噬菌体PCCM_KpP1172的鉴定及其对大蜡螟幼虫碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌感染的疗效评估

背景碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌感染发生率逐年增加,临床治疗困难,死亡率高。使用具有高裂解能力的噬菌体治疗细菌感染是颇具前景的治疗方法。目的针对碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌分离一株新型裂解性T7噬菌体,对该分离株进行生物学特性测定和基因组学测序分析,为临床开展噬菌体治疗提供可应用的噬菌体资源。方法从肺部感染患者的痰液中分离出肺炎克雷伯菌,通过细菌鉴定、药敏分析、全基因组测序和PCR检测验证菌株的毒力基因与耐药基因,以此株肺炎克雷伯菌为宿主菌,在污水中分离出一株裂解性噬菌体,命名为PCCM_KpP1172。测定该噬菌体生物学特性,分析其基因组序列,并通过大蜡螟幼虫感染模型检测该噬菌体的治疗效果。结果该株肺炎克雷伯菌基因组分析存在耐药基因与毒力基因rmpA2、rmpA、iroN、icu。以此菌株为宿主菌分离到新型肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为PCCM_KpP1172,在宿主菌菌苔上可形成完全透明的噬菌斑并伴晕圈;透射电镜下呈现有尾噬菌体目短尾病毒科病毒的典型形态特征;一步生长曲线显示其潜伏期为15 min,最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.0001,对ST11KL64型肺炎克雷伯菌有广泛裂解范围。基因组分析显示,该噬菌体为双链DNA(总长度为40222 bp),G+C含量为53%,基因组包含49个开放阅读框(open reading frames,ORF),无毒力或抗生素耐药性相关基因。基于系统发育分析,该噬菌体可归属于有尾噬菌体目Studiervirinae亚科Przondovirus属的一个新种。此外,噬菌体PCCM_KpP1172可在体外3 h内有效抑制碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的生长,并能提高宿主菌感染的大蜡螟幼虫存活率(P<0.01)。结论本研究针对碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌分离并鉴定了一株新的T7噬菌体PCCM_KpP1172,具有高裂解力,无耐药基因和毒力基因,对大蜡螟幼虫感染模型具有良好治疗效果。

噬菌体Pu29特性分析及其在沙门氏菌磁分离富集中的应用

以1株鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu29为研究对象,全面分析其生物学及基因组特性,将其作为识别元件,建立基于噬菌体Pu29的沙门氏菌磁分离富集技术。该噬菌体属于轮状病毒属(Roufvirus),具有二十面体的头部和不可收缩的长尾部。Pu29具有较宽的宿主谱,15min时对宿主细胞的吸附率为88.67%,潜伏期为30min,裂解期为180 min,裂解量为115.74 PFU/cell。同时Pu29具有较好的耐热性(30~60℃)和pH值耐受性(pH 4~11)。Pu29基因组由45715bp(GC含量46.08%)和81个开放阅读框组成,包括18个具有已知功能的阅读框,不携带编码毒性或抗性因子的基因。通过酰胺反应将噬菌体Pu29与羧基化的纳米磁珠偶联制备探针PhagePu29-MBs。使用25μg探针与沙门氏菌在37℃孵育20min时,对沙门氏菌的捕获效率最高可达到83.93%,最低捕获细菌浓度为45CFU/mL。采用透射电镜观察到PhagePu29-MBs能够特异性地捕获沙门氏菌。在加标样品中,PhagePu29-MBs分离富集沙门氏菌的捕获效率最高能达到92.92%。该方法分离富集沙门氏菌的时间大约为30min。因此,本研究基于噬菌体Pu29建立了一种快速、特异性强的沙门氏菌磁分离方法,可为基于噬菌体快速分离富集食源性病原菌奠定研究基础。

Comamonas kerstersii细菌致病性的基因组分析

为了更好地管理Comamonas kerstersii(C.kerstersii)感染,通过分析C.kerstersii菌株121606基因组中的毒力因子基因(VFGs)来了解其毒力和致病性。对已经完成测序的C.kerstersii 121606基因组,通过BLAST搜索VFDB数据库来预测其VFGs。结果表明:C.kerstersii含有大量VFGs,其中一些与其在人体内的生存和生长,以及在胃肠道和肺部的致病性有关。基因组分析表明:C.kerstersii可能是一种细胞内病原体。C.kerstersii所携带的VFGs有助于解释其在文献中所报道的胃肠道感染和临床工作中所遇到的肺部感染中的毒力和致病性,这些数据也为新型抗生素和疫苗开发提供了理想的靶点,以用于治疗C.kerstersii感染。

