ABO血型变异的分子基础研究

目的 对临床ABO血型变异标本进行ABO亚型、类孟买血型与基因型关联性研究,以探讨这2种血型产生的可能分子背景,为ABO血型的准确鉴定与预判提供精确的基因检测靶点和理论依据。方法 对2022年2—12月瑞金医院2.42万名血型鉴定患者,以及期间来自外院送检10例ABO疑难标本(疑似ABO亚型3例,疑似类孟买血型7例)进行血清学分析,对血清学鉴定为ABO亚型、类孟买血型的行DNA直接测序或克隆后测序分析ABO、FUT1、FUT2基因序列。结果 在共计2.42万血型鉴定患者中检出7例ABO亚型;外院送检的10例疑难标本检出2例ABO亚型、1例正常A型、7例类孟买血型。我们共鉴定出:1)9例ABO亚型,表型及其对应基因型分别为:1例A_(el)(AEL.02/O.01.02)、1例A_(el)B(AEL.05/B.01)、3例B_(3)(2例B3.03/O.01.01、1例B3.03/O.01.02)、1例B(A)(BA.02/O.01.01)、1例AB_(weak)(A1.02/BW.07)、1例B_(weak)(BW.31/O.01.02)、1例A_(2)B_(weak)(A2.05/BW.31);2)7例类孟买血型,表型及其对应基因型分别为:1例AB_(m)^(h)(FUT1^(*)01N.13/FUT1^(*)01N.13)、4例A_(m)^(h)(3例FUT1^(*)01N.06/FUT1^(*)01N.13、1例FUT1^(*)01N.13/FUT1^(*)01N.13)、2例B_(m)^(h)(FUT1^(*)01N.06/FUT1^(*)01N.06、FUT1^(*)01N.06/FUT1^(*)01N.13),7例类孟买的FUT2基因型均为FUT2^(*)01/FUT2^(*)01。结论 ABO血型变异标本需联合血清学与分子生物学方法进行鉴定,方能提高对血型变异标本的鉴定准确率,从而为临床安全输血、器官移植、胎母免疫性溶血病的预测与防治提供参考。

抗-E、抗-c、抗-M、抗-S多重抗体分析

目的对1例存在多重抗体的肾积水伴输尿管结石合并休克老年患者进行抗体特异性鉴定。方法微柱凝胶法进行红细胞不规则抗体筛查和抗体鉴定,酶法,抗体吸收法协助判断患者的抗体特异性;盐水试管法检测患者ABO血型鉴定、Rh血型鉴定、MNS血型。结果患者血型:O、CCDee、NNss,患者体内检测出抗-E、抗-c、抗-M、抗-S联合抗体。结论反复输血可能引起患者存在1种或者多种意外抗体,体内多种或高频率抗体的患者,可能引起鉴定困难和用血延迟。

新生儿ABO*A2.08亚型等位基因的鉴定及蛋白结构分析

目的:研究ABO*A2.08亚型的血清学特征和蛋白结构,探究其遗传学分子机制。方法:利用血清学方法对先证者及其家系成员进行ABO血型鉴定,应用聚合酶链反应-序列特异性方法进行ABO基因分型,并对ABO基因第6、7外显子直接测序分析,通过同源蛋白保守性分析、3D分子建模和蛋白稳定性预测探究A2.08亚型中基因突变对GTA蛋白结构稳定性的影响。结果:先证者血清学结果为Ax亚型,ABO基因分型明确先证者的基因型为ABO*A207/08;先证者的父亲基因测序结果证实ABO基因第7外显子存在c.539G>C特征性变异,导致多肽链p.Arg180Pro(R180P)替换。3D蛋白分子建模与分析提示R180P突变后蛋白结构中局部氨基酸的氢键数目发生改变,蛋白稳定性预测显示该突变对蛋白结构稳定性影响较大。结论:ABO基因第7外显子c.539G>C突变导致多肽链氨基酸替换,影响了GTA蛋白结构的稳定性,引起酶活性改变,产生A2.08表型,且该变异基因可稳定遗传。

