献血者HBVs基因变异的生物信息学分析

目的分析HBV DNA+/HBsAg-献血者的传染性指标、S区基因序列突变情况及生物信息学特征变化。方法通过PCR方法筛查出1份HBV DNA+/HBsAg-的标本,应用酶联免疫和化学发光方法检测该标本乙肝病毒5项指标,对该标本HBVs区基因片段测序并分析变异情况,应用分析软件对所测序列进行生物信息学分析。结果该标本HBV DNA+、HBsAg-、HBsAb+、HBeAg+、HBeAb-、HBcAb+;HBVs区基因序列内发生氨基酸单位点突变(P151L),空间结构发生改变。结论HBVs区基因序列空间结构改变,可能是导致检测结果出现血清学HBsAg-/HBsAb+/HBV DNA+的原因。

乙型肝炎病毒检测方法的现状研究

HBV感染是我国最主要的传染性疾病之一,目前临床主要使用体外诊断试剂对该病毒进行准确快速的检测,体外诊断试剂盒的方法学主要包括:免疫学方法和分子生物学方法。本文通过PubMed(检索时限自2017年1月至2023年12月)和万方数据库(检索时限自2017年1月至2023年12月)检索乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的检测方法、相关试剂盒的生产和临床应用的相关文献,详细列举最新检测方法的进展并比较不同方法学的优缺点,全面分析和讨论了我国目前乙型肝炎病毒检测的现状和研究进展。研究发现,我国HBV检测用商品化试剂盒的方法学分布存在集中现象,试剂盒的生产存在“东部多,西部少,大分散,小聚集”的特点。

计划免疫后出生献血者乙肝无症状慢性感染血清学与分子生物学特征分析

目的了解深圳地区计划免疫后出生献血者乙肝病毒无症状慢性感染情况,分析其血清学和分子生物学特征。方法将1992年之后出生的无偿献血者的HBsAg ELISA阳性血液标本进行乙肝两对半检测和核酸大容量提取,对其BCP/PC区及S区进行巢式PCR扩增及qPCR定量检测,并对产物进行基因测序及序列分析。结果2020年12月—2022年1月共收集46632份计划免疫后出生无偿献血者标本,其中含男性31612份,女性15020份。通过常规筛查得到ELISA阳性标本99份,经化学发光、巢式PCR、实时荧光PCR等方法检测,61份确证HBsAg阳性,阳性率0.13%(61/46632)。其中男性49份,阳性率0.16%,女性12份,阳性率0.08%(P<0.05)。50/61份标本获得S序列,经系统进化树分析,其中B型46份[92%(46/50),男性38份,女性8份],C型4份[8%(4/50),男性3份,女性1份]。S区突变频率高的分别N40S(8/46,17.39%),G44E(7/46,15.22%),Q129H/R(6/46,13.04%),Y161F/S(7/46,15.22%),V179A(4/46,8.70%),S53L(2/4,50%),C69T(2/4,50%),I126S/T(2/4,50%)。其中免疫逃逸突变有Q129R和T/I126A/N/S/T。结论乙肝疫苗接种能大大降低献血者的乙肝表面抗原阳性率,提高输血安全性。高频率的免疫逃逸突变也成为血液安全潜在风险,需要进一步探讨研究。

