超声诱发成核提高HepG2细胞冷冻消融致死率研究

冷冻消融技术对于治疗实体肿瘤具有一定的效果,但普遍存在降温效果有限、靶向杀伤效率不高等问题。为提高冷冻消融的疗效,提出了将超声诱发成核用于冷冻消融的一种新的辅助手段,研究了2种降温速率下不同诱发成核温度对细胞存活率的影响,观察并记录了超声诱发成核后的胞外冰晶形态、胞内冰晶生成情况及复温后的细胞损伤情况。结果表明:使用超声诱发成核辅助冷冻消融可以提高肿瘤细胞的致死率。慢速冷冻辅助成核组的效果最佳,消融更为彻底,HepG2细胞的存活率低至15.60%±2.60%。快速冷冻辅助成核时,需要配合较低的诱发成核温度才能更好地杀伤细胞。设计开发具有超声诱发成核功能的冷冻消融器械具有实际意义。

离子交联海藻酸盐水凝胶在细胞培养和冷冻保存中的研究

近年来,水凝胶在细胞和类器官培养和冷冻保存方面表现出显著优势,尤其在细胞冷冻保存方面。在该研究中,选用喷雾法,以三价铁和钙为交联剂,采用低成本且易获得的喷枪制备了海藻酸钙和海藻酸铁水凝胶,并用该方法包封了HEK293T细胞和HepG2细胞,研究了不同交联液对包封细胞时细胞存活率的影响,发现交联时间越长对细胞损伤越大,与海藻酸钠溶液交联后发现凝胶后降低了细胞在交联液中的损伤。还制备了不同质量分数海藻酸钠溶液(1%、1.5%、3%)与CaCl_(2)(0.2 mol/L)交联的水凝胶,包封HEK293T细胞并培养7 d,发现细胞均可以很好地在水凝胶中培养。最后,研究了包封后细胞冷冻保存的存活率,结果表明:HEK293T细胞和HepG2细胞在两种体积分数的二甲基亚砜(DMSO)为保护剂的前提下存活率均显著高于未包封组,包封前HEK293T细胞的存活率为33.16%±2.70%(10%DMSO)和16.75%±2.3%(5%DMSO),而包封后的细胞存活率增至76.51%±5.32%(10%DMSO)和60.86%±2.41%(5%DMSO)。对于HepG2细胞,细胞存活率则从包封前的48.93%±3.06%(10%DMSO)和36.22%±2.54%(5%DMSO)增至包封后的78.79%±4.43%(10%DMSO)和64.64%±3.13%(5%DMSO)。在乙二醇(1 mol/L)+丙二醇(1.5 mol/L)+海藻糖(1 mol/L)作为保护剂的前提下,玻璃化保存的HEK293T细胞的存活率由包封前的33.5%±0.8%增至79%±3.76%。数据表明,冷冻保存后包封细胞的存活率明显高于未包封细胞,离子交联海藻酸盐水凝胶可以在细胞冷冻保存中保护细胞。

富血小板血浆-80℃深低温短期保存后细胞因子的变化

目的分析富血小板血浆(PRP)-80℃深低温短期保存以后,其内P-选择素、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)浓度及其pH值等重要指标的变化,为PRP低温储存提供理论依据。方法取30例健康供者血液制备的PRP,每份样本分装成5份,每份留取0.5 mL,分别为A组(新鲜组)和B~E组(分别冻存5、10、15、20 d)。测定各组PRP的pH值;ELISA法测定各组PRP中P-选择素、PDGF和VEGF的水平;血管形成实验检测A组和E组对HUVEC细胞血管形成能力的影响。结果各组pH值比较差异无显著性(P>0.05);各组PRP中P-选择素、PDGF、VEGF的浓度比较,差异均无显著性(P>0.05);A组和E组中HUVEC血管形成数量比较差异无显著意义(P>0.05)。结论-80℃深低温保存PRP对其pH值、P-选择素、VEGF和PDGF浓度变化无显著影响,可延长PRP临床应用时间。

