超氧化物歧化酶(SOD)研究进展

环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧 ,从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的酶类包括超氧化物歧化酶 (SOD)、抗坏血酸过氧化物酶 (APX)、过氧化氢酶 (CAT)等 ,其中研究最深入的是SOD。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量 ,从而获得抗逆转基因植株。

新型金属卟啉的合成及其仿酶活性研究

合成并表征了一系列水溶性和非水溶性金属卟啉 3a～3e，5a～5f和 8a～8f；测试了这些金属卟啉作为超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的模拟物催化歧化O2-和催化分解H2O2等有毒氧自由基的活性及抗脂质过氧化性质．结果表明，含有吡啶溴化盐的水溶性金属卟啉8a～8f的仿酶活性明显大于含有羟基的非水溶性金属卟啉3a～3e和含有酯基的金属卟啉5a～5f．

氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶活性的适宜条件

氮蓝四唑(NBT)光化还原法是测定超氧化物歧化酶(SOD)活性的常见方法。尽管已有不少人对影响NBT光化还原法测定SOD活性的因素进行了研究,如温度、NBT浓度的影响,过氧化物酶的干扰等,但最突出的问题是照光反应时间的差异。本文通过对照光反应时间、粗酶液体积与抑制百分率之间关系的研究,进一步明确NBT光化还原法测定SOD活性的最适条件。

杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究

杂色云芝发酵液,经超滤、DEAE-Sephadex A250柱层析两步分离、纯化出两型漆酶.以愈创木酚与酶带在适当条件下反应呈棕红色谱带鉴定出漆酶谱带.两型漆酶分别命名为LacA和LacB.经测定两漆酶亚基的分子量分别为66.0kDa和30.7kDa;等电点pI分别为4.79和5.18;LacA的最适作用温度是40℃,LacB为50℃;保温2h, LacA的半失活温度为60℃,LacB为90℃;LacA和LacB催化愈创木酚的酶活最适pH值均为4.0; 二者的稳定pH值也都在2.5～5.5之间.LacA催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为286.5μmol·L-1和292.4nmol·mL-1·min-1;LacB催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为813.0μmol·L-1和127.4nmol·mL-1·min-1.

悬浮物对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)幼鱼肝脏溶菌酶、超氧化物歧化酶和鳃丝Na^＋-K^＋ATPase活力的影响

在实验室条件下构建不同的悬浮物浓度环境,采用试剂盒分析方法研究了不同浓度悬浮物对半滑舌鳎幼鱼肝脏溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)和鳃丝Na+-K+-ATPase活力的影响。养殖水体中悬浮物浓度添加量分别为0(对照)、50、100、200和400mg/L,每5天采样测定一次,实验周期为25天。结果表明,当悬浮物浓度添加量为50和100mg/L时,肝脏LSZ和SOD活力与对照组无显著差异(P>0.05),当添加量为200和400mg/L时,肝脏LSZ和SOD活力与对照组有显著差异(P<0.05);实验后期各实验组鳃丝Na+-K+-ATPase活力与对照组均有显著差异(P<0.05)。在悬浮物效应的25天内,各实验组肝脏LSZ活力呈峰值变化,10天时除100mg/L浓度添加组外均达到最大值;而肝脏SOD活力在50和100mg/L浓度添加组略有升高,在200和400mg/L浓度添加组则基本呈下降趋势;鳃丝Na+-K+-ATPase活力前10天各实验组较对照组无显著变化,之后则显著降低,后期基本趋于稳定,其活力低于初始水平;实验结束时,各实验组其肝脏LSZ、SOD和鳃丝Na+-K+-ATPase活力相对于对照组都受到了不同程度的抑制,其中各实验组鳃丝Na+-K+-ATPase活力抑制率分别达到了27.6%、65.2%、57.0%和71.1%。

一种改进的漆酶酶活检测方法

以 2 ,2′ -连氮 -双 (3-乙基苯并噻唑 - 6 -磺酸铵 ) (简称ABTS)为漆酶A、B的底物 ,采用UV - 2 2 0 1型紫外 -可见分光光度计连续记录酶反应在 2 5℃ ,4 2 0nm波长下的时间历程曲线 ,并求取最初部分的斜率以计算漆酶酶活的方法 .该方法直观、方便、准确且可靠 .在 2 5℃的 0 .0 4mol/LBritton Robinson缓冲溶液中 ,漆酶A、B的最适 pH值分别为 4 .0和 4 .5 .在 2 5℃最适 pH值的Britton Robinson缓冲液中 ,由双倒数作图法求得漆酶A、B的米氏常数Km 分别是 6 .6 4× 1 0 - 5mol/L和 2 .2 1× 1 0 - 5mol/L ,漆酶A、B的最大米氏反应速度Vmax分别是 1 4 2 5μmol.M (L·min)和 32 5μmol.M (L·min) .漆酶A、B的酶活分别为 2 2 99μmol·min- 1·L- 1和 1 1 4 8μmol·min- 1·L- 1.

