微生物药物外排泵及其抑制剂研究

细菌自身的不断进化及抗生素的不合理使用导致了耐药性细菌的出现和蔓延,微生物的主动外排是导致细菌产生多重耐药的重要原因。微生物外排泵的研究是目前的热点之一,也被认为是开发新抗生素的理想靶标。本文从基因组和比较基因组水平对外排泵的类型、作用机制、表达调控及研究方法等方面概述,并结合正在开展的分枝杆菌的药物外排泵进行了比较基因组分析。这些工作有利于开发新的抗生素或抗生素增效剂。

儿童与成人慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒Core基因区准种特征及正选择压力差异分析

儿童与成人慢性乙型肝炎患者的临床特征差异明显。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)病毒准种特征与其致病特性紧密相连,HBV病毒Core基因区富含免疫表位,该区域的准种特征直接反映病毒变异与病毒应对宿主免疫压力间的动态过程。文章通过扩增170名儿童慢性乙型肝炎患者及121名成人慢性乙型肝炎患者病毒Core基因区,按照病毒基因型以及病毒e抗原(Hepatitis B virus e antigen,HBe Ag)状态进行分组,使用序列复杂度、多样性、非同义突变率(Non-synonymous substitution ratio,d N)、同义突变率(Synonymous substitution ratios,d S)等指标衡量不同组别之间的病毒准种特征;使用不同模型计算不同组别中受到正选择压力的位点,进一步结合HBV Core基因区免疫表位信息,进行正选择位点的定位分析。结果发现,儿童乙型肝炎病毒患者体内病毒Core基因区序列复杂性和多样性低于成人患者,且前者Core基因区正选择位点个数显著低于后者,这说明儿童慢性乙型肝炎患者体内病毒受到的选择压力低于成人患者。在儿童及成人慢性感染病人组中,HBe Ag阳性病人体内病毒受到的选择压力低于HBe Ag阴性病人。儿童及成人慢性感染患者体内病毒存在13个正选择位点,大多数正选择位点位于已知的抗原表位上。本研究从分子进化角度揭示了儿童与成人慢性乙型肝炎病例体内病毒Core基因区序列准种差异,为两类病人显著不同的临床表征提供了群体遗传学的解释。

重庆地区乙肝疫苗免疫无效儿童病毒基因组表面抗原区变异研究

目的 :探讨重庆地区乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)疫苗免疫失败儿童患者体内病毒表面抗原(surface gene)基因主要亲水区(major hydrophilic region,MHR)及a决定簇变异情况。方法:收集乙型肝炎病毒疫苗免疫保护失败患儿及未接种疫苗的乙型肝炎病毒感染患儿血清样本,通过扩增HBV S基因并测序,与相应基因型的标准序列进行比对分析。结果:243例免疫保护失败患儿体内病毒a决定簇突变检出率明显高于20例未经疫苗免疫组患儿(31.7%vs.10.0%,P=0.044);免疫失败组儿童体内病毒MHR突变率数值也高于未接种组儿童,在统计学上差异不显著(49.8%vs.30.0%,P=0.106)。在疫苗免疫失败儿童病例中,MHR和a决定簇突变发生与病毒低水平复制相关:突变组患儿DNA滴度均明显低于无突变组患儿(log106.9±1.8vs.log107.7±1.8,P=0.000;log107.1±1.6 vs.log107.6±1.9,P=0.000)。免疫失败儿童病例中,MHR突变组儿童谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)数值也明显高于未突变组(67.1±58.8 vs.56.5±51.8,P=0.018)。在243例疫苗免疫保护失败儿童体内病毒MHR区域中共检出145个变异氨基酸,热点变异类型主要包括I110L(6例)、K122R(15例)、T126A(18例)、I126T(14例)、M133L(7例)、G145R(6例)及Y161F(12例)等。进一步分析各类型突变与临床表型间差异,发现含G145R及Y161F突变病例体内血清病毒DNA水平明显低于无突变组(log106.8±1.1 vs.log107.5±1.8,P=0.048;log105.0±2.6 vs.log107.3±1.8,P=0.000)。结论:疫苗免疫保护失败儿童病例体内病毒a决定簇及MHR具有较高的突变率,且该区段的突变与病毒较低的复制水平及及较高的ALT相关。

