补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用

背景:补骨脂素具有很强的抗骨质疏松活性,可能对化疗导致的骨质疏松具有恢复作用。目的:探讨补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的恢复作用及机制。方法:分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,以MTT法检测补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响,以成骨诱导结合碱性磷酸酶染色确定补骨脂素对环磷酰胺抑制骨髓间充质干细胞成骨分化恢复作用的最佳剂量。采用RT-qPCR法检测补骨脂素干预不同时间点成骨分化标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Wnt1、Wnt4、Wnt10b、β-catenin、c-MYC的mRNA表达;采用Western blot法检测补骨脂素干预不同时间点成骨特异性转录因子Runx2及Wnt/β-catenin信号通路相关基因Activeβ-catenin、DKK1、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表达。结果与结论:(1)不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力没有显著影响;200μmol/L补骨脂素干预后对环磷酰胺诱导骨髓间充质干细胞成骨分化抑制的恢复作用最佳;(2)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨标志基因Runx2、ALP、Osteocalcin、骨保护素mRNA表达和Runx2蛋白表达的降低;(3)补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin通路相关基因Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA表达和Activeβ-catenin、c-MYC、Cyclin D1蛋白表达的降低以及DKK1蛋白表达的升高;(4)结果表明,环磷酰胺能抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,补骨脂素对其具有恢复作用,且200μmol/L补骨脂素干预效果最佳,而这种保护作用可能与补骨脂素激活Wnt4/β-catenin信号通路有关。

芒果苷对大鼠骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

背景:间充质干细胞移植治疗脊髓损伤有一定效果,但仍存在局部氧化应激环境导致移植细胞存活率低、细胞移植效率不佳等问题。目的:探究芒果苷在氧化应激状态下对骨髓间充质干细胞的保护作用。方法:取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,按浓度梯度0,20,40,80,160μmol/L加入芒果苷孵育2 h,然后加入含400μmol/L H_(2)O_(2)的无血清L-DMEM培养基及相应浓度的芒果苷继续培养12 h及24 h,以常规培养的大鼠骨髓间充质干细胞为正常对照组。MTT法检测各组细胞存活情况,按照试剂盒操作方法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶、丙二醛及过氧化氢酶水平。结果与结论:与正常对照组相比,H_(2)O_(2)组细胞的存活能力显著降低(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著降低(P<0.01),丙二醛水平显著升高(P<0.01);与H_(2)O_(2)组相比,芒果苷组细胞的存活能力显著升高(P<0.01),超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平显著升高(P<0.01),丙二醛水平显著降低(P<0.01)。芒果苷在20μmol/L浓度以上表现出浓度依赖性的抗氧化应激保护活性,且在160μmol/L以下无细胞毒性。结果表明,抗氧化剂芒果苷可增加骨髓间充质干细胞的抗氧化活性,为骨髓间充质干细胞移植提供一种新的预处理策略。

小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:小分子药物TD-198946是一种能诱导干细胞形成软骨的高效软骨生成剂,但目前尚不清楚其对成骨分化的作用。目的:探讨小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的效果及其作用机制。方法:提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用CCK-8法评估不同浓度TD-198946对骨髓间充质干细胞增殖的影响,确定TD-198946的最佳使用浓度;然后加入最适浓度TD-198946和成骨分化培养基对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导;成骨诱导第3天用qRT-PCR检测碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原基因表达;成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶染色,Western blot检测Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表达;成骨诱导第21天进行茜素红染色。结果与结论:①CCK-8实验结果显示,100 nmol/L TD-198946能促进骨髓间充质干细胞增殖;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,TD-198946能促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化;③qRT-PCR结果显示,TD-198946可促进成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的表达;④Western blot结果显示,TD-198946可促进Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原以及p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果表明,小分子药物TD-198946可能通过激活PI3K/AKT信号通路,诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。