低温保存红细胞力学性能评估的介电泳方法研究

目的低温保存作为人体红细胞长期储存的技术方案,在临床医学和基础研究中具有巨大的应用潜力。但低温保存过程中的每一步,细胞都不可避免地遭受低温损伤。因此需评估回收的细胞是否保持正常的生理功能和完整的结构。但目前大多数指标是通过细胞群平均值而不是单个细胞来量化。本研究从单细胞角度,用红细胞的力学性能评估低温保存后细胞状态。方法采用微流控、无标记、同步和无损的介电泳方法研究了多种保护剂低温保存人体红细胞对黏弹性的影响。由高速相机获取细胞图像,通过形态学图像分割技术快速提取细胞形变信息。结果用二甲基亚砜低温保存的红细胞的黏弹性优于甘油,采用蔗糖保存优于海藻糖。并且发现红细胞冻融存活率与细胞黏弹性的优劣不具备相关性。结论黏弹性作为评估回收细胞质量的独立指标,无法替代或省略。本研究有助于加深对低温损伤机制的理解。单细胞黏弹性的评估在优化低温保存过程和筛选最佳保护剂等方面展现巨大的应用潜力。同时,鉴于红细胞膜的简单性和特异性,本文研究也可以为其他细胞类型的研究提供新的思路。

不同冷冻技术对同种异体血管移植排斥反应的影响

背景:冻存能够较好地保证血管结构的完整性,如何改善移植后排斥反应的问题受到越来越多的关注。目的:综述不同冷冻技术降低同种异体血管移植排斥反应的研究进展,以期为临床研究提供参考。方法:系统检索中英文数据库CNKI、万方和PubMed以及在线网站Baidu和Google Scholar自建库以来发表的降低同种异体血管移植排斥反应的相关文献。中文检索关键词:心血管疾病、内皮细胞、低温冻存、血管移植、免疫原性、排斥反应,同种异体移植和冷冻保护剂;英文检索关键词:cardiovascular disease、endothelial cells、cryopreservation、blood vessel transplantation or vascular graft、Immunogenicity、immune rejection、allograft or allogeneic transplantation or allograft transplantation and cryoprotectant。按照纳入排除标准共选取68篇文献进行综述。结果与结论:①综述发现通过改进现有冷冻技术能够降低同种异体血管移植排斥反应,其中主要涉及冻融方式和冻存保护剂的选择。②现有研究提示冻干法优于低温冻存,但限于条件未能广泛开展,现仍以低温冻存为主,其中玻璃化冻存、缓慢复温和使用不锈钢乃至含银材料效果优于程序式冻存及快速复温。③渗透性和非渗透性冻存保护剂的联合选择,可以在降低其毒性的同时,进一步减少排斥反应的发生。

预冷OCT胶缩短术中组织快速冷冻时长的应用体会

准确、及时的术中快速冷冻病理诊断,对手术患者的良恶性判断和手术范围的决定具有重要意义[1]。术中快速冷冻病理诊断通常要求标本送检30 min内完成,缩短冷冻制片时间对提高术中快速冷冻病理诊断至关重要。本科室在实践中通过预冷OCT胶,有效缩短了术中送检组织标本的冷冻时间,现介绍如下。1 材料与方法1.1 材料与仪器收集2023年3~4月我院手术的60例新鲜组织标本,其中肺、甲状腺、乳腺组织各20例。

Endocare型氩氦冷刀冻结与复温性能的实验研究

目的对Endocare型氩氦冷刀的实际工作性能进行测试 ,考察其优缺点 ,为肿瘤冷冻治疗提供参考。方法将氩氦刀置于空气、水及兔子组织中进行冷冻并复温 ,监测刀杆外壁和内部测温点的温度变化 ;基于实验结果评价氩氦刀的工作性能以及工质气体的消耗情况 ;结果氩氦刀冷冻时 ,刀头在很短的时间内降至极低温度 ,并保持稳定。冰球在冷冻初期增长很快 ,此后其增长速率明显下降。当工质由氩切换为氦后 ,刀头温度迅速上升 ,冰球随即熔化 ;工质气体的消耗速率随着实验进行不断降低。结论证实氩氦刀确有良好的快速冷冻和复温性能 。

低温保存血小板临床应用效应研究

对 15 6 0例输注低温保存血小板的临床患者进行了研究。其中急性白血病 5 36例 ;再生障碍性贫血2 85例 ;化疗和放疗及其他原因所致的血小板减少 2 5 3例 ;围手术期患者 438例 ;DIC、肝硬化食管静脉曲张破裂出血 48例。输注的低温保存血小板保存时间为 1周～ 8个月居多 ,保存时间最长 13个月。输注的血小板基本上未经洗涤。结果显示 ,输注低温保存的血小板具有升高血小板作用和显著的止血效果 ,且无明显副作用。低温保存血小板在临床应用中 ,从数量保证、供给形式和及时有效等方面都是其他方法获得的血小板所不能比拟的。