武汉城市圈献血人群戊型肝炎病毒流行情况调查

目的了解武汉城市圈无偿献血人群戊型肝炎病毒(HEV)流行情况,为献血人群HEV筛查策略的制定提供数据支撑。方法随机收集2021年1—12月武汉城市圈内实施集中化检测的4个地区(鄂州、天门、仙桃、潜江)的献血者血液标本3329份,其中ALT正常的无偿献血者合格血样2737份(ALT正常组),ALT升高的血样592份(ALT升高组)。采用ELISA检测抗-HEV IgG、抗-HEV IgM和HEV Ag;采用Real-time PCR对ALT升高的血样和抗-HEV IgM阳性的ALT正常血样进行HEV RNA单人份检测。采用χ^(2)检验或Fisher精确检验来评估不同地区、不同ALT水平组抗-HEV IgG和抗-HEV IgM阳性率的差异。结果4个地区3329份血液标本的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM和HEV Ag总阳性率分别为21.63%(720/3329)、1.29%(43/3329)和0%。不同地区献血者抗-HEV IgG阳性率有差异(P<0.05)。抗-HEV IgG阳性率最高的是天门29.44%(136/462),其次分别是潜江22.69%(236/1040)、仙桃22.66%(230/1015)、鄂州14.53%(118/812)。ALT升高组献血者抗-HEV IgG阳性率和抗-HEV IgM阳性率显著高于ALT正常组献血者(25.68%vs 20.75%,2.53%vs 1.02%,均为P<0.05)。ALT水平升高组的所有血样和抗-HEV IgM阳性的合格血样均未检测到HEV RNA。结论HEV在武汉城市圈献血人群中存在流行,但现症感染率极低,且不同地区抗-HEV抗体血清流行率存在差异。ALT升高献血者抗-HEV抗体流行率显著高于ALT正常献血者。

渝东北片区聚集性诺如病毒感染毒株的遗传多样性

目的分析2021-2022年渝东北片区聚集性诺如病毒感染毒株遗传多样性,促进重点人群和场所诺如病毒感染防控。方法采集聚集性诺如病毒感染事件中患者肛拭子及环境拭子,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测诺如病毒核酸,逆转录PCR扩增病毒RNA聚合酶/衣壳蛋白片段并测序分析,诺如病毒分型工具网站(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)确定基因型,运用MEGA-X软件按最大似然法构建种系发生树。结果共调查渝东北片区4个区县11起聚集性诺如病毒感染事件,qRT-PCR检测55份样品,均为GII基因群诺如病毒,经测序存在6种基因型。GII.17[P17]基因型导致4起疫情,GII.17[P17]和GII.1[P16]基因型混合感染导致1起疫情,GII.6[P7]及GII.8[P8]基因型各引起2起疫情,GII.2[P16]及GII.3[P12]基因型分别导致1起疫情。种系发生分析显示55株GII基因群毒株分布在5个基因簇。不同事件相同基因型的诺如病毒都位于同一个基因簇。不同事件不同基因型的诺如病毒各自聚集成簇,分属于不同的基因簇。结论2021-2022年渝东北片区11起聚集性诺如病毒感染毒株涉及多种基因型,GII.17[17]是引起聚集性感染事件的常见基因型,绝大多数事件由单一传染源引起,不同事件相同基因型的诺如病毒存在遗传相关性。

一种可用于OBI检测的高灵敏度核酸提取方法的建立与验证

目的 建立和验证1种可用于隐匿性HBV感染(OBI)检测的大体积高灵敏度核酸提取方法,并将其应用于低病毒载量OBI标本的定量检测。方法 参考罗氏核酸检测试剂盒核酸提取方法,建立1种大体积核酸提取方法。将HBV标准品分别配置成10 000 IU/mL、1 000 IU/mL、100 IU/mL、10 IU/mL和1 IU/mL浓度,采用磁珠法从10 mL相应浓度的标准品中提取核酸,采用荧光定量PCR法检测各浓度的CT值,每个浓度梯度进行平行双份检测,以病毒浓度的对数为X轴,2次检测CT值的平均值为Y轴,构建荧光定量标准曲线和回归方程。通过3次重复实验验证该方法的稳定性。应用本方法提取低病毒载量OBI标本核酸并进行荧光定量。结果 3次HBV病毒荧光定量标准曲线扩增效率(E)均在90%~105%,回归方程(R2)均>0.99。不同浓度标准品CT值的变异系数(CV)分别为0.63%、0.78%、1.52%、1.36%和0.78%。本方法可以提取出病毒载量低至1 IU/mL的OBI标本核酸并进行定量。结论 本方法HBV核酸定量检测系统检测下限可达1 IU/mL,并且具有较强稳定性和灵敏度,可用于低病毒载量OBI的定量检测。