骨形态发生蛋白/Wnt信号通路调控成骨:揭示骨骼形成和重塑的分子机制

背景:成骨细胞是负责骨骼形成和重塑的主要细胞类型,其功能的正常发挥受到多种信号通路的精密调控,其中,骨形态发生蛋白和Wnt信号通路在成骨过程中起着关键作用。目的:综述了骨形态发生蛋白/Wnt信号通路在调控成骨细胞功能中的作用,并分析其在不同生理和病理条件下的变化,以期进一步揭示骨骼形成和重塑的分子机制。方法:以中文检索词“BMP信号通路,Wnt信号通路,成骨”及英文检索词“BMP signaling pathway,Wnt signaling pathway,osteogenesis”在中国知网、万方和PubMed数据库中检索研究原著,检索时限为各数据库建库至2023年6月的相关文献,最终筛选61篇文献进行分析总结。采用文献综述的方法,对骨形态发生蛋白/Wnt信号通路调控成骨作用的研究进行梳理和分析。结果与结论:①骨形态发生蛋白和Wnt信号通路在成骨细胞的分化、增殖和成熟过程中发挥重要作用。骨形态发生蛋白信号通路主要通过激活Smad蛋白来调控成骨相关基因的表达,Smad蛋白被激活后进入细胞核,调控与成骨相关的基因表达,与骨形态发生蛋白不同,Wnt信号通路主要依赖于β-catenin的激活来发挥生物学效应。②不同生理和病理状态下,骨形态发生蛋白/Wnt信号通路的调控作用会受到多种因素的影响。生长因子及激素及机械应力等会在一定程度上影响骨形态发生蛋白/Wnt信号通路的活性。③骨形态发生蛋白/Wnt信号通路在调控成骨过程中与其他信号通路相互作用,共同构成复杂的调控网络。④中药和天然化合物可以通过调控信号通路来促进骨骼健康,为中药治疗骨骼疾病提供了新的可能性。⑤未来研究可进一步探讨骨形态发生蛋白/Wnt信号通路与其他信号通路的相互作用以及其在不同生理和病理条件下的变化,解析此复杂网络中的关键节点和调控机制,为骨骼相关疾病的治疗提供更精确的靶点,也为揭示骨骼形成和重塑的分子机制提供新的思路。

巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

背景:巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种具有多效性作用的细胞因子,可以在不同类型干细胞中自分泌并且能调控细胞的增殖、分化和迁移。课题组前期研究证实人胚胎干细胞自分泌MIF,且在培养液中浓度基本固定。然而,MIF是否参与了人胚胎干细胞的存活、增殖和分化尚不清楚。目的:探究MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用。方法:(1)培养人胚胎干细胞H9,CCK-8法检测并绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法定量检测培养基中MIF水平。(2)为了明确外源性MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,分为:对照组,细胞在干细胞培养基中正常培养;外源性MIF组,在干细胞培养基中分别添加30,100,300 ng/m L的MIF;MIF抑制剂ISO-1组,在干细胞培养基中分别添加2,7,21μmol/L的ISO-1;MIF+ISO-1组,在不同浓度ISO-1组中分别添加100 ng/m L MIF,采用CCK-8法检测上述各组细胞活力。(3)为进一步阐明MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,采用CRISPRCas9技术构建MIF敲除的H9细胞系,观察建系情况。(4)为了明确高浓度MIF对人胚胎干细胞初步分化是否有影响,在培养基中分别添加100 ng/m L MIF和100 ng/m L CXCR4中和抗体,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)、免疫细胞荧光、蛋白质印迹法(Western blot)检测干细胞自我更新因子(KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2)及分化转录因子(FOXA2、OTX2)的表达水平。结果与结论:(1)人胚胎干细胞H9的对数生长期为3-6 d,正常生长的情况下自分泌MIF水平约为20 ng/m L,与细胞量无关;(2)与对照组相比,添加不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响(P>0.05);ISO-1明显抑制人胚胎干细胞的增殖,ISO-1浓度越大,抑制越明显(P<0.05);ISO-1中添加MIF可以减少ISO-1的抑制作用(P<0.05);(3)RT-q PCR检测MIF基因敲除约50%后,人胚胎干细胞生长活力显著降低并且无法建系成功;(4)在培养基中添加100 ng/m L外源性MIF,自我更新转录因子KLF4的m RNA、蛋白及荧光表达水平均下降;分化因子FOXA2的m RNA、蛋白及荧光表达水平均上升;(5)在培养基中添加100 ng/m L CXCR4中和抗体,KLF4的m RNA及蛋白表达水平均上升;FOXA2的m RNA及蛋白表达水平均下降,与MIF组表达趋势相反。综上所述,人胚胎干细胞自分泌的MIF是其存活所必需的;培养基中额外添加MIF并不能促进人胚胎干细胞增殖,但可以使自我更新因子KLF4表达下降,转录因子FOXA2表达上升,为下一步探明MIF对人胚胎干细胞分化的影响及机制提供了线索,MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用。