一株多药耐药Comamonas kerstersii细菌的基因组分析

从1名尿路感染患者中分离出了1株多药耐药的Comamonas kerstersii(C.kerstersii)菌株121606,对其进行了抗微生物药敏试验(AST)和全基因组测序;然后将其与7个具有代表性的Comamonas菌株和Acidovorax菌种进行基因组比较分析,包括使用OrthoANI分析平均核苷酸同一性(ANI),以及通过snpTree网络服务器进行单核苷酸多态性(SNP)分析。最后,使用RAST服务器进行基因组序列,使用OrthoVenn软件对同源簇进行功能注释,通过CARD数据库对抗生素耐药基因(ARGs)进行预测,并利用CRISPR识别工具预测CRISPR,以及利用PHAST软件预测前噬菌体。结果表明:C.kerstersii 121606是一种多药耐药细菌,其遗传成分与其他7个Comamonas和Acidovorax菌种相似;其基因组中存在的ARGs有助于解释其多药耐药机制。这些发现为研究新型抗生素来控制多药耐药C.kerstersii感染提供了有价值的见解。

噬菌体裂解酶基因Lys BT1在普通小球藻中的表达

噬菌体裂解酶因高效、安全的杀菌特性成为潜在的抗菌药物,并受到广泛关注。本试验在前期通过基因表达制备高效噬菌体裂解酶Lys BT1的基础上,深度解析Lys BT1与细菌上裂解酶受体相互作用的结构特点,成功构建出质粒pCAMBIA 1301-BT1。将该质粒通过电转化的方式导入普通小球藻中,电转条件为:电场强度1.5 kV、脉冲距离2 mm、脉冲时间0.2 ms,瞬时表达后成功进行了活性测定,从而验证了普通小球藻作为裂解酶表达载体的可行性,为噬菌体裂解酶的表达系统研发提供了一条可行路径。

一株铜绿假单胞菌噬菌体全基因组分析及与抗生素体外联合应用效果

旨在为解决耐药铜绿假单胞菌感染提供不同方法。以鸡源铜绿假单胞菌为宿主菌,从医院污水中分离纯化出铜绿假单胞菌噬菌体,并进行生物学特性研究与基因组学分析,同时采用棋盘法与三种抗生素联合应用测试其效果。结果显示:从医院污水中分离到一株铜绿假单胞菌噬菌体PaVOB,TEM显示病毒颗粒具有一个平均直径为73.02 nm的二十面体头部和一个平均长度为155.57 nm的长尾部,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科,具有双链DNA基因组,宿主谱较窄,耐低温(-20℃)并且在37℃达到最适温度,有良好的酸碱耐受性,在pH为3~12时保持活性,最佳MOI为0.001,一步生长曲线显示潜伏期为10 min,爆发量为50 PFU·cell^(-1),吸附性试验表明PaVOB在10 min的吸附率为99.1%。PaVOB基因组全长为72179 bp,(G+C)%含量为54.81%,与VB PaeP FBPa1亲缘关系小于0.1,ORF预测显示,PaVOB包括74个ORF,软件预测均未发现毒力基因、耐药基因和tRNA存在。此外,抗生素联合应用结果显示,PaVOB与头孢曲松联合应用有协同作用,在效价为107 PFU·mL^(-1)时与恩诺沙星产生协同作用,与庆大霉素产生无关作用。铜绿假单胞菌噬菌体PaVOB对环境适应能力强,且基因组信息清晰,能够选择性地与不同抗生素联合应用发挥协同作用,具有治疗临床耐药铜绿假单胞菌感染的可能性。

群体感应介导细菌-噬菌体间相互作用的研究进展

群体感应系统作为微生物间至关重要的通信机制,与细菌-噬菌体存在着密切的相互作用关系。综述群体感应系统在介导细菌生物被膜形成、细菌各种表面蛋白的形成、原核生物适应性免疫系统来抵抗噬菌体感染的作用和调控噬菌体裂解-溶源决策以优化噬菌体自身生存与繁殖的作用。通过对群体感应系统在细菌-噬菌体间相互作用研究结果的整理和总结,期望能够为全面深入探索群体感应系统在细菌-噬菌体间作用机制提供参考,为噬菌体控制耐药病原菌的传播和治疗提供理论依据。