广州地区RhD阴性献血者Del表型及基因型分析

目的研究广州地区RhD阴性献血者D放散型(Del)分布、表型及基因型以了解本地区DEL血型分子生物学背景。方法对2021年11月1日—2022年6月30日期间广州地区献血者采用盐水法初筛为RhD阴性血液进行间接抗人球蛋白试验(IAT)血清学确认、采用RhCE分型卡确定RhCE表型,对1146例确认RhD阴性所有C+(n=459)以及随机抽取部分C-标本(n=175)进行吸收放散(Del)筛查(共634例);提取Del阳性标本DNA进行高分辨熔解曲线分析法(HRM)实时荧光PCR检测RHD基因c.1227位点基因情况;对HRM检测RHD^(*)1227位点无突变标本采用限制性片段多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)扩增后产物作PstⅠ酶切,进行电泳分析RHD基因合子型;sanger法进行RHD基因进行外显子测序(exon 1-10),采用SeqMan软件分析基因突变情况;采用第3代单分子测序技术对可疑Del阳性标本进行RHD全基因分析。结果634例确认RhD阴性标本吸收放散试验结果显示Del表型占36.1%(229/634),占总RhD确认阴性的20%(229/1146);229例DEL的RhCE分型分别为Ccee 181例,CCee 40例,CcEe 7例,ccEe 1例,HRM结合RHD盒子型分析结果显示170例RHD基因为RHD^(*)1227A/01N.01、32例为RHD^(*)1227A/1227G,26例为RHD^(*)1227A/1227A、6例为RHD^(*)1227G/1227G(其RHD基因测序结果显示1例为弱D12型、4例为D-和1例RHD^(*)01EL.02)。结论广州地区献血者DEL个体基因型以RHD^(*)1227A/01N.01为主且其RhCE表型均为C+的特征;HRM可作为常规筛查“亚洲型”DEL血型基因的分子生物学方法。

2021—2022年广州地区献血人群ABO血型筛查结果分析

目的 了解广州地区无偿献血者ABO、RhD血型的分布情况,为保证临床用血安全和更好为献血者服务提供依据。方法 对2021年1月—2022年12月的无偿献血者进行常规ABO、RhD血型检测,统计分析ABO血型构成比,对ABO正反不一致血型、RhD初筛阴性的标本进行血型血清学确证,分析ABO亚型检出情况及漏检原因。结果 2021年1月—2022年12月共筛查献血者标本749 123份,剔除重复献血者后的标本513 291份,其中ABO血型分布为:O型208 126份(40.55%)、A型138 859份(27.05%)、B型130 987份(25.52%)、AB型35 319份(6.88%)。ABO血型初筛正反不一致506份,其中弱/无红细胞反应58份、额外的红细胞反应16份、弱/无血清反应215份、额外的血清反应217份;经血型血清学或分子生物学确认ABO亚型44份,其中A亚型13份、B亚型26份、AB亚型5份;B(A)3份;类孟买血型14份。重复献血者漏检率最高的血型是A_3/B_3类亚型(68.42%)。在513 291份标本中共检出意外抗体阳性128份;RhD血型初筛阴性共2 277份,其中RhD阴性确认2 188份[2 188/513 291(0.43%)],RhD变异型89份[89/513 291(0.02%)],合并检出意外抗体30份[30/2 188(1.37%)]。结论 广州地区献血人群ABO分布O>A>B>AB,RhD阴性人群占比为0.43%,略高于全国汉族人群0.3%~0.4%;ABO血型亚型以B亚型为主;A_3/B_3类亚型的检出率及在常规血型检验中漏检率最高。