运动预处理联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

背景:干细胞疗法在改善心肌梗死后心脏重构方面具有广阔前景,但心肌微环境改变影响干细胞疗效。运动预处理类似于缺血预处理,能够对心肌产生保护作用。然而,运动预处理与干细胞移植联合作用的效果与机制鲜有关注。目的:观察运动预处理对心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞移植效果的影响,探讨局部炎症微环境在其中的作用机制。方法:80只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、移植组和联合组,每组20只。利用结扎冠状动脉左前降支的方法制作心肌梗死大鼠模型,假手术组仅穿线不结扎。移植组和联合组造模后于心肌内注射雄性大鼠来源骨髓间充质干细胞,此外,联合组在造模前还需进行8周跑台运动(即运动预处理)。干细胞移植后4周,采用递增负荷运动力竭实验测定运动能力,超声心动术测定心脏结构与功能,压力容积导管法检测左心室血液动力学,原位染色法进行心肌组织病理学观察并获取心肌胶原容积分数。干细胞移植后1,7 d和4周,采用定量反转录聚合酶链反应检测左心室促炎症因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、抗炎症因子(白细胞介素10)、Y染色体性别决定区和胚胎基因(心房钠尿肽、脑钠肽、β-肌球蛋白重链)m RNA表达量。结果与结论:(1)干细胞移植后4周:与假手术组比较,模型组运动能力、左心室射血分数降低(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数增加(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量上调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量下调(P <0.05)。与模型组比较,移植组运动能力、左心室射血分数增加(P <0.05);心肌梗死面积、心肌细胞横截面积、胶原容积分数下降(P <0.05);胚胎基因以及促炎因子m RNA表达量下调(P <0.05),白细胞介素10 m RNA表达量无显著性变化(P> 0.05)。与移植组比较,联合组上述各指标均进一步改善(P<0.05)。(2)干细胞移植后1,7d:与移植组比较,联合组Y染色体性别决定区m RNA表达量升高(P<0.05)。(3)相关分析显示,白细胞介素1β、白细胞介素6(除移植后1 d)、肿瘤坏死因子α与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈负相关(P <0.05),白细胞介素10与Y染色体性别决定区m RNA表达量呈正相关(P <0.05)。结果表明:运动预处理能够增强骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死大鼠的效果,表现为心脏重构得到抑制、心功能进一步提升,其机制与心肌炎症微环境改善促进骨髓间充质干细胞滞留和存活有关。

干细胞的趋电性迁移及机制

背景:随着对干细胞技术研究的深入,如何使其准确归巢成为临床应用中的一大难题。除药物和趋化因子等信号的诱导外,电场也被广泛应用于指导干细胞的定向迁移,并可增强其迁移速度和定向性。目的:旨在分析总结电场对干细胞迁移特性的影响,同时综述可能的作用机制。方法:通过检索Pub Med和中国知网数据库,收集截至2024年3月的相关文献,英文检索词:“stem cells,direct current electric field,pulsed electric field,migration,electric field device,mechanism”;中文检索词:“干细胞,直流电场,脉冲电场,迁移,电场装置,机制”。排除不能获取全文和与主题无关的文献。结果与结论:根据筛选要求共纳入58篇文献,包括中文文献15篇及英文文献43篇。文献以脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、人胚胎干细胞和人诱导性多功能干细胞为研究对象,在迁移装置中研究电场的不同参数对上述干细胞迁移的影响及其机制。(1)电场作为一种简单、无创且稳定的干预方式在指导干细胞定向迁移的过程中起着积极作用;(2)不同类型的干细胞发生趋电性迁移的方向不同,同时大部分干细胞的迁移速度和定向性是随着电场强度增加而增加的;(3)不同的电场装置在观测干细胞迁移时的侧重点不同,可根据实验目的而择优选择相关装置;(4)不同干细胞趋电性迁移的机制不完全相同,多数干细胞迁移过程中有MAPK通路、ROCK活化以及PI3K功能的参与,同时还有其他蛋白质复合物与信号通路参与调控该过程;(5)除电场参数不同之外,细胞本身的衰老情况和培养环境也会对趋电性迁移的结果产生影响。总而言之,电场作为一种影响干细胞迁移特性的重要信号,与其他新兴材料结合在组织工程应用中展现出了一定的潜力,有望在指导干细胞归巢方面发挥更加重要的作用,促进骨组织再生和修复以及神经系统、自身免疫系统以及肿瘤等疾病的研究取得更大的突破。