二氮嗪在长时程心脏低温保存中的作用

延长心脏的体外有效保存时间对临床心脏移植具有重要意义。本文旨在研究线粒体ATP 敏感性钾通道开放剂二氮嗪(diazoxide, DE)在离体大鼠心脏长时程低温保存中的作用。SD 大鼠随机分成 5 组,包括对照组(单纯 Celsior 保存液), DE 组(Celsior 液中含 15、30 或 45 μmol/L 的 DE)和 DE+5-HD 组 [Celsior 液中含 30 μmol/L 的 DE 和 100 μmol/L 的 5- 羟基葵酸盐(5-hydroxydecanoate, 5-HD)]。利用 Langendorff 离体鼠心灌注法, 观察心脏在 4℃条件下保存 10 h 后, 复灌期血流动力学恢复、冠脉流出液中心肌酶漏出量及心肌水含量变化, 并做心肌超微结构检查。结果显示:与对照组比较,DE 处理后,复灌期的左心室舒张末期压力明显降低,心率、左心室发展压、左心室压力变化率、冠脉流出量等的恢复率在多个复灌时间点上优于对照组,且能显著减少复灌过程中心肌酶(乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶及谷草转氨酶)的漏出量,降低心肌水含量;其中30 和45 μmol/L DE 组的保护作用优于15 μmol/L DE 组;电镜结果显示DE 对长时程低温保存心脏的超微结构有较好的保护作用。DE 的上述作用可被线粒体ATP 敏感性钾通道的特异性阻断剂 5-HD 所取消。以上结果提示:DE 可通过激活线粒体 ATP 敏感性钾通道显著改善离体大鼠心脏长时程低?

皮肤低温保存的方法和工艺研究

本文研究了抗冻剂的种类、浓度、预处理的方法、预处理的时间等因素对皮肤低温保存效果的影响;研究了可控制皮肤最佳降温速率的几种实用的简便方法;提供了能在低温条件下安全使用的盛皮肤塑料袋的材料和制作工艺。为建立皮肤的低温保存库,本文完成了较完整的方法和工艺研究。

保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥保存后回收率的影响

为了研究保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥 (简称冻干 )保存后回收率的影响 ,采用含有 7%二甲亚砜 (v/v)和 2 0 %、30 %、4 0 %或 5 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) (w/v)的缓冲液作为保护液进行保护液的玻璃化测试和红细胞的冻干保存实验。首先检测溶液的玻璃化状态 ,如果冷冻和解冻过程中任一过程出现白色冰晶即为非玻璃化溶液 ;再将浓集红细胞和不同的保护液按比例混匀 ,预冻后移入冻干机内进行冻干处理 ;冻干完毕后 ,快速水化样品 ,测定红细胞回收率、血红蛋白回收率和上清游离血红蛋白浓度 ,然后对冻干后红细胞形态进行电镜观察。结果表明 :2 0 %PVP +7%DMSO和 30 %PVP +7%DMSO在冷冻和解冻过程中都出现白色冰晶 ;4 0 %PVP +7%DMSO在冷冻过程中无冰晶出现 ,但在解冻过程中出现冰晶 ;而 5 0 %PVP +7%DMSO在冷冻和解冻过程中均无冰晶出现。冻干红细胞再水化后 ,4 0 %PVP +7%DMSO的细胞回收率和血红蛋白回收率分别为 (81.36±14 94 ) %和 (77.5 4± 12 .86 ) % ,显著高于其它 3组 (P <0 .0 1) ;另外 4 0 %PVP +7%DMSO的上清游离血红蛋白浓度也显著低于其它 3组 (P <0 .0 1)。研究表明 :随着溶液中PVP浓度的升高 ,溶液的玻璃化程度也随之增加 ,同时冻干 再水化后红细胞的各项指标也随之改善 。

机采血小板P-选择素在常规和冰冻保存条件下的表达研究

目的 探讨常规和冰冻保存条件下对血小板功能的影响。方法 10单位机采血小板分别用常规保存袋和低温保存袋贮存 ,前者贮存 5d ,每天留取标本 ,后者于 -85℃贮存后 5d复苏留样。分别检测血小板聚集率、血小板计数、pH值和血小板膜糖蛋白P 选择素的变化。结果 常规保存条件下 ,5d内血小板聚集率、pH、血小板计数均无显著性变化 ,血小板P 选择素在 1d后即明显升高 (从 3 .77± 1.86到 10 .87± 4.75 ,达 3倍 ,P <0 .0 1)。冰冻保存时 ,血小板聚集率、pH、血小板计数无显著性变化 ,P 选择素的表达在冰冻后呈显著升高 (从 4.3 7± 1.82到 16.88± 7.2 3 ,达 4倍 ,P <0 .0 1)。结论 血小板P 选择素在常规和冰冻保存条件下的表达变化提示血小板离体后被活化 。