郑州地区RhD变异型献血者分子生物学分析

目的研究郑州地区RhD变异型献血者血清学特征及基因突变机制。方法选择2023年1月—2023年12月送至本实验室的1619名RhD阴性献血者为研究对象,应用试管法和微柱凝胶间接抗球蛋白试验方法进行RhD阴性确认试验及RhCE表型检测。采用RHD基因扩增和Sanger测序检测RhD变异型标本基因型。结果RhD阴性确认试验共检出RhD变异型69例,比例为4.26%(69/1619)。RhCE表型分别为ccEe、Ccee、CcEe、CCee。包含17种基因型,15种D变异型表型。RHD^(*)weak partial 15等位基因最多(33例),频率为47.83%(33/69),主要表型为ccEe;其次是RHD^(*)DVI.3等位基因20例,频率为28.99%(20/69),主要表型为Ccee。RHD^(*)weak partial 15/RHD^(*)01EL.01杂合子3例,频率为4.35%(3/69),皆为CcEe表型。其他罕见基因型共13例,频率为18.84%(13/69)。抗筛阳性3例,比例为4.35%(3/69)。女性献血者2名,皆有孕产史,经抗体鉴定为抗-D;男性献血者1名,为抗-M。结论郑州地区RhD变异型献血者中RHD^(*)weak partial 15基因型最常见,其次为RHD^(*)DVI.3基因型。对保障安全供血,指导临床精准输血具有重要作用。

单核细胞单层试验在预测IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病中的应用

目的探讨单核细胞单层实验(monocyte monolayer assay,MMA)是否能够用于IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of fetus and newborn,HDFN)的预测。方法选取8例含有IgG抗-M的孕妇并采集血浆标本,其中有胎儿水肿等严重临床症状及无明显临床症状的各4例;8份血浆用二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)灭活,与M抗原阳性红细胞孵育致敏后,将致敏红细胞与单核细胞混合进行吞噬试验,同时设立阳性及阴性对照,并计算吞噬率;采用t检验对2组吞噬率进行比较。结果4例发生严重抗-M相关HDFN的孕妇的MMA吞噬率分别为15.37%、13.05%、9.17%和24.50%,均值为15.52%;检出IgG抗-M但未发生HDFN的孕妇,其MMA吞噬率分别为8.74%、11.07%、5.12%和6.23%,均值为7.79%,2组吞噬率无差异(P>0.05)。2组吞噬率分别与阴性对照比较均无差异(P>0.05),但均明显低于阳性对照(P<0.05)。结论IgG抗-M介导单核细胞吞噬的能力较低,提示抗-M导致胎儿水肿的机制可能并非红细胞被吞噬破坏而发生的溶血,因此体外单核细胞单层实验可能不适用于IgG抗-M相关HDFN的预测。对于检出IgG抗-M的孕妇,现仍需通过定期监测胎儿大脑中动脉血流,来判断胎儿宫内贫血情况。

罕见抗-Di^(b)致严重胎儿新生儿溶血病的实验室检测与相关研究

目的对1例高频抗体导致的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)进行检测、鉴定及配血。方法对患儿进行新生儿溶血试验,对母亲进行血清学意外抗体鉴定,并对母亲红细胞进行常见高频抗原鉴定;对检出抗体进行IgG分型检测,并用流式细胞术进行单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验,以检测抗体相关的吞噬率;对患儿母亲、父亲及舅舅进行相关红细胞血型基因测序;利用稀释的母亲血浆和抗人球卡法,在献血者中进行大规模相合血液的筛选。结果产妇鉴定为Di(b-)稀有血型,产生了抗-Di b(效价512)并导致了严重的HDFN;抗-Di b亚型分型为IgG1和IgG2型,单核细胞体外吞噬效率为88.83%(74.7/84.09);产妇亲属中没有相合献血者,后续从5520名献血者中筛选到2例Di(b-)相合血液,患儿接收输血治疗后康复出院。后续在51334名献血者中筛查到17名Di(b-)献血者,该数据表明Di(b-)在广州地区献血者中的分布频率约为三千分之一(0.033%,17/51334)。结论综合利用血型血清学及分子生物学方法诊断了抗-Di b所致的严重HDFN,建立了1种有效大规模筛查Di(b-)稀有血型的方法并找到相合血液,为建立Di(b-)稀有血型库奠定了基础。

