矮牵牛花瓣衰老和逆境胁迫响应相关NAC基因的鉴定与分析

【目的】NAC(NAM, ATAF and CUC)参与植物生长发育和多种逆境胁迫响应过程的调控。本文旨在鉴定和研究对矮牵牛生长发育和逆境胁迫响应的关键NAC成员,为优质抗逆矮牵牛育种提供基因资源。【方法】以腋生矮牵牛(Petunia axillaris)基因组为参考基因组,利用矮牵牛花器官衰老过程、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)侵染、低磷、低温、NaCl、铜离子和干旱胁迫处理后的转录组数据,分析矮牵牛NAC基因(PaNACs)差异表达情况,并对差异表达PaNACs的启动子顺式作用元件及转录因子结合位点进行分析。利用实时荧光定量PCR验证了部分差异表达PaNACs在矮牵牛花衰老过程中的表达情况,并预测了差异表达PaNACs编码蛋白的潜在靶基因。【结果】鉴定的131个PaNAC基因中,59个(45.04%)被鉴定为花器官衰老和逆境胁迫响应过程中的差异表达基因。PaNAC72、 PaNAC22、 PaNAC29、 PaNAC40、 PaNAC2、 PaNAC90、 PaNAC83、 PaNAC56、 PaNAC36和PaNAC35在至少3个生物学过程响应中差异表达显著,其中拟南芥衰老关键基因AtNAP的直系同源基因PaNAC29在花器官衰老过程和低温、低磷、铜离子胁迫逆境处理中显著上调表达;PaNAC72在除受铜离子胁迫外的所有6种处理中表达差异显著;PaNAC22在花器官衰老过程和低温和低磷胁迫中上调表达,在铜离子和干旱逆境下调表达。启动子分析结果显示这10个PaNAC启动子区域存在多种逆境胁迫响应相关元件,且大量响应衰老和逆境胁迫的差异表达基因的启动子区域存在NAC的结合位点。【结论】PaNACs广泛参与矮牵牛生长发育及逆境胁迫响应,其中PaNAC29可能是花衰老关键的正调控因子,PaNAC72广泛响应多种逆境胁迫。

矮牵牛花朵大小及相关性状遗传分析

为了探究矮牵牛花朵大小的遗传规律,以大花型和小花型矮牵牛高代自交系为亲本构建四世代遗传群体(P_1、P_2、F_1、F_2),对花朵大小遗传特征进行主基因+多基因混合遗传模型分析,并将F_1植株与中花型矮牵牛W115株系进行杂交,验证遗传规律。同时以F_2群体为材料,对花径、萼片长、叶片长等23个表型性状进行测定,并研究其相关性。结果表明,矮牵牛大花对小花性状符合2MG-A模型,即由2对加性主基因控制,主基因遗传率为95.38%;大、小花杂交F_1与中花W115进一步杂交,后代出现大花与中花性状分离(1∶1),且中花植株的叶片和苞片叶绿素含量显著高于大花植株(P<0.01)。大花×小花F_2群体的表型性状变异丰富,变异系数在7.67%~59.93%,平均22.38%。相关性分析结果表明,花部性状、叶部性状以及两者之间均存在一定的相关性,其中花径与其他器官大小均呈显著正相关,与部分植株性状呈显著负相关。

矮牵牛花粉生命力测定方法的研究

以矮牵牛的新鲜花粉为试材,利用单因子试验比较了液体培养基中蔗糖及硼、钙、镁、钾对矮牵牛花粉萌发的影响,在此基础上进行了L25(56)的正交试验,比较了H3BO3、CaCl2及其交互作用对矮牵牛花粉萌发的影响;通过对醋酸洋红染色法、次甲基兰染色法、TTC染色法和过氧化物酶沉淀法四种方法的比较,寻找快速测定矮牵牛花粉生命力的方法。试验结果表明:H3BO3、CaCl2、H3BO3×CaCl2的交互作用对矮牵牛花粉萌发有显著影响。适宜的花粉培养液为:蔗糖150g/L+H3BO320mg/L+CaCl210mg/L;过氧化物酶沉淀法是快速测定矮牵牛花粉生命力的最适染色法。