G6P[1]型牛轮状病毒的分离培养及鉴定

目的从轮状病毒阳性的牛粪便标本中,分离出一株G6P[1]型牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV),对其进行培养和鉴定。方法用PBS溶液重悬粪便标本并离心,将其上清过滤除菌和胰酶处理后,利用MA104细胞进行分离培养;通过逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)对样本VP4和VP7基因进行扩增和测序,与GenBank上的参考序列进行同源性分析,构建进化树,分析确定其G/P基因分型。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Polyacrylamine Gel Electrophoresis,PAGE)、噬斑实验和电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)等技术对分离到的病毒进行鉴定和纯化。绘制病毒生长动力学曲线。结果分离培养了1株BRV毒株,将其命名BLL。VP7和VP4基因测序结果显示此毒株为G6P[1]型轮状病毒。PAGE胶结果显示分离株电泳型为长型,条带呈现A组轮状病毒排列电泳图谱;通过噬斑实验将毒株进行了纯化。电镜检测到典型的轮状病毒颗粒。病毒生长动力学曲线可发现病毒在感染后6 h已经开始复制。结论本研究成功分离到G6P[1]型牛型轮状病毒,为研究G6P[1]型轮状病毒的病原学特征提供实验基础和技术参考。

利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒

目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救NSP1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/NSP1-EGFP,证明NSP1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。结论基于NSP1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。

2021-2022年广东省5岁以下婴幼儿腹泻病例中A组轮状病毒分子流行病学分析

目的了解2021-2022年广东省病毒性腹泻监测哨点医院5岁以下腹泻患儿A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)的流行病学和基因型别特征,为RVA疫苗研发提供依据。方法收集2021-2022年5岁以下儿童腹泻患者的粪便标本共1858份,采用ELISA方法检测轮状病毒抗原,对阳性样本进一步测序分型。结果1858份样本中检出RVA阳性样本156例,阳性率8.4%;其中男女患儿的阳性率分别为8.76%、7.87%,男女性别阳性检出率差异无统计学意义;RVA感染在各年龄组检出率差异有统计学意义;RVA感染率从12月逐渐增高,次年1-4月达到高峰;2021年广东地区RVA主要流行株以G9P[8]亚型为主,国内少见的G8P[8]亚型呈上升趋势,2022年G8P[8]亚型检出率首次超越G9P[8]亚型。结论2021-2022年广东省5岁以下婴幼儿腹泻病例中RVA基因型别多样,G8P[8]亚型已成为主要流行基因型之一,仍需持续开展RVA基因型别监测以评估RVA相关疾病的风险。

乙型肝炎病毒通过自分泌运动因子/溶血磷脂酸信号损伤对糖稳态的作用及其机制研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)通过自分泌运动因子(ATX)/溶血磷脂酸(LPA)信号对糖稳态的损伤作用及相关机制。方法利用基因芯片数据库分析HBV对ATX表达的影响。Western blotting检测HBV细胞株HepG2215、稳定表达HBV反式调节蛋白HBx和PreS2的HBx-HepG2和PreS2-HepG2细胞、对照组HepG2细胞的ATX蛋白表达水平。双萤光素酶报告基因检测HBx和PreS2对ATX启动子作用。构建稳定表达HBx和Pre-S2的小鼠分泌胰岛素细胞HBx-NIT、PreS2-NIT,检测两者对胰岛素分泌的影响。利用rAAV8-1.3HBV经尾静脉注射C57BL/6小鼠复制HBV小鼠模型,NC为注射同体积生理盐水的C57BL/6小鼠。小鼠按2 g/kg腹腔注射葡萄糖进行糖耐量试验(GTT)。采用液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附试验和血糖分析仪分别检测小鼠血清LPA、血清胰岛素和血糖浓度。结果HepG2215细胞ATX蛋白相对表达量高于HepG2(P<0.05)。PreS2与ATX启动子共转染组萤光素酶活性高于ATX启动子转染组(P<0.05),HBX与ATX启动子共转染组的萤光素酶活性高于ATX启动子转染组(P<0.05)。HBx-HepG2细胞ATX蛋白相对表达量高于HepG2细胞(P<0.05),PreS2-HepG2细胞高于HepG2细胞(P<0.05)。添加不同浓度LPA后NIT细胞胰岛素分泌表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。1~3μmol/L LPA相对表达量与胰岛素分泌呈负相关(r=-0.990,P<0.05)。HBx-NIT细胞添加Ki16425前的胰岛素水平低于NIT细胞(P<0.05),PreS2-NIT细胞低于NIT细胞(P<0.05)。NIT、HBx-NIT和PreS2-NIT细胞添加Ki16425后的胰岛素水平较添加前高(P<0.05)。实验组血清LPA相对表达量、平均空腹血糖浓度、注射葡萄糖后的60、120 min平均血糖浓度和血糖浓度曲线下面积(AUC)平均值较对照组高(P<0.05)。实验组注射葡萄糖后15 min血清胰岛素浓度、血清胰岛素水平的AUC值较对照组低(P<0.05)。用HBV小鼠GTT血糖AUC绘制的ROC曲线显示,曲线面积为0.770(95%CI:0.556,0.984),特异性为60.00%(95%CI:0.122,0.738),敏感性为90.00%(95%CI:0.555,0.998)。用HBV小鼠空腹血糖浓度绘制的ROC曲线显示,曲线面积为0.865(95%CI:0.703,1.027),特异性为80.00%(95%CI:0.444,0.975),敏感性为60.00%(95%CI:0.262,0.878)。实验组胰岛β细胞功能指数、胰岛素敏感指数均小于对照组,胰岛素抵抗指数大于对照组(P<0.05)。结论HBV反式调节蛋白HBx和Pre-S2上调ATX的表达,增强ATX/LPA信号,导致胰岛素分泌抑制,糖耐量异常,糖稳态受损。