一株广谱沙门菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

噬菌体能够特异性裂解靶向细菌,被认为是抗生素有效替代者。为了筛选到有效裂解沙门菌的噬菌体,为探索新的沙门菌防控方法提供理论依据和参考。本研究用丝裂霉素C诱导并分离纯化沙门菌噬菌体,通过噬菌斑与电子显微镜观察、宿主谱测定、生物学特性测定以及对该噬菌体的全基因组进行测序分析评估该噬菌体。结果显示:成功诱导出1株广谱的长尾沙门菌噬菌体,命名为SP18-108,该噬菌体能够裂解至少14种不同血清型沙门菌;在30~40℃及pH 4~12条件下活性稳定;全基因组分析结果显示,该噬菌体全长为43250 bp,GC%含量为49.96%,已知功能编码序列(coding sequences,CDS)占比为52%。系统发育进化树分析表明,该噬菌体属于长尾病毒科(Siphoviridae)。本研究诱导过程中分离出1株不具有溶源基因的广谱沙门菌噬菌体,为进一步研究沙门菌抗菌剂提供了良好的材料。

大肠杆菌烈性噬菌体vB_EcoM_JN03的分离、鉴定及其抑菌效果研究

【目的】大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种重要的食源性致病菌。抗生素的不当使用导致E.coli O157:H7多重耐药和泛耐药成为一个日益严重的问题,研究其天然杀菌剂——烈性噬菌体,对于防控多重耐药E.coli O157:H7污染具有理论意义和实践应用价值。【方法】以多重耐药E.coli O157:H7为宿主菌,采用双层琼脂平板法,从污水中分离烈性噬菌体,对其生物学特性进行表征和全基因组序列分析,并评价该噬菌体应用于食品中对E.coli O157:H7的抑菌效果。【结果】成功分离纯化了一株可裂解E.coli O157:H7的噬菌体,命名为vB_EcoM_JN03(GenBank登录号:OR885871)。vB_EcoM_JN03属于有尾噬菌体目,肌尾病毒科;其最佳感染复数(MOI)为0.01,潜伏期为30 min,120 min后到达平稳期,裂解量80 PFU/cell;其在30~60℃和pH 4~12范围内效价稳定。vB_EcoM_JN03的基因组为双链DNA,全长158142 bp,G+C含量44.63%,编码206个开放阅读框(ORF),不含已知编码的毒力、抗生素耐药和溶源性基因。vB_EcoM_JN03在4℃下可显著抑制牛奶和牛肉样品中污染的E.coli O157:H7。【结论】经分离、鉴定的E.coli O157:H7烈性噬菌体vB_EcoM_JN03对宿主菌具有良好的抑制作用,有望作为一种天然杀菌剂防控E.coli O157:H7污染食品。

霍氏肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究

【目的】探究霍氏肠杆菌噬菌体的形态特征和生物学特性,预防和控制霍氏肠杆菌感染。【方法】本研究以霍氏肠杆菌为宿主菌,使用双层琼脂平板法从污水和淤泥中分离噬菌体并进行生物学特性研究。用透射电镜观察纯化后噬菌体的形态特征,测定噬菌体效价、温度稳定性、pH稳定性、最佳感染复数及一步生长曲线。【结果】成功分离鉴定出1株霍氏肠杆菌噬菌体,并命名为H2;该噬菌体在双层琼脂平板上形成大小均一、圆形透明的噬菌斑;透射电镜观察结果显示,噬菌体H2的头部呈二十面体对称,直径为85 nm±2 nm,具有一长尾且有尾丝,尾部长190 nm±2 nm,归属于尾噬菌体目、肌尾噬菌体科;噬菌体H2的温度稳定性和pH稳定性结果显示,在35~55℃、pH 5.0~9.0范围内效价基本保持稳定;最佳感染复数为0.0001;根据最佳感染复数绘制一步生长曲线,测得噬菌体H2的潜伏期约为20 min,爆发期约为50 min,平均裂解量约为68 PFU/cell。【结论】噬菌体H2具有裂解能力强、热稳定和酸碱稳定等优点,本研究为后续霍氏肠杆菌噬菌体制剂的研发提供了良好的研究材料。

Temperate Stutzerimonas Phage Encoding Toxin-Antitoxin System Genes Represents a Novel Genus

Stutzerimonas have been extensively studied due to their remarkable metabolic and physiological diversity.However,research on its phages is currently limited.In this study,we isolated a novel double-stranded DNA(dsDNA)phage,vB_SstM-PG1,from the marine environment that infects Stutzerimonas stutzeri G1.Its dsDNA genome is 37204 bp long with a G/C content of 64.14%and encodes 54 open reading frames.The phage possesses a tail packaging structure that is different from known Stutzerimonas stutzeri phages and exhibits structural protein characteristics similar to those of temperate phages.In addition,two genes of toxin-antitoxin system,including YdaS_antitoxin and HEPN_SAV_6107,were found in the vB_SstM-PG1 genome and play important roles in regulating host growth and metabolism.With phylogenetic tree and comparative genomic analysis,it has been determined that vB_SstM-PG1 is not closely related to any phages previously identified in the GenBank database.Instead,it has a connection with enigmatic,uncultured viruses.Specifically,the vB_SstM-PG1 virus exhibits an average nucleotide identity of over 70%with six uncultivated viruses identified in the IMG/VR v4 database.This significant finding has resulted in the identification of a novel viral genus known as Metabovirus.