两种光周期下矮牵牛‘幻想粉红’生长发育特性的研究

将矮牵牛‘幻想粉红’分别培养在长日照和短日照条件下,观测其始花期及株高、株幅、分枝数和开花数的变化;将短日照下培养的‘幻想粉红’分别于2、4、6、8、10、12、14、16片真叶时移入长日照下进行培养,观测从长日照处理至第1朵花开放的时间。结果分析表明:长日照下,‘幻想粉红’株型松散,短日照下生长紧凑;‘幻想粉红’为量性长日照植物,短日照下要达到较大的营养生长量才能开花;‘幻想粉红’的幼龄期约在8片真叶期结束。初步建议在8叶期之前采用短日照处理‘幻想粉红’,以得到紧凑的株型,而在8叶期以后给予长日照,以促进开花。

矮牵牛花期一些生理指标的变化

选择了 3种颜色的矮牵牛 (PetuniahybridaVilm) :粉红色、杂色和红色 ,将其开花过程分为 4个时期 :未出现花芽、花芽期、花蕾期和开花期 ,测定各时期MDA、可溶性糖、激素水平和多胺含量等指标的变化。结果表明 ,从无花芽期到开花期MDA含量有所升高 ;可溶性糖含量呈现降低的趋势。在粉红色的矮牵牛叶片中 ,IAA含量在开花期升高 ;GA含量在无花芽期和花芽期时较高 ;而ZRs则在花蕾期较低 ,在开花期时含量上升。 3种多胺含量的变化不同 ,腐胺在整个花期略有上升 。

厚藤耐盐生理指标研究

用NaC l溶液作为渗透胁迫剂的Hongland溶液模拟盐胁迫环境,测定厚藤盐胁迫下相关生理指标。研究表明厚藤是一种耐高盐植物,盐胁迫下呈现出的抗盐生理机制主要有:随着盐浓度的升高,可溶性糖、游离脯氨酸、可溶性蛋白以及Na+/K+升高,膜透性增加;随着胁迫时间的延长,游离脯氨酸含量下降,Na+的吸收促进了K+离子的吸收,Na+/K+增大缓慢,电导率下降。

矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)组织培养技术研究

实验以矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)的花瓣为培养材料,在MS培养基中附加不同浓度的细胞分裂素(6-BA)和生长素(NAA),进行矮牵牛快速繁殖技术研究。结果表明,MS+6-BA(2.0 mg.L-1)+NAA(0.1mg.L-1)培养基愈伤组织发生的较早,数量多,培养基为最佳分化培养基,不定芽发生早,粗壮,数量多,玻璃化程度很小;诱导不定根时,1/2 MS+NAA(0.5 mg.L-1)培养基诱导生根的时间较早,不定根发生率达100%。

GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的影响

利用农杆菌介导法将GhMADS3基因转入矮牵牛。对14株转基因植株进行分析鉴定,GUS染色表明外源基因在转基因植株中表达,PCR检测显示GhMADS3整合到矮牵牛的基因组中,RT-PCR分析表明GhMADS3在转基因植株中表达。转基因植株花器官普遍较野生型小,花萼膨大、顶尖向内弯翘,花冠深裂且边缘伴有不规则褶皱,柱头裸露在外,花器官颜色较野生型变淡甚至完全白化。测定花瓣、花萼中花色素苷和花萼中叶绿素含量,结果表明转基因植株均较对照偏低。说明GhMADS3的导入使得矮牵牛花形、花色发生改变。

干旱胁迫下烯效唑对矮牵牛幼苗水分状况和光合特性的影响

采用盆栽控水的方法,研究了土壤含水量为40%～45%田间持水量和复水条件下,施用不同浓度烯效唑对矮牵牛幼苗水分状况和光合特性的影响。结果表明:在正常条件下,施加烯效唑均不同程度的提高了矮牵牛幼苗的水分状况和光合能力。在干旱条件下,随着干旱时间的延长,各处理矮牵牛叶水势、叶片相对含水量、净光合速率、蒸腾速率、气孔导度均显著降低,叶绿素含量和水分利用效率表现出先升高后降低的趋势,而胞间CO2浓度表现出先降低后升高的趋势,施加烯效唑可以延缓和降低干旱胁迫对矮牵牛幼苗水分含量及光合作用的抑制作用;复水处理后,施加烯效唑的各处理的矮牵牛水分含量及光合作用特性均显著高于对照,综合各指标得出质量浓度为30 mg/L的效果最好。