肝肾移植术后并发过客淋巴细胞综合征的病例报告及诊疗分析

目的对本院3例ABO血型次侧不合肝肾移植后并发的过客淋巴细胞综合征(PLS)病例的临床特征、血清学特征、输血方案及治疗进行总结,为临床全面了解和认识该疾病,特别是早期识别及治疗提供指导。方法通过采集患者基本信息和移植后出现同型血交叉配血不合的时间,观察患者皮肤黄染情况,检测血红蛋白(Hb)及其他溶血指标、输血前后血型血清学等进行诊断分析;通过采集经免疫和输血治疗后的临床转归信息对PLS诊断及治疗效果进行分析。结果3例患者ABO血型次侧不合肝肾移植术后出现Hb下降及溶血表现、同型血交叉配血不相合,经血清学试验证实存在IgG抗-A、抗-B;经免疫抑制、血浆置换等对症治疗及改变输血策略后,输血有效,溶血好转,抗体逐渐消失。结论ABO血型次侧不合肝肾移植病例,需定期做ABO血型抗体和不规则抗体筛查及直接抗人球蛋白试验,以便能早期发现PLS;同型交叉配血不相合时应及时进行PLS相关的系列实验室检测,以便及时诊断及调整包括输血策略在内的治疗方案。

抗-M致胎儿新生儿溶血病实验室检测及预防策略分析

目的分析血清学检测结果在抗-M致胎儿新生儿溶血病(HDFN)诊断和治疗中的应用,探讨HDFN预防策略。方法对2017年1月—2023年12月本实验室确诊的12例抗-M引起的HDFN血清学检测结果进行回顾性分析,包括母亲和患儿的血型鉴定,血清总胆红素、血红蛋白、抗体效价检测,新生儿溶血3项实验。收集患儿和母亲的临床资料,包括妊娠史、输血史、产前抗体检测、宫内输血史、分娩孕周,并随访患儿预后。结果12例抗-M引起的HDFN中,患儿母亲均为RhD+NN表型,患儿均为RhD+MN表型,母子MN血型均不相容。在ABO血型系统中,母子ABO血型不相容占41.7%(5/12)。患儿母亲皆无输血史,在4℃检测效价中位数32,37℃效价中位数4。3例患儿母亲有多次宫内输血史,发生率为25%(3/12)。1例为首胎妊娠异常,占比8.3%(1/12),7例为异常妊娠流产,不良孕产史发生率58.3%(7/12)。6例患儿母亲早产,占比50%(6/12)。3例患儿母亲定期产检,并鉴定抗体特异性,占比25%(3/12)。12例患儿游离抗体在4℃检测效价中位数6,37℃效价中位数2。2例患儿抗-M在37℃检测无反应,阴性率16.7%(2/12)。患儿直抗阳性率8.3%(1/12),放散阳性率16.7%(2/12)。血红蛋白最低值中位数75 g/L,12例患儿均接受了输血治疗。总胆红素峰值中位数157.5μmol/L,均未达到换血阈值。患儿迟发性贫血率16.7%(2/12),患儿出生后死亡率8.3%(1/12),11例患儿预后无生长和神经发育迟缓情况。结论抗-M能引起严重的HDFN,也可发生于第1胎,抗体效价强度与疾病的严重程度不相关,容易引起迟发性贫血,应根据抗-M血清学特征和临床症状定期监测,及时干预治疗。

血清学检测和基因分型在ABO疑难血型鉴定中的性能评价

目的分析血清学检测和基因分型在ABO疑难血型鉴定中的应用。方法对106例ABO疑难血型实施血清学检测(吸收放散试验)等,同时对其实施基因分型检测(荧光定量PCR试验),以基因测序结果为金标准,评估血清学检测和基因分型所得结果与基因测序一致性,比较两种检查方式灵敏度、特异度。结果以基因测序为金标准,血清学检测所得结果一致性为中度,基因分型检测所得结果一致性很好。通过比较血清学检测和基因分型灵敏度、特异度可知,两种检查方式所得特异度、灵敏度差异有统计学意义,基因分型灵敏度、特异度更高(P<0.05)。结论基因分型检测和血清学检测有各自的优缺点,但总体上来说,基因分型检测具有更高的准确性和可靠性,更快速、高效。

ABO血型基因外显子1上新变异的鉴定

目的:应用血清学和分子生物学方法鉴定1例ABO正反定型不一致患者的血型,并探讨其遗传学特点。方法:采用试管法鉴定该患者的ABO表型,荧光PCR法测定患者及其父母的ABO血型基因型,并对ABO基因7个外显子进行直接测序分析。结果:本例患者血清学初步鉴定为Bel亚型;基因分型检测患者及其父亲的基因型为B/O1,其母亲的基因型为O1/O1;测序发现在患者及其父亲ABO基因外显子1上有新的c.16_17delins TGTTGCA杂合变异。结论:外显子1上新的变异导致该患者ABO血型出现Bel亚型,并具有遗传性。