深低温保存新鲜富含血小板血浆质量分析

为了评价批量制备的深低温保存富含血小板血浆 (cryo FPRP)的效率和效果 ,在优化建立的无偿献血者血小板的批量分离和制备cryo FPRP过程中测定了ACD抗凝的 2 0 0ml全血、FPRP、含 5 %DMSO的FPRP(DM SO PRP)和 - 80℃冰箱然冰冻保存后复温的FPRP(Cryo FPRP)的血小板计数 (Plt)、血小板平均体积 (MPV)、血小板分布宽度 (PDW )、血浆内 pH、血浆乳酸 (LA)浓度和乳酸脱氢酶 (LDH)浓度、细菌培养、血小板CD62p阳性率、PAC 1阳性率及抗GPIb Ⅸ Ⅴ荧光强度 ,也测定了FPRP和cryo FPRP的促凝血活性。结果表明 :①血小板的总平均得率为 70 % ;FPRP中残余的红细胞≤ 1× 10 9/袋 ;白细胞≤ 1× 10 7/袋。②血浆pH、LA浓度和PAC 1阳性率在整个制备和保存过程中没有明显变化。③血浆内LDH、血小板CD62 p阳性率和血小板抗GPIb Ⅸ Ⅴ荧光强度在血小板冰冻保存后出现明显升高。④与FPRP比较 ,cryo FPRP诱导的血浆凝固时间明显缩短。结论 :①本研究选择的离心分离制备FPRP条件可高效分离无偿献血者的血小板 ,同时不会导致血小板激活率增加。②深低温保存无偿献血者的新鲜富含血小板血浆可有效防止代谢产物的积累和pH下降 ,并且可以高效预防血小板GPⅡb/Ⅲa的激活。③冰冻保存后部分血小板胞膜受到明显损害。④血小板胞?

自制长征-1号多器官保存液的动物实验和部分临床应用研究

目的：研制我国自制的多器官保存液，以满足日益发展的国内器官移植手术的需要。方法：在全面分析国外最先进的多器官保存液ＵＷ液配方的基础上，研制成长征－１号多器官保存液（ＣＺ－１液）。改进有：（１）用低分子右旋糖酐－４０替代羟乙基淀粉；（２）用蔗糖替代木棉糖；（３）去掉ＵＷ液中添加成分；（４）添加钙离子拮抗剂维拉帕米；（５）使ｐＨ值进一步偏碱性。将ＣＺ－１液用于动物器官（肾、肝、心、肺、胰腺、小肠等）的低温延时保存实验，包括低温延时保存后形态学、生物化学的改变和移植存活率观察，以及部分临床应用研究。结果和结论：ＣＺ－１液对肾、肝、心、胰、小肠等的低温保存效果基本类同于ＵＷ液，部分结果优于ＵＷ液；对肺保存的效果优于Ｅｕｒ－Ｃｏｌｉｎｓ液。临床尸肾经ＣＺ－１液低温保存２４～３１ｈ移植后获得成功。结果证实，ＣＺ－１液不仅增强了保存效果，且大大地降低了成本，国内可自行配制。

低温环境对家兔血清蛋白、血糖和钙含量的影响

目的研究低温环境对家兔血清蛋白、血糖和钙含量的影响。方法将家兔分为3个实验组 ,分别置于2、-4、-6℃的环境 ,对照组置于室温16℃ ,均放置30～60min后 ,取外周血检测血糖、血清蛋白和钙 ,并测肛温和心电图(ECG)。结果随环境温度下降 ,实验组血清蛋白、血糖和钙降低 ,与对照组相比差异显著 (P<0.05) ,同时肛温逐渐降低 ,ECG显示心肌缺血和心律失常。结论低温环境可致家兔血清蛋白。

大规模猪肝细胞低温保存方法的建立

目的 建立大规模猪肝细胞的低温保存方法以满足生物型人工肝治疗的需要。方法 用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞 ;加入本实验室配制的含有 10 %二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)的营养液中 ;分别采用两种降温方法使 (12 )× 10 10 猪肝细胞保存在 - 196℃液氮中 ;1个月后复温 ,观察在同一条件下培养不同时间后猪肝细胞形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能。结果 用两种降温方法保存的肝细胞 ,复温后细胞的存活率均较高 (梯度降温组和程控降温组存活率分别较冻存前降低了 4 7%和 8 6 %) ,其中前者肝细胞的尿素、葡萄糖合成功能较后者高。结论 所建立的冻存方法简单易行 ,可保存大量的猪肝细胞。