物理方法干预骨髓间充质干细胞分化最理想的参数

背景:近年来研究发现物理干预手段对骨髓间充质干细胞的增殖、分化和迁移具有显著影响。但目前物理干预尚存在诸如基础研究数据有待加强、统一的参数标准尚需进一步完善等不足。目的:综述物理手段对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法:检索中国知网和PubMed数据库,以“骨髓间充质干细胞,骨髓基质细胞,成骨分化,成软骨分化,电刺激,机械刺激,低氧,脉冲电磁场,低强度脉冲超声”为中文检索词,以“bone marrow mesenchymal stem cells(BMSC),bone marrow stromal cells,osteogenesis differentiation,chondrocytes differentiation,electrical stimulation,mechanical stimulation,hypoxia,electromagnetic fields,low intensity pulsed ultrasound”为英文检索词,选取58篇文献进行综述。结果与结论:①物理手段通过改变特定的微环境调控骨髓间充质干细胞的增殖、分化等,但参数尚未统一,今后应进一步优化并探讨相关物理因素调控骨髓间充质干细胞增殖及分化的最佳参数和作用条件;②某些特殊物理环境条件难以通过低成本的常规手段开展应用,有待后续研究发展进一步降低特殊物理条件的构建难度;③物理手段干预骨髓间充质细胞增殖与分化目前尚未广泛应用于临床,未来需要进一步研究并促进临床转化。

拉伸条件下聚二甲基硅氧烷表面粗糙度对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景:研究表明,机械刺激对骨髓间充质干细胞的谱系特异性分化至关重要。然而,机械拉伸条件下不同粗糙度表面的骨髓间充质干细胞成骨分化情况尚不清楚。目的:探讨拉伸条件下聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)表面粗糙度对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及作用机制。方法:通过不同目砂纸(120目、1 000目和10 000目)在PDMS表面构建3种不同粗糙度的形貌(PDMS-120M、PDMS-1000M和PDMS-10000M),与空气接触的PDMS表面作为对照组。采用RT-q PCR检测静态条件下和拉伸条件下(0%,2%,4%,6%拉伸幅度)不同粗糙度PDMS表面的骨髓间充质干细胞中成骨相关基因表达。采用RT-q PCR、Western blot检测2%拉伸条件下不同粗糙度表面骨髓间充质干细胞中SIRT1、成骨相关基因和蛋白表达,采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色观察2%拉伸条件下不同粗糙度PDMS表面骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。结果与结论:(1)静态条件下粗糙度为(13.51±2.11)μmPDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞成骨基因表达最高;(2)相对光滑PDMS表面的骨髓间充质干细胞在4%拉伸幅度条件下有更好的成骨分化效果,而PDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞在2%拉伸幅度条件下有更好的成骨分化效果;(3)在2%拉伸幅度条件下,粗糙度为(13.51±2.11)μm PDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞有更好的成骨分化效果,可能与激活SIRT1信号通路有关。

温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜的制备与表征

背景:骨质疏松症是牙种植治疗的高风险因素,制备缓释阿仑膦酸钠的组织工程支架应用于骨质疏松患者口腔种植手术是当前口腔骨组织工程研究热点。目的:制备阿仑膦酸钠/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜,表征其缓释性能。方法:(1)采用物理交联法制备不同质量比(壳聚糖与聚乙烯醇的质量比分别为3∶7、5∶5、7∶3)的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜与单纯的壳聚糖、聚乙烯醇水凝胶膜,通过表征水凝胶膜的形貌、水接触角、力学性能、溶胀率与细胞相容性筛选适宜的水凝胶膜作为阿仑膦酸钠的载体。(2)制备含0,0.4,1.2,2.0 mg/L阿仑膦酸钠的单纯壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜,将大鼠骨髓间充质干细胞分别与4组水凝胶膜共培养,通过CCK-8法与CD44免疫荧光染色检测水凝胶膜的细胞相容性。将载药壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜浸泡于PBS中,采用紫外可见分光光度法检测复合水凝胶膜的药物释放性能。结果与结论:(1)表征结果显示,随着水凝胶膜中聚乙烯醇质量的增加,水凝胶膜的结构密度增加、孔隙率减少,水接触角(均在90°以内)、断裂伸长率与抗压强度增大,平衡溶胀率降低,对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖均无影响,单纯壳聚糖水凝胶膜可促进大鼠骨髓间充质干细胞的黏附,3∶7、5∶5比例复合水凝胶膜不影响大鼠骨髓间充质干细胞的黏附,单纯聚乙烯醇水凝胶膜、7∶3比例复合水凝胶膜抑制大鼠骨髓间充质干细胞的黏附,综合以上结果,选择5∶5复合水凝胶膜作为阿仑膦酸钠的载体。(2)CCK-8检测结果显示,含0.4,1.2 mg/L阿仑膦酸钠组复合水凝胶膜无细胞毒性;CD44免疫荧光染色结果显示,含0.4 mg/L阿仑膦酸钠组复合水凝胶膜不影响大鼠骨髓间充质干细胞的黏附,含1.2,2.0 mg/L阿仑膦酸钠组复合水凝胶膜抑制大鼠骨髓间充质干细胞的黏附;含0.4,1.2,2.0 mg/L阿仑膦酸钠的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜在最初6 h内爆发性释放阿仑膦酸钠,此后均匀稳定地释放阿仑膦酸钠,释放时间达96 h以上。(3)结果表明,5∶5比例的壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶膜具有良好的理化性能、细胞相容性,可以作为阿仑膦酸钠的缓释载体。