基层医院对罕见意外抗体的鉴定思路与试验方法探讨

目的探讨基层医院输血科如何利用现有资源,采用常规血清学方法对罕见意外抗体进行鉴定提供思路。方法选择本院就诊的1名血型正反定型不一致、抗体初筛阳性、常规配血不合的消化道出血患者为研究对象,采用混合人源O细胞吸收法进行血型鉴定,使用常规10系谱细胞抗体鉴定、凝聚胺法抗体鉴定、2-巯基乙醇(2-ME)试验、盲配、家系调查等方法了解抗体特性。结果患者血清学试验结果:1)血型为B型、RhD阳性,直接抗人球蛋白试验呈阴性;2)抗体性质为IgM型;3)抗-s、抗-Fya、抗-k可能性小,复合抗体不能排除;4)患者血液标本与20名供者的血液标本交叉配血试验主侧不合,与同系3个姐妹的血液标本交叉配血试验主侧均相合。结论倾向推断患者血浆中含有高频抗原系列抗体,无法鉴定时,可经家系调查寻找到相合血源进行辐照、输注。

生理盐水洗涤DIC患者凝集红细胞用于血型鉴定的效果评价

目的探讨弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)患者凝集红细胞生理盐水洗涤后血型鉴定的效果。方法选择浙江省杭州市第三人民医院2019年7月—2022年7月由于自身红细胞凝集导致血型鉴定困难的24例DIC患者为研究对象,ABO血型以基因分型结果为标准,生理盐水洗涤凝集红细胞前后手工方法(试管法和微胶柱法)ABO血型鉴定结果与标准组比较。结果凝集红细胞洗涤前ABO血型2例正反定型符合,与标准结果比较,其差异具有统计学意义(P<0.05)。生理盐水洗涤后的红细胞均匀散开,24例ABO血型检测结果正反定型符合,其中A型8例,B型5例,O型9例,AB型2例。洗涤后血型结果与标准结果比较,其差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用生理盐水洗涤凝集红细胞的方法,血型鉴定效果良好,具有明显检测优势,为临床紧急用血提供了安全保障。

红细胞血型意外抗体筛查专家共识

红细胞血型意外抗体是指正常ABO血型中除抗-A、抗-B之外的血型抗体,其广泛存在于妊娠、输血、移植、注射免疫原性物质或患有自身免疫性疾病的患者中,可造成血型鉴定和交叉配血困难并严重影响输血安全及输血疗效。本共识旨在进一步规范抗体筛查细胞要求、操作规程及临床意义,为临床安全有效 输血提供保障。

ABO正反定型不符的白血病患者血型鉴定与临床分析

目的 对1例白血病患者ABO血型鉴定异常结果进行鉴定与回顾性分析,旨在为同类患者血型相容性检测提供参考。方法 采用血清学检测进行ABO血型鉴定,采用聚合酶链反应-序列特异性引物进行ABO血型基因分型;采用亚硫酸氢盐测序检测ABO启动子甲基化状态。结果 患者ABO血型正定型结果为O型,反定型结果为A型,正反定型结果不一致;试管法重复试验,4℃时可见A1c凝集;吸收放散试验结果显示红细胞表面存在A抗原,提示正定型结果为A型;不规则抗体筛查阴性,直接抗人球蛋白试验阴性;基因分型检测基因型为AO1,表型为A型;甲基化检测发现患者ABO基因启动子区甲基化率为66.7%,明显高于随机选取的5例正常对照组标本平均甲基化率。结论 白血病患者ABO抗原减弱可能导致血型误判,疾病状态下患者ABO基因启动子甲基化程度增高可能与其ABO抗原减弱密切相关,须结合分子生物学基因分型和血型基因甲基化检测方法进一步判断患者血型鉴定异常的原因,保障临床用血安全。