克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶发酵条件研究

研究了克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶(甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶)的发酵条件。研究各种碳源、无机氮源、有机氮源及无机盐对产酶的影响,应用均匀设计、神经网络和遗传算法优化发酵培养基组成,结果为(gL-1):甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl2 0.28、酵母浸膏2.8。在温度37 C、初始pH 7.0、摇床转速200rmin-1和接种量5%条件下,发酵24h,无细胞抽提液中甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶活力(U·mg-1)分别为9.16、18.72、0.48,发酵34h,发酵液中1,3-丙二醇(1,3-PD)最大浓度为7.96gL-1。代谢过程中关键酶酶活与1,3-PD峰值出现时间不一致,且提早于1,3-PD峰值的出现。此外,结果表明优化后的培养基去除了多种微量元素,克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶可以在微氧条件下进行。

过量表达小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因对烟草耐盐能力的影响

利用前期克隆的小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因TaSOD1.1和TaSOD1.2,构建融合上述基因编码阅读框(ORF)的双元表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得了过量表达TaSOD1.1和TaSOD1.2的转基因烟草植株。研究表明,NaCl处理下,与对照相比,转基因植株伤害较小,叶片失绿面积较少,植株长势明显增强,叶片的SOD活性均明显提高,而MDA含量明显降低。转基因植株的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量,以及可溶性糖和可溶性蛋白含量也表现与SOD活性相同的趋势。表明在烟草中高表达小麦TaSOD1.1和TaSOD1.2基因,通过外源基因在转录水平上的调节,能增加植株SOD活性,减轻盐分胁迫造成的细胞膜质过氧化,增强植株抵御盐分胁迫的能力。

动力学分光光度法测定中药对超氧阴离子自由基的清除率

建立了一种利用动力学分光光度法测定中药对超氧阴离子自由基清除率的新方法。研究表明:当波长为5 2 0nm、黄嘌呤氧化酶浓度为4×10 -3 μg·mL-1,反应时间在2～7min时,可得到最佳测定条件。在该条件下测得的抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除率与文献报道值一致。方法用于中药厚朴和杜仲的测定,它们对超氧阴离子自由基的IC50 分别为7 5. 80和32 3. 80 0mg·L-1。

甲硫氨酸亚砜还原酶的高通量活性级联催化筛选

目的建立一种甲硫氨酸亚砜还原酶(Msr)的高通量活性级联催化筛选系统,为后续的定向进化改造等研究提供简便高效的活性筛选方法。方法诱导甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)、甲硫氨酸亚砜还原酶B(MsrB)、硫氧还蛋白(Trx)及硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的重组表达,使用气相色谱及手性液相色谱分别检测反应体系中NADPH参与MsrA/MsrB催化消旋体苯甲亚砜还原成硫醚的转化率及对映体过量(ee)值。构建MsrA/MsrB+Trx+TrxR+NADPH的微量级联催化反应系统,使用酶标仪实时检测NADPH在340 nm吸光度值的减少量,监测MsrA和MsrB的酶活性。结果在NADPH参与下,MsrA、MsrB展出了苯甲亚砜还原活性,以及较好的对应选择性,表明NADPH参与了MsrA、MsrB催化消旋体苯甲亚砜还原成硫醚。建立了MsrA和MsrB的96孔微量重组表达体系,并通过级联催化系统在每一个培养孔中均成功检出MsrA和MsrB的催化活性。而且,每个培养孔中,重组蛋白活性均较为一致,MsrA的差异系数在10.64%以下,MsrB的差异系数在4.10%以下。结论成功开发了一种简便、高效的甲硫氨酸亚砜还原酶高通量活性筛选级联催化系统,为后续进行该酶的定向进化改造提供一种快速简便的大规模筛选方案。

噻二唑类席夫碱配合物的合成及其抗超氧阴离子活性

天然SOD普遍存在稳定性差 ,分子量大 ,不容易透过细胞膜 ,且有免疫原性等缺点 ,使其应用受到限制 ,所以SOD模拟物的研究已成为广泛关注的课题。笔者合成了由 2 -氨基 - 5 -巯基 - 1,3,4-噻二唑和水杨醛缩合的含噻二唑类新型席夫碱配体H2 L及其与Cu(Ⅱ )、Co(Ⅱ )、Zn(Ⅱ )的配合物 ,用元素分析、红外光谱、紫外可见光谱和摩尔电导等测试对所有化合物进行了表征 ;同时 ,采用NBT法对各配合物在各种浓度下的抗超氧阴离子自由基活性进行了测定 。

动物锰营养中含锰超氧化物歧化酶研究进展

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是一种催化超氧阴离子自由基发生歧化反应 ,生成氧和过氧化氢的重要含锰金属酶。本文对MnSOD的分布、结构、活性、基因表达以及动物饲粮锰及其它因素对MnSOD的调节等进行了综述 。

灵芝漆酶活性的测定及其产漆酶条件的优化

从测定漆酶活性的几种常用方法中,筛选出一种快速、稳定的灵芝漆酶测定方法:在基础培养基中加入0.04%愈创木酚,通过测定显色圈直径检测漆酶的活性;同时利用单因素分析和正交试验确定了灵芝的最适产漆酶条件:麦芽糖3%、酵母浸粉0.25%、pH值6.0、Cu2+0.5mmol/L,培养温度25℃。实验结果为灵芝的菌种选育及其漆酶的工业化生产提供了一定的参考。