2021—2023年安徽省手足口病柯萨奇病毒A组16型分子分型研究

目的了解安徽省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)发病情况、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)基因型别分布情况和VP1基因进化特征。方法通过中国疾病预防控制信息系统对2021—2023年安徽省HFMD发病情况和病原学检测情况进行统计。收集HFMD患者咽拭子样本,分离得到CVA16毒株,对其VP1区进行PCR扩增和基因序列测定,使用肠道病毒在线分型工具鉴定基因亚型,运用MegAlign比较核苷酸和氨基酸同源性,利用MEGA 6.0构建进化树,并分析VP1区氨基酸变异位点。结果2021—2023年安徽省累计报告HFMD病例155640例,年均报告发病率为84.83/10万。2021—2023年安徽省16个地市共报告HFMD实验室确诊病例12643例,其中CV-A16占18.16%(2296/12643),各年度构成比分别为25.81%(1127/4366)、33.69%(782/2321)和6.50%(387/5956)。2021—2023年安徽省共分离到HFMD CV-A16毒株72株,其中B1a和B1b基因亚型分别为58株(占80.56%)、14株(占19.44%)。两种亚型毒株与CV-A16原型株G-10的核苷酸和氨基酸同源性分别为73.80%~76.20%和90.60%~92.30%。进化树显示B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇,B1b基因亚型流行株形成3个分支簇。72条VP1区基因序列与原型株比较发现了26个氨基酸位点发生变异。结论2021—2023年安徽省HFMD CV-A16主要流行的基因亚型为B1a和B1b,B1a为优势基因亚型,应加强对CV-A16流行毒株的分子监测。

重点海水浴场主要肠道病毒的调查

海水浴场作为重要的娱乐场所,其水质卫生状况对保障公众健康极其重要。对全国重点海水浴场中轮状病毒、星状病毒和脊髓灰质炎病毒进行了调查,因为这3种病毒是引发腹泻性胃肠炎的重要病原。2007年8月选定全国10个重点海水浴场,于游泳区设定2个站位,无菌采集表层海水,用Millipore的病毒浓缩包进行海水中病毒的浓缩,用RT-PCR进行三种病毒的监测。调查结果显示:轮状病毒阳性检出率达40%(8/20)、星状病毒的为35%(7/20)、脊髓灰质炎病毒的为35%(7/20);在这十大重点海水浴场中,除北海一处无病毒检出外,其余均有不同程度的病毒阳性检出,表明我国的重点海水浴场水质已经遭受肠道病毒不同程度的污染。建议相关部门应该加强海水浴场的卫生管理,避免公众因在海水浴场娱乐导致疾病。