婴儿期输血前红细胞血型血清学检测中国专家共识

根据国家卫生健康委员会(原卫生部)颁布《临床输血技术规范》[1]要求,临床输血前必须进行血型血清学检测,至少包括但不限于:ABO血型(正反定型)和RhD鉴定、红细胞血型意外抗体筛查(简称:意外抗体筛查)与交叉配血。

同种抗-C、e伴类同种抗-e、Jk b自身抗体的鉴定及输血治疗

目的应用吸收放散和效价积分法对1例抗-C、e同种抗体合并抗-e、Jk b类同种自身抗体进行鉴别诊断。方法采用试管法对ABO、Rh和Kidd血型抗原进行鉴定;盐水、凝聚胺、微柱凝胶3种方法联用2套谱细胞进行抗体筛查及抗体特异性鉴定;多重吸收放散试验和效价积分原则对抗体进一步确认;多重PCR技术对RHCE基因、JK基因进行测序。结果通过血清学分析,该患者血型为A型、Rh分型ccDEE,直抗阳性。结合不同的Rh和Jk表型细胞吸收放散试验以及效价积分原则得出患者血清中含有抗-C、e同种抗体以及抗-e、Jk b类同种自身抗体,红细胞上有抗-e、Jk b类同种自身抗体。基因测序分析RHCE基因第5外显子676位出现G>C,其余外显子没有发生突变,推断Rh分型ccEE型;JK基因中第9外显子838 G/A杂合,Jk血型表型Jk(a+b+),选择交叉配血相合的A型ccDEE、Jk(a+b-)红细胞给患者输注,输血效果良好。结论应用吸收放散试验和效价积分法对患者血清进行抗体鉴定,以及血清学结合分子生物学对患者红细胞表型鉴定,可综合分析及区分出抗体的类型,为患者精准输血提供方案。

东乡族人群Duffy、Kidd、Diego血型系统等位基因频率多态性研究

目的了解甘肃省东乡族人群Duffy、Kidd、Diego血型系统等位基因频率多态性分布。方法2017年1—12月随机抽取甘肃省东乡族无血缘关系献血者100名,采用荧光PCR法检测献血者红细胞Duffy、Kidd、Diego血型系统等位基因。结果东乡族人群Duffy、Kidd、Diego血型系统等位基因频率为:Fy^(*)01为0.835、Fy^(*)02为0.165;Jk^(*)01为0.570、Jk^(*)02为0.430;DI^(*)01为0.020、DI^(*)02为0.980。未发现Fy(a-b-)、Jk(a-b-)、Di(a+b-)稀有表型。Duffy、Kidd、Diego血型系统等位基因对偶抗原Fya/Fy^(b)、Jk^(a)/Jk^(b)、Di^(a)/Di^(b)的不配合率分别为:23.76%、37.01%、3.84%。结论甘肃省东乡族人群Duffy、Kidd、Diego血型系统等位基因呈多态性分布,具有独特的民族分布特征。

AB亚型漏检后A型血浆置换引起可疑溶血分析

目的对1例ABw亚型患者进行A型血浆置换后血型血清学变化以及是否发生溶血反应进行回顾性调查。方法使用微柱凝胶技术、微柱玻璃珠技术、盐水试管法、吸收放散等血型血清学方法及分子生物学方式进行ABO血型鉴定和基因分型,对患者血浆置换前后实验室检查结果进行分析。结果该患者于行2000 mL A型血浆置换后转入本院,d 2检测正反定型相符;d 3检测反定B细胞凝集强度为±~1+,正反定型不符。经试管法、人源抗-B吸收放散试验确认存在B抗原,分子生物学鉴定为ABw03型。患者用A型血浆进行血浆置换后,血红蛋白、血小板计数均一过性下降,肌酐一过性轻度上升,谷丙转氨酶、谷草转氨酶持续下降,总胆红素和间接胆红素一过性下降后上升,提示存在轻微的溶血性输血反应。结论ABO亚型患者含弱A或B抗原,输注大量血浆可能引起溶血性输血反应。应严格按照ABO血型正反定型标准判断血型结果,对弱凝集采取额外实验室检查并结合分子生物学技术进行正确的判断和处理,可以减少ABO亚型的漏检,减少输血反应的发生。