噬菌体分类学技术进展

噬菌体是一类细菌病毒,能特异性识别并杀灭细菌,具有替代抗生素的潜力,特别是在食品安全领域中,以解决“人-环-食”生态链中泛耐药病原微生物的威胁。噬菌体分类学是阐明噬菌体间物种进化和发展规律的重要学科。近年来,随着新一代测序、培养组学等技术发展,噬菌体分类出现了许多新的技术进展与挑战。该文通过回顾噬菌体分类学的发展历程,阐明目前常用分类技术的优缺点;同时,该文系统总结了噬菌体进化分类的具体方案,重点探讨了分类学标尺及系统发育构建的前沿进展;最后,该文归纳了目前噬菌体分类技术的新进展,重点推荐了纯培养噬菌体分类的可靠流程,并讨论了培养组学、宏病毒组及原噬菌体分析手段对噬菌体分类学技术的挑战与要求。该文为噬菌体分类学技术的进一步发展提供参考。

抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体的筛选、表达和鉴定

目的筛选特异性抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列,表达纯化重组抗SARS-CoV-2纳米抗体,评估其特性及应用潜能。方法基于前期构建的天然噬菌体纳米抗体展示库,以生物素化SARS-CoV-2 S蛋白受体结合结构域抗原为靶点,利用生物素-链霉亲和素液相筛选法、噬菌体-ELISA和测序筛选抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列;构建重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体表达载体,IPTG诱导表达并纯化,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析其特征及应用潜能。结果成功获得2条抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列,并构建了相应原核表达菌;成功表达纯化重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体,其与SARS-CoV-2 S蛋白可特异性结合。结论筛选及表达的重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体为其应用于SARS-CoV-2检测和治疗及相关研究提供基础。

金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性及其在牛奶中的抑菌应用

分离纯化一株裂解性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体,鉴定其理化和生物学性质,并研究噬菌体在牛奶中的抑菌作用。本研究以金黄色葡萄球菌(ATCC6538)为宿主菌,采用点滴法和双层平板法,分离获得特异性针对金黄色葡萄球菌的具有较高裂解活性的噬菌体,命名为qdsa001。经过透射电镜观察表明,该噬菌体属于长尾噬菌体科(Siphoviridae),最佳感染复数为0.1。一步生长曲线结果显示噬菌体感染宿主菌的潜伏期约为10min,爆发期约90min,平均裂解量约为32.2。它对60℃以下的温度耐受力较强,最适pH值为5～9左右。同时,牛奶中抑菌应用实验表明,噬菌体qdsa001对牛奶中金黄色葡萄球菌的生长具有良好的抑制作用。

1株宽宿主谱大肠杆菌噬菌体的生物学特性观察

目的 观察 1株自污水中分离的宽宿主谱大肠杆菌噬菌体的生物学特性。方法 采用宿主范围测定、噬菌斑计数、负染色电镜观察、血清中和试验及血清交叉中和试验、一步生长实验等技术观察分离的噬菌体。结果 ①宽宿主谱大肠杆菌噬菌体可裂解五株大肠杆菌 ;②针对不同宿主菌其噬菌斑形态、大小、透明度、边缘界限、中心透明区及晕环均发生相应变化 ;③电镜超微结构显示此噬菌体为直径 2 0～ 40nm的微球形颗粒 ,棱角不明显 ,偶见短尾 ;④噬菌体的抗血清Κ值为 41 5 ,与f2 噬菌体血清学相关度为 0 .3 8;⑤潜伏期为 3 0～ 3 5min ,裂解量为 10 4。结论 分离所得的噬菌体是 1株大肠杆菌宽宿主谱噬菌体 ,为直径 2 0～ 40nm的圆形颗粒 ,其与f2 噬菌体的血清相关度较低 。