黑枸杞花青素联合人脂肪源性血管外膜细胞支持脐血造血干/祖细胞的增殖

背景:黑枸杞花青素(Anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr,ALRM)是黑枸杞中重要的活性成分之一,具有抗氧化、免疫调节等功效。人脂肪源性血管外膜细胞(CD146^(+)hAD-PCs)是骨髓间充质干细胞的前体细胞,在体外具有促进造血干/祖细胞增殖与分化的功能。ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血造血干/组细胞的体外支持作用有待于研究。目的:探讨ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血CD34^(+)造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法:CCK-8法检测不同质量浓度ALRM(0,200,400,600,800,1000 mg/L)对CD146^(+)hAD-PCs增殖的影响;流式细胞术检测ALRM对CD146^(+)hAD-PCs细胞周期的影响。共培养实验分为空白组、ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组、ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组,分析ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血CD34^(+)造血干/祖细胞的体外支持作用。共培养1,2,4周,比较扩增后细胞数量、集落形成单位数量,流式细胞仪检测细胞免疫表型,ELISA检测细胞因子水平。结果与结论:(1)ALRM质量浓度为200 mg/L时,CD146^(+)hAD-PCs活力最高,CD146^(+)hAD-PCs的G_(0)/G_(1)期细胞比例下降,S期、G_(2)/M期细胞比例上升(P<0.01)。(2)脐血CD34^(+)造血干/祖细胞数量变化:在共培养1,2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组高于ALRM组(P均<0.05),在共培养2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组高于CD146^(+)hAD-PCs组(P均<0.05),ALRM组与空白组随着共培养时间延长细胞数量逐渐减少。(3)集落形成能力及免疫表型分析:在共培养1,2周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的集落形成单位数量高于CD146^(+)hAD-PCs组和ALRM组(P均<0.05);在共培养1,2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组CD45^(+)、CD34^(+)CD33^(-)细胞比例高于CD146^(+)hAD-PCs组(P均<0.01)。(4)细胞因子变化:在共培养4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的白细胞介素2水平高于ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05);在共培养2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组白细胞介素3水平高于CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05);在共培养1周时ALRM+CD146^(+)h AD-PCs组的粒细胞集落刺激因子水平高于CD146^(+)hAD-PCs组,在共培养2周时高于ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.01);在共培养1,2,4周时ALRM组、ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的干扰素γ水平低于CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05)。(5)由于空白组无基质细胞,脐血CD34^(+)造血干/祖细胞在共培养1周之后就无法计数,未进行免疫表型、集落分析和细胞因子检测。(6)结果表明:ALRM可以通过促进CD146^(+)hAD-PCs增殖和细胞周期转化进而促进脐血CD34^(+)造血干/祖细胞的体外扩增,在造血干细胞移植研究方面具有重要价值。

组蛋白H3K27me3修饰缺失上调弥漫型胃癌细胞中SLC7A11的表达

目的描绘弥漫型胃癌组织中组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化(H3K27me3)修饰的全基因组分布图谱,通过鉴定H3K27me3所调控的关键靶基因,初步探究H3K27me3修饰重编程可能调控弥漫型胃癌细胞发生发展的作用机制。方法样本来源于2021-2023年在陆军特色医学中心消化内科内镜中心及手术室胃肠外科组接受检查或治疗的患者。共收集到正常组患者14例,其中男性6例,女性8例,平均年龄46岁;胃癌组患者14例,其中男性8例,女性6例,平均年龄63岁。采用染色质靶向剪切及转座酶技术(cleavage under target and tagmentation,CUT&Tag)捕获基因组H3K27me3修饰区域,分析H3K27me3修饰重编程特征。整合转录组(RNA‐Seq)测序数据、高通量染色体构象捕获技术(high‐throughput chromosome conformation capture,Hi‐C)及已发表的公共单细胞数据,分析H3K27me3修饰重编程在弥漫型胃癌细胞中所调控靶基因。结果CUT&Tag和RNA测序数据质量符合下游分析标准,正常胃黏膜组织和弥漫型胃癌组织的组蛋白H3K27me3修饰均主要分布于远端基因间区和内含子区。相较于正常组织,胃癌组织的H3K27me3修饰存在显著的重编程特征,表现为H3K27me3总体信号强度明显降低。其中缺失的2912个H3K27me3信号峰可能导致822个肿瘤相关基因的表达上调,这些基因中上调最显著(信号值强度的差异倍数≥2,P<0.05)的56个基因主要富集于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)信号通路,其中甲硫氨酸转运体SLC7A5和胱氨酸转运体SLC7A11在胃癌组织中的表达最高。单细胞数据提示,弥漫型胃癌组织中SLC7A11的异常高表达主要存在于肿瘤上皮细胞。利用公共数据和免疫组织化学实验进一步验证SLC7A11在弥漫型胃癌中高表达,且与胃癌患者的不良预后相关。结论组蛋白H3K27me3修饰重编程是弥漫型胃癌的重要表观遗传学特征;组蛋白H3K27me3修饰缺失可能上调肿瘤细胞SLC7A11表达,进而促进肿瘤进展。