我国预防儿童肠道病毒感染疫苗的临床研究进展

肠道病毒是单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科肠道病毒属,感染人的肠道病毒主要包括脊髓灰质炎病毒(polioviruse,PV)、柯萨奇病毒(coxsackievirus,CV)、肠道病毒68-71型(enterovirus,EV)、甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)[1]。肠道病毒感染能引起流行性胸膜痛、手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)、疱疹性咽炎、脊髓灰质炎、甲型病毒性肝炎等疾病。在美国,每年肠道病毒导致1000万~3000万人患病,高发于夏季和秋季[2]。肠道病毒是儿童感染的重要病原体,为家庭和社会带来严重的疾病负担。自1949年至今,脊髓灰质炎和甲型病毒性肝炎都是我国儿童肠道病毒感染导致的主要肠道传染病。2008年,我国EV71感染所致的HFMD暴发和流行,是迄今为止亚太地区最严重的一次HFMD流行。这些肠道病毒疾病的暴发和流行给流行地区带来了巨大的社会、经济负担。

云南省昆明地区2022年柯萨奇病毒A16型的VP1区分子特征

目的对昆明市某医院2022年从手足口病患儿分离的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的全VP1基因区分子特征分析。方法对昆明市某医院2022年从手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)患儿200份临床样品粪便标本进行处理,分别通过RD细胞和Vero细胞分离,对经3次培养后仍产生细胞效应(cytopathogenic effect,CPE)的细胞培养液提取病毒核酸,然后用通用引物222/224经RT-PCR扩增并测序,序列经BLAST比对确定其血清型,对鉴定为柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的再用特异引物CA16VP1F/CA16VP1R扩增其全VP1区并测序和拼接。下载CVA16病毒标准序列,采用Geneious 5.4.1和MEGA 6.05等软件对本研究CVA16的全VP1区的核苷酸和氨基酸序列分析。结果经鉴定后共检出22株从Vero细胞分离CVA16和6株RD细胞分离的CVA16毒株,进一步通过特异引物扩增获得21株可用的CVA16VP1全长序列,基于全VP1基因系统进化分析,这21株CVA16全属于B1a基因型。21株CVA16全长VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为91.9%~99.6%和89.2%~99.3%;与中国CVA16 B1a基因型的其他株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.7%~96.3%和89.2%~97.0%。与CVA16 B1b其他参考株对比,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在84.3%~87.2%和89.2%~97.0%。与其它CVA16的B1a基因亚型相比较发现21个氨基酸位点出现变异。结论2022年中国云南省昆明某医院引起HFMD的CVA16毒株属于B1a基因型,应继续监测以明确其流行特征。

泉州市扩大国家免疫规划前后甲型病毒性肝炎流行病学特征分析

目的:了解福建省泉州市扩大免疫规划前后甲型病毒性肝炎的流行病学特征,为相关部门制定防控措施提供参考依据。方法:收集整理中国疾病预防控制信息系统中2004—2022年泉州市报告的甲型病毒性肝炎病例数据资料,采用描述性研究方法分析泉州市甲型病毒性肝炎病例的流行病学特征。结果:2004—2022年泉州市共报告甲型病毒性肝炎2610例,年均报告发病率为1.71/10万,发病率由2004年的2.32/10万下降至2022年的1.25/10万,报告发病率呈下降趋势;年均报告发病率居前3位的县(市、区)为南安市、晋江市、鲤城区,泉州台商投资区年均报告发病率最低;0~14岁、15~29岁、30~44岁年龄段人群发病均呈下降趋势,45~59岁、60~74岁年龄段人群发病均呈上升趋势;报告发病人数最多的职业为农民。结论:2008年泉州市将甲型病毒性肝炎疫苗纳入免疫规划后,甲型病毒性肝炎总体报告发病率呈下降趋势,0~14岁年龄段人群发病例数显著下降。相关部门应继续开展甲型病毒性肝炎监测工作,加大疫苗接种宣传教育力度,针对重点人群制定防控策略,从而进一步降低泉州市甲型病毒性肝炎的发病率。