不同色彩矮牵牛DFR基因的克隆与生物信息学分析

二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)是花色素合成途径中的一个关键基因。以新疆种植的白、红和蓝色矮牵牛为试验材料,通过同源克隆的方法从花中克隆到3个完整的DFR基因的全长编码序列(CDS),与已知的矮牵牛DFR基因(GenBank登录号:X15537)序列的相似性分别为97.79%、96.59%和97.99%,分别命名为PhDFR1,PhDFR2和PhDFR3;3个基因编码380个氨基酸,同已知矮牵牛DFR基因编码的蛋白(GenBank登录号:CAA33544)的同源性分别是95.53%、94.21%和95.79%;生物信息学分析表明,3个蛋白均具有NADB-Rossmann家族中高度保守的NADPH结合位点、底物特异性结合位点。3个矮牵牛品种DFR都不具有信号肽,为亲水蛋白,定位于细胞质的可能性最高;均具有两个跨膜结构,α-螺旋和β-折叠是3个DFR的主要二级结构元件,并且形成了β-α-β-α-β的Rossmann折叠,整本上呈对称分布。利用同源建模分析3个DFR蛋白与已知葡萄的DFR晶体结构有很高的相似性。系统进化树分析表明,PhDFR1、PhDFR2、PhDFR3与已知矮牵牛DFR蛋白亲缘关系最近。

裂叶牵牛花色变异株后代的表型分析

以花色变异的裂叶牵牛的15株自交后代为材料,对其植物学性状、花冠性状、花粉育性、花粉纹饰及结实性进行了表型分析。结果表明:15株后代植株生长较慢,藤蔓右旋、节间变短、攀缘能力差;每叶腋间着生1个花蕾,偶有2个同时着生。15株观察后代都开有蓝色和蓝白相间的花冠,在400多朵蓝白相间的牵牛花中,没有完全相同的花纹。在蓝白相间的花朵中有部分雄蕊出现瓣化现象,花粉观察表明雄蕊瓣化的花粉育性严重下降。蒴果和种子调查表明,雌蕊的育性并未降低,但电镜扫描观察发现,两者的表面性状(如纹饰)无差异,这种现象有待进一步研究。

遮荫对大花山牵牛和桂叶老鸦嘴生长及叶片组织结构的影响

遮荫后大花山牵牛 [Thunbergiagrandiflora (Rottl.etWilld .)Roxb .]和桂叶老鸦嘴 (T .laurifoliaLindl.)植株增高、节间增长、叶绿素含量增加、叶绿素a/叶绿素b降低、叶片及栅栏组织和海绵组织厚度降低 ,叶片组织结构紧密度 (CTR)降低、叶片组织结构疏松度 (SR)增加 .

烯效唑(S_(3307))对矮牵牛幼苗耐盐性的调节效应

为明确烯效唑提高矮牵牛植株抗盐性的生理机制,研究了烯效唑(30mg.L-1)对200mmol.L-1盐胁迫下矮牵牛幼苗生长状况及可溶性糖、Pro、可溶性蛋白和MDA含量的影响。试验结果表明:30mg.L-1烯效唑处理可以显著降低矮牵牛的盐害指数,增加植株的冠幅和鲜重;随着盐胁迫时间的延长,经烯效唑处理的植株叶片中可溶性糖、Pro及可溶性蛋白含量增加,分别比未经烯效唑处理增加24.6%、23.9%和46.04%,提高了植株在盐胁迫下的渗透调节能力;烯效唑处理可以缓解盐胁迫下叶片膜脂过氧化作用,减少MDA在叶片内部的积累,其降幅可达40.32%。因此烯效唑可以增加矮牵牛的抗盐性。

‘幻想’矮牵牛幼龄期和限界性诱导光周期的研究

采用迁光的方法测定‘幻想’矮牵牛的幼龄期和限界性诱导光周期。结果分析表明:‘幻想’矮牵牛的幼龄期约在6片真叶期结束,其限界性诱导光周期为3周。与连续诱导光周期相比,限界性诱导光周期能明显抑制‘幻想’矮牵牛株高的生长,对株幅和分枝数无明显影响。建议在‘幻想’矮牵牛8叶期时给予长日照处理以促进开花;3周以后再给予短日照处理以节约能源,同时可以控制株高。