植物同源域指蛋白6对肝癌Hep-G2细胞迁移能力的影响

目的探讨植物同源域指蛋白6(PHF6)对肝癌Hep-G2细胞迁移能力的影响,为临床诊疗提供参考。方法根据癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析PHF6在人正常肝脏和肝癌组织的表达情况,以及其表达对300余例肝癌患者近十年生存率的影响。比较siNC组(转染PHF6无义序列)和siPHF6组(转染siRNA-PHF6)细胞PHF6 RNA表达水平,利用划痕和Transwell实验检测两组细胞迁移能力,通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测两组细胞上皮间质转化(EMT)相关基因表达情况。结果PHF6在肝癌患者中存在明显过表达现象,高表达PHF6患者存活率降低。转染48 h后,siPHF6组细胞中PHF6 RNA表达水平低于siNC组(P=0.0016)。划痕后12、24、48、72h,siPHF6组细胞划痕距离均大于siNC组,siPHF6组细胞迁移数量小于siNC组。与siNC组相比,siPHF6组细胞神经钙黏蛋白(CDH2)、纤连蛋白(FN1)的表达水平均降低,CDH1的表达水平升高(P<0.0001、P<0.0001、P=0.0018)。结论沉默PHF6可显著抑制肝癌细胞的迁移和EMT进程,靶向PHF6治疗肝癌具有应用前途。

基于二代测序的HLA-Ⅱ类等位基因多态性研究及等位基因丢失防范策略

目的:研究二代测序技术(NGS)检测深圳地区随机健康无关汉族人群HLA-DRB1、DQB1、DQA1、DRB3、DRB4、DRB5、DPA1、DPB1等位基因多态性的精确性,探讨HLA-DRB1等位基因丢失的原因及室内关键质控体系建立策略。方法:采用Mi Seq DxTM NGS平台对1012例样本完成HLA-II类等位基因分型。对质控体系软件提示的疑难样本和HLA-DRB1纯合子样本采用PCR-SSOP法或PCR-SBT法进行确认。结果:检出HLA-DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1、DPB1等位基因分别有45、7、5、7、17、21、10、27种。常见等位基因(频率>10%)有HLA-DRB1*09:01(17.09%)、15:01(10.72%);DRB3*02:02(25.99%)、03:01(10.18%);DRB4*01:03(36.46%);DRB5*01:01(15.42%);DQA1*01:02(20.01%)、03:02(17.19%);DQB1*03:01(19.47%)、03:03(17.98%)、05:02(11.66%)、06:01(10.67%);DPA1*02:02(54.45%)、01:03(31.18%);DPB1*05:01(39.13%)、02:01(16.90%)。HLA-DRB1和DQB1位点基因频率与中国常见及确认的HLA等位基因表(CWD2.4)进行统计学比较,差异无统计学意义(χ^(2)=12.68,P>0.05)。对NGS检出的94例HLA-DRB1纯合子样本采用PCR-SSOP法进行复检,检出HLA-DRB1位点漏检等位基因1例,通过SBT法确认为漏检DRB1*04:03等位基因,为此建立了本实验室室内质控体系。检出新等位基因2例,获WHO HLA系统因素命名委员会命名。结论:基于NGS-HLA分型方案的HLA分型结果,模棱两可结果比率更低。HLA-II类等位基因在深圳地区无关健康供者汉族人群中存在遗传多态性。在临床组织相容性试验中独立使用NGS方法存在局限性,需要内部质量控制策略来防范偶发的等位基因丢失事件。