戊型肝炎病毒感染调控宿主抗病毒信号通路的研究进展

先天免疫是抵御病毒感染的第一道防线。戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)感染免疫健全人群导致急性自限性疾病,但免疫功能低下患者或孕妇感染HEV后会导致慢性化感染。HEV感染宿主细胞后,体内的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)将识别病毒基因组,进而诱导宿主多条抗病毒信号通路快速激活,使干扰素(Interferons,IFNs)和干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表达,从而抑制病毒的复制。而HEV编码的蛋白参与了逃逸宿主的抗病毒先天免疫反应,抑制宿主细胞因子或趋化因子的产生,从而建立适宜病毒复制的环境。现将HEV感染对宿主信号通路的调控以及HEV逃逸宿主先天免疫的研究进行综述。

LAMP技术特点及其用于肝炎病毒检测的相关研究进展

环介导等温扩增(LAMP)为一种用于检测靶标DNA、RNA的恒温扩增核酸检测技术,为分子即时检验(POCT)领域中应用最广泛技术,近年来广泛应用于动植物病毒感染、传染性疾病诊断,具有诊断效能高、操作简单等优势。肝炎病毒检测,为该病临床诊断、预后评估重要环节。近年来有学者将LAMP技术应用于肝炎病毒检测中,获得良好效果。且随LAMP技术不断优化,其诊断效能进一步提升。

柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

BVDV中E^(rns)、N^(pro)蛋白真核表达质粒的构建

目的:试验旨在构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结构蛋白(糖基化囊膜蛋白E^(rns))和非结构蛋白(N^(pro))重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对E^(rns)、N^(pro)进行表达.方法:参考GenBank中公布的BVDV参考株核苷酸序列分别设计引物N^(pro)-F/R和E^(rns)-F/R,用BVDV病毒的cDNA进行PCR扩增,将回收纯化的N^(pro)和E^(rns)目的基因和真核表达载体pCMV-Myc进行双酶切.利用琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化,将回收纯化产物采用T4 DNA连接酶进行连接并转化至BL-21感受态细胞中,构建真核表达质粒,将重组质粒命名为pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns).双酶切及测序鉴定正确后转染HEK-293细胞,采用PCR及Western blotting检测N^(pro)和E^(rns)在细胞内的表达.结果:pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns)真核表达质粒构建成功,N^(pro)和E^(rns)在HEK293细胞中成功表达.结论:N^(pro)、E^(rns)蛋白的成功表达可为探究蛋白质生物学功能、研究病毒感染机制及研制亚单位疫苗提供理论参考.

无锡地区HBsAg-/HBV DNA+献血人群HBcrAg检出特点分析

目的分析新型血清标志物乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)在无锡地区HBsAg-/HBV DNA+献血人群中的检出特点。方法通过电话追踪随访了37名既往HBsAg-/HBV DNA+献血者并获得其血清,采用电化学发光法和实时荧光定量PCR核酸筛检出22例HBsAg-/HBV DNA+献血者血清作为OBI组进行HBcrAg酶联免疫吸附法检测。挑选出20名经2遍酶免和1遍核酸筛检的健康献血者的血清作为健康对照组,20例经无锡第五人民医院临床诊断为慢性乙型肝炎患者血清作为实验的CHB组,分别进行HBcrAg酶联免疫吸附法检测;并对OBI组进行HBcrAg与HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA的相关性分析。结果37份献血者标本经化学发光法检测HBsAg和核酸筛查,检出22份HBsAg-/HBV DNA+标本即OBI组,检出率59.46%。OBI组与健康对照组、CHB组血清的HBcrAg表达含量分别是(0.92±0.13)ng/mL、(0.47±0.09)ng/mL、(1.14±0.23)ng/mL(P<0.05),OBI组与CHB组的HBcrAg表达均高于健康对照组(P<0.05)。OBI组的HBcrAg与HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA指标均无相关性(P>0.05)。结论OBI组与CHB组的HBcrAg表达均高于健康对照组,其血清HBcrAg在一定程度上与HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA无相关性,HBcrAg在筛查HBsAg-/HBV DNA+献血者中具有较好的应用前景。