矮牵牛同源多倍体诱导及其初期表型差异分析

为快速获得并鉴定矮牵牛多倍体,采用5%NaClO消毒灭菌后,使用不同质量分数的秋水仙素处理矮牵牛野生品种(P.axillaris)种子,后转入MS培养基中萌发成苗,并使用流式细胞仪进行倍性鉴定。通过比较不同质量分数秋水仙素对多倍体诱导率的影响,确定最佳诱导方法。通过不同倍性矮牵牛初期表型差异的分析、气孔和叶绿素含量的测定,统计不同倍性矮牵牛的形态指标差异。结果表明,获得了纯合率较高的矮牵牛四倍体和八倍体。在保证存活率的同时,0.10%秋水仙素处理24 h后获得最高比例的4x(47.37%)和8x(21.05%)变异植株;适当延长处理时间(36 h)可增加8x倍性的诱导材料比例(33.33%)。不同倍性矮牵牛植株的形态、气孔和保卫细胞等方面存在以下规律:4x较2x变异植株的第1~2片真叶变圆,>第3片真叶后叶片形态相似;8x较4x和2x变异植株形态差异显著,表现为节间短、叶柄短、叶片肥厚多毛、叶色深绿和生长缓慢等特征;不同倍性矮牵牛的气孔和保卫细胞长度随着倍性的增加而近倍数增加,2x和4x气孔组织近圆形,但8x气孔和保卫细胞的宽度未按倍数增加而呈椭圆形。

矮牵牛花色CHS-A基因启动子(Pchsa)的克隆及序列分析

根据国外报道,矮牵牛花色相关基因CHS-A的启动子Pchsa具有花期特异性启动子的活性,人工合成2个特异性引物并从矮牵牛基因组中经PCR分离出长约500 bp的DNA片段,经纯化后测序得到499 bp的目的片段。在NCBI中通过BLAST程序与序列号为S52984的PchsA比较,其同源性为95.73%。应用DNAMAN软件进行序列分析,结果表明该片段除含有启动子的保守序列TATA-box、CAAT-box、GC-box、G-box外,还含有花期特异表达的启动序列TACPyAT-box。这为该序列在花卉改良中的进一步运用奠定了基础,同时也证明不同品种间的PchsA存在差异。

有机栽培基质在矮牵牛育苗及栽培中的应用研究

以河南农业大学研制的基质为原料,成熟的草炭配方为对照,梦幻系列矮牵牛为供试品种,通过与不同辅料配比,对不同的有机发酵基质进行筛选。结果表明:在所用基质中,B基质的综合性状优于其他基质,特别是以B基质为主的处理T8,可以代替草炭的成熟基质配比。B基质的发酵配方比为:玉米秸秆粉碎料100kg+花生壳粉碎料65kg+烘干鸡粪20kg+中温发酵菌0.3%+水220kg;处理T8的配比为,B基质∶过磷酸钙∶蛭石=21∶1∶2。

污泥堆肥对矮牵牛生长发育的影响

利用南昌市青山湖污水处理有限公司的脱水生污泥与木屑、煤渣按不同体积比混合堆沤而成的6种污泥堆肥分别与珍珠岩按体积比3∶1混合作为矮牵牛的栽培基质,研究污泥堆肥对矮牵牛生长发育的影响,以筛选出栽培矮牵牛的最佳污泥堆肥物料配比。结果表明,在不施肥的情况下,采用污泥堆肥作基质与园土、泥炭作基质相比较,矮牵牛植株的叶片数、一级分枝数、全株鲜质量、全株干质量、冠幅以及花枝数、花朵数等均明显增加,说明污泥堆肥含有丰富的营养元素。并且以处理Ⅰ:3份污泥堆肥1(V(污泥)∶V(木屑)∶V(煤渣)=3∶1∶1)+1份珍珠岩,处理Ⅴ:3份污泥堆肥5(V(污泥)∶V(木屑)=3∶2)+1份珍珠岩,矮牵牛的营养生长和开花性状最好,是矮牵牛栽培的最佳污泥堆肥基质配方。

矮牵牛无土育苗与施肥的研究

采用三因素二次通用旋转组合回归设计,定量研究了无土育苗条件下矮牵牛苗期需肥规律,建立了肥料效应函数模型,并提出最佳经济施肥方案。

温度和赤霉素对圆叶牵牛种子萌发的影响

研究了赤霉素(GA3)和发芽温度对圆叶牵牛种子萌发的影响。结果表明:28℃较高温度处理圆叶牵牛种子,发芽指数和发芽率高于23℃较低温度处理,但未达到显著水平。200mg/L GA3浸种可显著提高圆叶牵牛种子的发芽率和发芽指数,发芽起始时间和终止时间也有所提前。