细胞周期蛋白依赖性激酶7抑制剂THZ1对脑胶质瘤干细胞干性的调控及机制

背景:THZ1是一种细胞周期蛋白依赖性激酶7的抑制剂,可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,但THZ1是否可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响脑胶质瘤干细胞的干性尚不清楚。目的:探究THZ1对脑胶质瘤细胞U87干性的影响及机制。方法:培养脑胶质瘤细胞U87形成干细胞球并通过Western blot验证干性相关蛋白的表达;采用CCK-8法检测THZ1作用于U87细胞的半数抑制浓度(IC_(50));通过克隆实验、划痕实验、Transwell迁移实验确定THZ1对U87细胞增殖、迁移的影响;分析THZ1处理对U87干细胞成球率及干细胞球体大小的影响;Western blot检测干性相关蛋白CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2和上皮-间充质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Occludin、Snail以及Wnt/β-catenin通路相关蛋白Axin1、β-Catenin、Wnt-5a、GSK3β、Cyclind-1、C-myc的表达变化。结果与结论:①与贴壁细胞相比,U87干细胞干性相关蛋白Nestin、CD133、ABCG2、Nanog、OCT4、SOX2表达明显升高;②与对照组相比,THZ1减弱了U87细胞的增殖和迁移能力;③THZ1抑制U87干细胞成球率及球体大小,下调干性相关蛋白的表达;④THZ1处理后,U87干细胞中N-cadherin、Snail蛋白表达降低,而E-cadherin、Occludin蛋白表达升高;(5)THZ1处理使U87干细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白Axin1、β-Catenin、Wnt-5a、GSK3β、Cyclind-1、C-myc表达降低。结果表明:THZ1通过下调Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达,抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖、迁移,抑制U87干细胞成球能力、干性相关蛋白表达和上皮-间充质转化能力。

白细胞介素-17基因多态性与山西东南地区汉族人群2型糖尿病的相关性

目的 研究山西省东南地区汉族人群白细胞介素-17(IL-17)基因单核苷酸多态性及其与2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法 收集健康对照组和T2DM组受试者基本信息及临床资料,提取全血DNA,采用聚合酶链反应-高温连接酶反应对IL-17基因4个位点(rs2275913、rs3819024、rs4711998和rs8193036)进行多态性检测。结果 两组IL-17基因4个SNP位点基因型和等位基因频率分布差异均无统计学意义(P> 0.05),在校正年龄、BMI、WC和血脂异常等因素后,两组研究对象在不同遗传模型下的基因型及等位基因频率分布差异亦无统计学意义(P> 0.05)。进一步分析显示,T2DM组rs2275913位点AA基因型FPG和HOMA-IR显著低于AG和GG基因型,三组间差异有统计学意义(P <0.05);而三组间BMI、FINS、HbA1c水平差异无统计学意义(P> 0.05)。此外,T2DM组rs3819024位点AA基因型WC、HOMA-IR显著高于GG基因型,差异有统计学意义(P <0.05)。结论 IL-17基因rs2275913、rs3819024、rs4711998、rs8193036多态性与山西省东南地区汉族人群T2DM可能无关,IL-17 rs2275913位点AA基因型、rs3819024位点GG基因型分别与山西东南地区汉族T2DM患者FPG和HOMA-IR、WC和HOMA-IR相关,可能是IL-17影响糖代谢的潜在基因型。

医学遗传学教学案例库建设实践

医学遗传学涉及疾病众多,机制复杂,案例教学对于提升医学遗传学教学质量具有较好的效果。文章探讨了医学遗传学案例库建设的必要性,并以努南综合征为例,介绍了案例库的结构与内容。教学案例主要包含基本信息、病史和检查、提出问题、参考答案、知识拓展等内容。案例库为教师提供丰富的教学素材和考核资料,有助于改善教学效果和提升学生的岗位胜任力。

