD34+细胞、台盼蓝拒染细胞的回收率,就降温与保存条件而言,两者差异不明显,但就保护剂来说5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉优于10%二甲基亚砜。超低温冰箱降温液氮保存和超低温冰箱降温保存,与自控程序降温液氮保存比较,在1年内保存良好,无明显差异(P>0.05);但2年后,超低温冰箱降温保存者细胞活力下降。细胞复温后,细胞内保护剂不稀释也不洗涤,在室温放置,则对细胞活力有影响,以10%二甲基亚砜为保护剂影响最大;而5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉为保护剂者虽然对细胞也有影响,但比10%二甲基亚砜为保护剂者影响要小。结论保存外周血干细胞时,我们推荐使用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉为保护剂;保存期在1年内,可用超低温冰箱降温保存;超过1年时,超低温冰箱降温用液氮保存。细胞复温后,细胞内保护剂应立即稀释或去除。

人骨髓细胞长期冻存的观察

深低温保存骨髓细胞有重要的临床意义,当前主要是利用液氮来进行.理论上讲,深低温下,细胞生机停滞,一切代谢停止,其活力可以永远保存.本文报告我们的人骨髓细胞冻存十年的活力观察.

脐带血清在骨髓造血祖细胞培养中的效应

目的 :探讨人脐带血清 (CBS)在骨髓造血祖细胞培养中的效应。方法 :用人骨髓细胞进行CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM培养。结果 :CBS能直接刺激骨髓细胞CFU GM的形成。与血型相同否无关。四人份以上的混合CBS(MCBS) ,刺激活性高且稳定。 1 0 %MCBS相当于 6 5 .6 μg/LGM CSF、0 .2 3、0 .3、0 .46kU/LEpO对CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM所起的作用。MCBS可提高CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM常规体系的集落产率。在CFU GM培养时 ,2 0 %MCBS与 1 0 0 μg/LGM CSF和 2 0 %马血清具有相同的效果。MCBS可直接刺激CFU E形成。如培养体系内无BpA存在时 ,形成BFU E、CFU GEMM较少或几乎为零 ,当含BpA时 ,可形成一定量的BFU E、CFU GEMM集落。结论 :CBS(MCBS)内 :①含有GM CSF、Epo等物质或因素 ;②具有刺激CFU GM、CFU E、BFU E、CFU GEMM的生长活性 ;③同血型或不同血型 4人份以上混合 ,刺激活性高且稳定。具有良好的应用前景。

人骨髓细胞长期冻存的观察

以１０％二甲基亚砜作冷冻保护剂，用“二步”冻存法在液氮液相中冻存１７份骨髓细胞，１、５、１０年ＣＦＵ—ＧＭ回收率分别为７２．４±１２．３％、６９．７％±１０．３％和５５．５±１８．８％，计算出ＣＦＵ—ＧＭ回收率相关公式Ｙ＝０．７６２４—０．０２０９Ｘ。表明在液氮中不能无限期保存骨髓细胞活力。但用２０％ＦＭ—ＣＭ、ＰＨＡ—ＬＹＣＭ、ＰＨＡ—ＰＭＣＭ孵育冻存骨髓细胞，其ＣＦＵ—ＧＭ、ＢＦＵ—Ｅ、ＣＦＵ—ｍｉｘ集落产率明显增加，仅含ＣＦＵ—ＧＥＭｍ的集落产率不增加，此现象说明部分经冷冻保存损伤的造血细胞能在一定条件恢复其活力。

人骨髓细胞长期低温保存的研究

目的:探讨人骨髓在液氮长期保存下造血细胞活力.方法:以10%二甲基亚砜、“二步”冻存法在液氮液相中冻存人骨髓细胞,用造血细胞培养的集落形成为指标,定期观察造血细胞活力.结果:20份人骨髓,1～15年CFU-GM回收率由(72.4±10.3)%下降至(40.5±13.2)%,CFU-GM回收率相关公式为:Y=0.7822-0.02573X.15年后BFU-E、CFU-GEMM、LTC-IC形成能力良好.结论:在液氮液相中冻存入骨髓,15年后仍有较好的造血细胞活力.

脐带血清在骨髓造血祖细胞培养中的效应

目的:探讨人脐带血清(CBS)在骨髓造血祖细胞培养中的效应,为脐血的应用提供实验依据.方法:用人骨髓单个核细胞,分别加入CBS或混合脐带血清(MCBS)和细胞因子,进行造血祖细胞(CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM)培养,观察集落数.结果:10%CBS能直接刺激骨髓细胞CFU-GM的形成.CBS的刺激活性和骨髓细胞血型相同与否无关.4人份以上的MCBS,刺激产生的CFU-GM显著高于单人份、双人份混合者,活性稳定.在CFU-GM培养时,20%MCBS与100ng/mlGM-CSF、20%马血清具有相同的效果.MCBS可提高CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM常规体系的集落产率.10%MCBS相当于65.6ng/ml GM-CSF、0.23U/ml、0.3U/ml 0.46U/ml Epo对CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM所起的作用.20%MCBS可直接刺激CFU-E形成.如培养体系内无BpA(爆式集落活性)存在时,形成 BFU-E、CFU-GEMM较少或几乎为零,当含BpA时,可形成一定量的BFU-E、CFU-GEMM集落.结论:CBS(MCBS)内含有能刺激CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-GEMM的生长活性;同血型或不同血型4人份以上混合,其刺激活性高,且稳定.具有良好的应用前景.

人骨髓细胞长期冻存的观察

目的:研究深低温保存人骨髓细胞。方法:用10%二甲基亚砜作冷冻保护剂的“二步”冻存法在液氮液相中冻存。结果:17份骨髓细胞,1、5、10年 CFU-GM 回收率分别为72.4±12.3%,69.7±10.3%,55.5±18.8%,计算出 CFU-GM 回收率相关公式 Y=0.7624-0.0209X。结论:深低温下不能无限期保存骨髓细胞活力,但在一定时间内,冻存的效果还是比较满意的。