冷冻保护剂导入细胞过程的模拟和优化

在细胞的低温保存中，通常需要导入冷冻保护剂来减轻冷冻过程对细胞的损伤。利用Kedem-Katchalsky模型模拟冷冻保护剂导入过程中细胞体积的变化以及胞内保护剂浓度的变化，考察导入过程对细胞的体积损伤和渗透损伤，以达到优化保护剂的导入过程的目的。结果表明：低浓度（1～2mol／L）保护剂一步导入过程的体积损伤和渗透损伤很小。因此在导入保护剂时可采用一步法；对于高浓度（6～9mol／L）的保护剂，相对于一步导入，分步导入和连续导入能显著减轻保护剂导入过程对细胞造成的体积损伤和渗透损伤。另外，分步导入以四步较好，连续导入可采用线性梯度和S型曲线梯度导入方式。

脑部亚低温对复苏后脑的保护作用

目的：观察犬电击致室颤心脏停跳（ＶＦＣＡ）８分钟复苏后脑亚低温（３３℃）对脑脊液（ＣＳＦ）、脑组织中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力、丙二醛（ＭＤＡ）含量和脑皮质神经元超微结构的影响。方法：对犬行ＶＦＣＡ８分钟，开胸心肺复苏后观察４小时。１０只犬分为２组：正常脑温心肺复苏组（ＮＴ组，ｎ＝４）维持硬脑膜外温度３６～３７℃；选择性脑亚低温心肺复苏组（ＳＢＣ组，ｎ＝６）采用右侧颈总动脉灌注自体血冷却辅以头部表面降温维持硬脑膜外温度３３℃左右。结果：ＮＴ组复跳后各时点ＣＳＦ中ＳＯＤ活性较ＣＡ前均明显降低（Ｐ均＜０．０５），ＭＤＡ含量则均明显升高（Ｐ均＜０．０５），神经元核膜、线粒体、内质网等结构严重受损；ＳＢＣ组与ＮＴ组相比则复跳后各时点ＣＳＦ和脑组织中ＳＯＤ活性均明显升高（Ｐ均＜０．０５），ＭＤＡ含量均明显降低（Ｐ均＜０．０５），神经元超微结构损害明显减轻。结论：脑亚低温（３３℃左右）可能通过抑制脑内脂质过氧化反应和内源性氧自由基清除剂的消耗，对脑复苏起到有利的保护作用。

犬脑选择性深低温对全身重要器官生理功能的影响

目的 :探讨脑选择性降温技术的安全性。 方法 :通过单侧颈总动脉低温灌注法 ,对 10只犬进行了选择性脑部降温。观察了降温过程中生命体征的变化 ,术前及术后血常规、电解质、肝肾功能以及心脏、肝脏酶谱的变化。 结果 :10只犬均实现了选择性脑部降温。脑温最低达 (17.8± 1.8)℃ ,直肠温保持在 (32 .5± 2 .0 )℃以上。4只犬于术后 1～ 3d死亡 ,6只长期存活。降温过程中犬的生命体征有明显改变 ,随温度回升而恢复正常。术后血常规、电解质、肝肾功能、酶谱与术前无显著差异。 结论 :采用动脉内低温灌注 ,可选择性快速降低脑温。降温使脑干心血管中枢功能抑制 ,但经开放椎动脉后可迅速纠正。该技术对全身重要器官生理功能无明显损害。

依达拉奉对断肢再植后缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌线粒体的保护作用及机制

目的探讨依达拉奉对断肢再植后缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌线粒体的保护作用及其机制。方法36只成年W istar大鼠,随机分为对照组、冷冻组和药物组。对照组只暴露股动、静脉,不离断肢体;余两组制作深低温保存断肢再植缺血再灌注损伤动物模型,药物组洗脱液中含依达拉奉0.5 m g/kg。选取相同时点骨骼肌标本,提取骨骼肌线粒体,测定线粒体丙二醛(M DA)、超氧化物歧化酶(SOD)、线粒体呼吸控制率及抗氰呼吸,并对骨骼肌线粒体超微结构行透射电镜观察。结果与对照组相比,冷冻组与药物组线粒体中的M DA显著增高,抗氰呼吸显著增加,SOD显著降低,呼吸控制率显著下降。与冷冻组比较,药物组的M DA水平及抗氰呼吸显著降低,SOD显著增高,呼吸控制率显著升高(P均<0.05);病理改变在冷冻组最为严重,药物组再灌注骨骼肌大部分线粒体完整。结论依达拉奉能减轻深低温保存大鼠断肢再植骨骼肌线粒体的缺血再灌注损伤。其可能与依达拉奉直接抑制羟自由基,提高骨骼肌线粒体内SOD活性,减少M DA的产生,使细胞进行正常的氧化磷酸化有关。