静息期精原前体细胞Rb1基因敲除致精原干细胞特化异常机制初探

目的探讨静息期精原前体细胞Rb1敲除致雄鼠精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)特化异常的调控机制。方法①用R对在基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)(GEO登记号:GSE124904)获取的出生后0.5 d(postnatal day 0.5,P0.5)雄鼠精原前体细胞单细胞测序数据进行分析。②用Vasa-Cre工具鼠与Rb1^(flox/flox)(或Id4-gfpTg;Rb1^(flox/flox))小鼠配繁构建静息期精原前体细胞Rb1条件性敲除(conditional knock out,cKO)雄鼠或带ID4绿色荧光(ID4-GFP)的Rb1 cKO雄鼠,通过PCR基因鉴定判断生殖细胞Rb1敲除情况以区分cKO雄鼠与对照(Con)。采集出生后数天内的小鼠(n=3~8)睾丸,利用流式细胞术基于细胞荧光强度将ID4‐GFP细胞均分为3个群落,检测各个群落细胞数量和细胞周期。③免疫荧光染色检测生殖细胞增殖(Ki67+)、SSCs特化(FOXO1胞核转换)和生殖细胞分化(STRA8+)情况。④TUNEL染色检测细胞凋亡。结果①单细胞测序数据分析显示:在P0.5精原前体细胞的2类细胞中,与细胞增殖相关的基因在将特化为精原干细胞的那一群细胞中富集表达。②生殖细胞增殖情况检测表明:P2.5时,对照[(11.22±3.27)%]与cKO小鼠[(46.10±6.21)%)]小鼠睾丸横切面生殖细胞Ki67+占比差异具有统计学意义(P<0.01)。③流式细胞术分析表明:P2.5对照[(5.05±1.46)%]与cKO[(12.05±2.22)%]小鼠睾丸ID4‐GFP荧光强度最强的那群细胞处于S期的占比差异具有统计学意义(P<0.05)。④TUNEL染色显示cKO组而非对照组小鼠睾丸横切面检测到细胞发生凋亡。⑤SSCs特化标志检测结果显示对照[(20.57±2.15)%]和cKO[(45.08±2.45)%]小鼠睾丸横切面生殖细胞FOXO1位于细胞质的占比差异具有统计学意义(P<0.01)。结论静息期精原前体细胞Rb1敲除使其出生后细胞周期恢复紊乱、凋亡发生,导致SSCs特化异常。

环状RNA circ-Olfm1通过FOXO3a调节阿尔茨海默病

目的探讨环状RNAs(circRNAs)在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)中的作用及其潜在机制。方法选取6月龄APP/PS1转基因(AD)小鼠和C57BL/6野生型(WT)小鼠,采用随机数字表法将小鼠分为5组(n=3):WT组(野生型小鼠)、WT+敲除circ-Olfm1组(敲除circ-Olfm1的野生型小鼠)、AD组(APP/PS1转基因小鼠)、AD+敲除circ-Olfm1组(敲除circ-Olfm1的APP/PS1转基因小鼠)和AD+敲除FOXO3a组(敲除FOXO3a的APP/PS1转基因小鼠)。采用皮层和海马立体定向注射慢病毒敲除circ-Olfm1和FOXO3a基因。①提取小鼠脑RNA,检测AD小鼠和WT小鼠中circRNA和mRNA的差异表达,并进行基因本体(gene ontology,GO)分析。②RT‐qPCR检测前10位上调和下调的circRNA、circ-Olfm1和miR-330-5p的表达。③制备慢病毒载体并立体定向注射到WT和AD小鼠的皮层或海马,以敲除circ-Olfm1基因,水迷宫实验评估敲除circ-Olfm1基因对小鼠认知功能的影响,免疫荧光检测Aβ斑块沉积。④双荧光素酶基因分析验证circ-Olfm1和miR-330-5p之间的相互作用。⑤Western blot检测AMPK和FOXO3a蛋白表达水平。⑥透射电镜检查AD小鼠海马组织的线粒体。⑦ELISA检测炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。结果AD小鼠和WT小鼠中共鉴定出52个差异表达的circRNA,其中28个上调,24个下调(fold change>1.5,P<0.05)。这些差异表达基因主要涉及信号转导、学习和记忆等功能。circ-Olfm1是差异最大circRNA,在神经元中高表达,并在AD小鼠的大脑皮层和海马中上调(fold change>1.5,P<0.05)。敲除circ-Olfm1基因减少了AD小鼠大脑皮层和海马的β-淀粉样斑块(amyloidβ,Aβ)数量(P<0.01)。细胞实验中:通过starBase数据库观察到circ-Olfm1和miR-330-5p之间存在互补序列。Western Blot结果表明:加入Aβ42后,AMPK和FOXO3a蛋白在神经元细胞中表达明显增加(P<0.01)。沉默circ-Olfm1后,AMPK和FOXO3a蛋白在神经元细胞+Aβ42中表达降低(P<0.01)。ELISA检测提示:敲除FOXO3a后,炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α均显著增高(P<0.01)。透射电镜检查提示:敲除FOXO3a后线粒体损伤显著加重(P<0.01)。结论circ-Olfm1在AD小鼠脑组织和神经元细胞+Aβ42中表达上调,其导致AD小鼠认知损害的机制可能是通过调节FOXO3a蛋白的表达。