植物SOD基因表达调控的分子机制

SOD是活性氧清除系统中一种最重要的金属酶,在清除生物体产生的超氧阴离子自由基中起关键性作用。SOD基因的表达调控十分复杂,在转录水平上受到转录因子的调控,在转录后水平上主要受到microRNA的调控,同时存在翻译水平上的调控。本文重点阐述了SOD的结构和功能,转录水平和转录后水平SOD基因表达调控的分子机制及SOD与植物抗逆性的关系。

云芝菌发酵产漆酶及其对靛蓝脱色的研究

采用云芝菌(Coriolus versicolor)摇瓶发酵生产漆酶,对主要的工艺参数进行了优化。研究结果表明:木质纤维废弃物木糖渣可用作云芝菌产酶的有效碳源,其适宜浓度为20.0g·L-1;在培养基中添加10.0g·L-1葡萄糖可以促进菌种的前期生长,有利于发酵后期漆酶的分泌合成;产酶培养基的最适C/N为20;适量的Cu2+和维生素C对漆酶的生成有明显促进作用,其适宜浓度分别为0.100mmolh·L-1和1.500mmol·L-1。3.7L自控式发酵罐中的产酶试验显示:最适通气量为100L·h-1。在云芝菌的发酵进程中,前期主要为营养生长,产酶高峰期出现在发酵后期。在优化条件下发酵144h,漆酶活力可高达2474.2IU·mL-1。采用上述粗酶液处理靛蓝染料,当靛蓝浓度为50mg·L-1,粗酶液用量为0.45%(V:V)时,反应40min,脱色率可达到94.8%。试验结果显示,漆酶在牛仔服生物整理及染整废水的脱色净化处理中具有良好的应用前景。

发菜中超氧化物歧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程技术从发菜总DNA中克隆了一段的基因序列,该序列与基因库中已公布的编码地木耳(Nostoc commnue)超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为97%。将该基因插入含T7启动子质粒pET-32中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用1 mmol.L-1IPTG诱导表达数小时后,产生较多的重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE分析表明,在相对分子量约为22 kd的位置有一条明显蛋白质带。将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2 550 U。对纯化后的蛋白进行高温胁迫研究,将该纯化蛋白在60℃高温下胁迫90 min后,其活性为原(未经胁迫)蛋白活性的85%。

运用蚕豆幼苗叶片生物标志物评价铅污染土壤

以蚕豆(Vicia faba L.)幼苗为供试植物,通过室外盆栽实验研究了暴露5周后的蚕豆幼苗叶片应激蛋白(HSP70和HSP60)等相关生物指标对土壤铅胁迫的响应.结果表明,随着外源铅的增加,叶片总铅含量、超氧阴离子自由基(O2.-)和膜脂质过氧化产物都在不同程度上得到增加.相关性分析表明,O2.-与膜脂质过氧化产物(r=0.973,p<0.01)之间存在显著的相关性.超氧物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶活力均被相应的诱导.HSP70和HSP60对铅污染的响应比上述其它生物指标更加敏感.可见,土壤铅进入叶片后,可能通过O2.-的作用诱导了膜脂质过氧化,而4种抗氧化酶活力的提高缓解了活性氧的氧化损伤.HSP70和HSP60可作为土壤铅污染早期诊断的潜在的生物标志物,同时还应该考虑铅的暴露剂量并综合利用其它生物指标.

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、表达、发酵及纯化工艺研究

目的：用基因工程的方法获得人铜锌超氧化物歧化酶（ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ）的高产菌，通过发酵培养，最后纯化获得大量廉价的高纯度的ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ。方法：用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），扩增了人铜锌超氧化物歧化酶（ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ）的ｃＤＮＡ，将此正确测定的ｃＤＮＡ重组到分泌型表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中，重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中用５Ｌ全自动发酵罐表达ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ，表达产物用亲和层析一步法进行纯化。结果：ｈＣｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ表达产物占菌体总蛋白的３０％，发酵水平酶活力可达９５０ｕ·ｍｌ－１培基，比活为１４００ｕ·ｍｇ－１，经亲和层析后纯度可达８８％，活力回收率大于８０％，比活大于５０００ｕ·ｍｇ－１。结论：我们开展人重组ＳＯＤ的研究不仅大大丰富了应用酶学的内容，而且积极开展应用研究，实现产业化，意义重大。

蜂王浆超氧化物歧化酶分离纯化及部分性质研究

本文采用硫酸铵盐析、SephedexG 15 0柱层析从蜂王浆中分离出了超氧化物歧化酶 (SOD)。经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白区带。此酶比活力为 1887.4U/mg ,纯化倍数为 5 2 4.3,回收率为 12 .47% ,最适pH 8.3 ,最适温度为 2 5℃。Mn2 + ,Cu2 + ,Ba2 + ,Mg2 + 对此酶有激活作用 ,Zn2 + 则具有抑制作用。过氧化氢和乙醇 氯仿实验表明 :蜂王浆中的SOD属Cu/Zn