应用滚环扩增研究肝癌组织中的HBV cccDNA

目的:运用滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)分离肝癌患者组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,ccc DNA),研究pre-S区的缺失。方法:对RCA技术的特异性和灵敏度进行了研究,并应用该技术扩增13对癌组织和癌旁组织中HBV ccc DNA,对pre-S区的缺失进行了研究。结果:RCA能够高效,特异的扩增组织中10拷贝/μl HBV ccc DNA;26例样本中,22例样本的HBV ccc DNA能够被RCA撤增测序,其中有8例样本(8/22,36.4%)在pre-S区域存在着缺失,pre-S2缺失比例高于pre-S1(8/8 vs.2/8,P=0.007)。结论:首次发现肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中HBV ccc DNA存在着pre-S区的缺失,有助于深入理解ccc DNA pre-S区缺失与HCC的关系。

新型抗乙型肝炎病毒药物研发进展

现有的抗乙型肝炎病毒药物不能有效清除病毒cccDNA,难以实现慢性乙型肝炎的功能性治愈。本文结合乙型肝炎病毒生物学周期,探讨了靶向乙型肝炎病毒胞内受体、病毒DNA聚合酶、核衣壳装配、表面抗原分泌以及病毒cccDNA的前导药物的最新研发进展,以期获得抗乙型肝炎病毒的新思路及新方法。

CRISPR-Cas9系统抑制乙型肝炎病毒复制相关研究

目的:探讨成簇的、规律间隔的短回文重复序列-相关核酸酶9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein-9 nuclease,CRISPR-Cas9)技术的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作用。方法:通过生物信息学筛选,获得12条靶向HBV基因组不同区域的sg RNA(single-guide RNA,sg RNA)并分别构建psp Cas9-sg RNA质粒,与HBV1.3倍体复制质粒共转染至Hep G2细胞,通过荧光定量PCR筛选能够有效抑制HBV复制的sg RNA,并使用Southern blot验证获得的sg RNA功能;使用最新报道的重组共价闭合环状DNA(recombinant covalently closed circular DNA,rccc DNA)模型评估CRISPRCas9对HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,ccc DNA)的抑制水平,并通过克隆测序检测rccc DNA的突变状况;对C57小鼠进行尾静脉高压水动力注射(hydrodynamic injection,HDI)rccc DNA质粒与psp Cas9-sg RNA,检测不同时间点外周血中乙型肝炎病毒s抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)及e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBe Ag)水平,通过免疫组化技术观察CRISPR-Cas9处理后肝脏中乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core antigen,HBc Ag)水平,在动物水平评估CRISPR-Cas9对HBV复制的抑制作用。结果:所筛选的靶向乙型肝炎病毒基因组聚合酶编码区以及衣壳蛋白编码区的sg RNA5及sg RNA9能有效抑制细胞中HBV复制,分别使细胞复制模型中rc DNA降低至对照组的(43.64±4.66)%(P=0.000)和(44.86±2.25)%(P=0.000);在r CCCDNA细胞模型中证实2组sg RNA分别使ccc DNA降低至对照组的(29.39±3.18)%(P=0.000)及(26.83±1.76)%(P=0.000);CRISPR-Cas9系统主要使rccc DNA的靶点区域发生以短片段缺失为主的突变,突变率位50%~60%。CRISPR-Cas9系统能够有效降低HBV水动力小鼠模型血清HBs Ag(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.001)及HBe Ag浓度(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.000);小鼠血清HBV DNA水平与对照组相比降低约1个lg值(sg RNA5:P=0.000;sg RNA9:P=0.001),肝脏免疫组化结果显示CRISPR-Cas9系统能够降低组织HBc Ag表达。结论:CRISPR-Cas9系统作为一种基因编辑技术,能够在细胞水平及动物模型中发挥抗HBV作用,可以作为一种新型的抗病毒策略并为HBV感染的治疗提供了一个新的方向。