噬菌体在疾病治疗方面的应用及研究

噬菌体治疗是利用噬菌体溶解细胞的作用而用于治疗人和动物的病原细菌的临床感染。早在 2 0世纪初 ,噬菌体治疗就取得过积极的治疗效果。目前针对传统抗生素治疗动物细菌感染时易产生残留及细菌耐药性等缺点 ,噬菌体治疗更表现出许多突出的优越性。基于大量的动物模型试验及人类临床治疗的实践 ,人们开始针对治疗中存在的缺点和不足 ,从治疗性噬菌体的选择、宿主谱、作用效力及其作用的动力学原理等方面 ,采用分子生物学等技术对噬菌体进行探索性的改造 ,以期获得更有效的治疗效果 。

副溶血弧菌噬菌体裂解酶LysF23s2和LysH256D1的表达及活性分析

由于副溶血弧菌对食品安全构成了巨大的威胁,抗生素的滥用导致耐药问题日趋严重。噬菌体及其裂解酶能够迅速、高效杀灭细菌,不易导致细菌耐药性,成为可替代抗生素的新型抑菌剂。该文将两种副溶血弧菌噬菌体裂解酶通过BL21和T7表达体系在16℃、37℃下进行表达,成功表达并纯化裂解酶后,分析了裂解酶对副溶血弧菌的裂解能力、酶的热稳定性以及金属离子对其活性的影响。结果表明,LysF23s2和LysH256D1在BL21中低温诱导时,有更高浓度的表达。LysF23s2和LysH256D1在浓度为10μmol/L时对宿主细菌的裂解率分别达到了75.24%和71.00%。在90℃处理30 min后,LysF23s2和LysH256D1的裂解率降至10.00%和8.82%,仍保持了一定活性。Na^(2+)、Ca^(2+)和Zn^(2+)对LysF23s2和LysH256D1的活性有一定抑制作用。该研究通过大肠杆菌体系表达能够裂解副溶血弧菌的噬菌体裂解酶LysF23s2和LysH256D1,得到了两种具有较好的裂解活性和耐热性的裂解酶。

大肠杆菌噬菌体的分离、纯化及其特性研究

探讨了从生活污水中分离、纯化大肠杆菌噬菌体的方法．经富集，从厦门大学、厦门港的生活污水中获得3种噬菌体．一是：蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体，其头部为二十面体，直径约110—120nm，尾部长220—230nm，尾宽13—15nm，无尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构．二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体，其头部为三十面体，约70nm×110nm，尾部长约120—130nm，尾宽约18—22nm，有尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构，该类噬菌体在污水中占绝大多数．三是短尾噬菌体，其头部为二十面体，大小为20nm，尾部长约2—3nm，在污水中占有一定的比例．2种噬菌体在-18℃冰箱可存活56天．经噬菌体处理的污水，总菌数下降了30％左右，大肠杆菌总数下降90％以上．

嗜水气单胞菌江西地区分离株耐药性及耐药质粒分析

为了解江西地区水产动物中嗜水气单胞菌的耐药性,从江西部分地区分离到52株嗜水气单胞菌,对其进行耐药性试验及耐药质粒抽提,绘制江西地区嗜水气单胞菌的耐药谱及耐药质粒指纹图谱,并将其对比分析。结果52株嗜水气单胞菌对19种抗生素呈现出不同程度的耐药性,其中阿莫西林耐药率为94%,青霉素耐药率为96%,利福平耐药率为62%,林可霉素耐药率为63%,甲氧嘧啶耐药率为75%。质粒提取结果发现52株细菌中有14株菌携带耐药1条～9条不等的质粒电泳条带,菌株提取到质粒的概率为26.93%。耐药质粒指纹图谱显示其质粒谱型可分为14种,每株菌都含有大小和数量不等的质粒,分析表明嗜水气单胞菌耐药性与质粒无明显的直接关系,但来源相同,耐药类型相似,质粒图谱也相似。

一株鸡源致病性大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性

目前,在鸡业发展过程中,大肠杆菌病是一种较为常见高发病,常造成鸡局部或全身性感染[1-2].大肠杆菌病是一种条件致病菌,差的卫生条件、不良的卫生管理,很容易造成大肠杆菌病的发生.随着养鸡业规模化、集约化的不断发展,大肠杆菌病越发严重,病原对抗生素和抗菌药的耐药性越来越强.为了防治鸡大肠杆菌病,饲养主大多采用饲喂抗生素或抗菌药物的方法,但普遍存在耐药性和用药成本升高等问题.同时,由于长期使用抗生素或抗菌药,使产品存在药物残留,导致产品品质下降,很难满足人们对绿色健康养殖的要求.