以1例胫腓骨骨折病例谈主诉于护理工作的重要性

目的探讨病人主诉对护理工作的重要性。方法以1例胫骨骨折病人住院期间的护理问题分析探讨主诉对护理工作的重要性。

喹诺酮类药物作用的生理和遗传的分子机制

氟喹诺酮类药物是目前使用最广泛的广谱抗生素,占据了全球抗生素类药物市场约18%的份额。其杀菌快速,而且具备大量的衍生物库,为药物更新换代提供了良好的基础。但这些衍生物在杀菌的速度、代谢过程中对氧需求、对蛋白合成的依赖性等方面的差异很大。从药物作用后细菌分子遗传层面的应答特征揭示各类衍生物的深层次作用机制,可以为寻找更有效的新喹诺酮类药物提供坚实基础。SOS应答、毒素-抗毒素系统,细菌程序性死亡、染色体片段化以及活性氧簇等新机制可能不同程度参与了喹诺酮类药物的杀菌过程。本文重点介绍喹诺酮作用的"二步特征"。该特征的引入有助于理解不同喹诺酮类药物的杀菌特征,也有助于开发新的喹诺酮类药物。

基于对结核分枝杆菌持留机制新认识的药物靶标开发进展

结核病是严重危害人类健康的传染病。全球大约1／3的人口感染过结核菌，其中1／10可能转化为活动性结核病，其余为潜伏感染人群。人类免疫缺陷病毒（HIV）共感染、糖尿病、肿瘤坏死因子治疗等免疫抑制状态极易激发潜伏结核病为活动性结核病。目前全球结核病控制策略主要集中在筛选和治疗活动性结核病，潜伏感染者的发现和及时干预是该领域极其欠缺、研究亟待突破的一个方面。造成潜伏性结核病的是持留结核分枝杆菌（简称结核菌），该亚群的基础生物学特征（潜伏期的结核菌的生理状态、代谢活性、肉芽肿中的结核菌所面对的微环境以及结核菌抵抗或者逃脱宿主的免疫机制等）的阐明是开发有效新药的关键，以此为基础我们综述r针对持留性结核菌药物靶标的最新开发进展。

应用噬菌体生物扩增法对HIV/TB双重感染患者抗结核药耐药性分析研究

目的利用噬菌体生物扩增法(PhaB)分析人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核病(TB)双重感染患者的结核分枝杆菌的耐药状况,优化防治对策。方法运用PhaB法对重庆市第九人民医院收治的112例HIV/TB双重感染患者(HIV/TB组)做TB菌的药敏检测,并与208例单纯肺结核患者(单纯TB组)的药敏检测做对比分析。结果 HIV/TB组的抗TB药耐药率要比单纯TB组低,HIV/TB双重感染患者5种常见抗TB药物的耐药率分别为异烟肼(INH)7.14%、吡嗪酰胺(PZA)7.14%、利福平(RFP)5.36%、链霉素(SM)5.36%、乙胺丁醇(EMB)4.46%,与单纯TB组患者比较(RFP 17.31%、INH 13.46%、PZA11.54%、EMB 10.58%、SM 9.62%),HIV/TB组RFP的耐药率低于单纯TB组,差异有统计学意义(P<0.05),其他4种抗TB药耐药率与单纯TB组比较差异无统计学意义(P>0.05),与绝对浓度法结果符合率分别为INH 96.4%、RFP 98.2%、PZA 96.4%、EMB 93.8%和SM 96.4%。结论本地区HIV/TB双重感染患者结核分枝杆菌对RFP耐药率较普通肺结核患者低,与该类患者良好的服药依从性相关。PhaB测定所需时间短,操作简便,不需特殊仪器设备,可作为结核分枝杆菌耐药性的快速筛选方法。

突变选择窗理论在新抗生素研发及临床中应用的研究进展

目的综述突变选择窗在抗生素研发及临床应用中的新进展。方法查阅近年来的研究文献,概述了该理论的概念、原理、应用范围、基于此理论的治疗策略和在新抗生素研发中的应用。结果根据突变选择窗理论,可以通过增加抗生素用量、联合用药或开发选择窗窄的新药等策略抑制耐药菌株的产生。结论突变选择窗理论在防止耐药性病菌出现方面具有重要应用。同时也讨论了突变选择窗理论的不足和值得努力的方向。