鸭疫里默氏杆菌Ⅸ型分泌系统分泌蛋白AS87_RS03090的原核表达及其突变株构建

研究发现细菌Ⅸ型分泌系统(T9SS)效应分子的生物学功能具有多样性,它们参与细菌自身的生命活动或与细菌的致病性密切相关。在前期研究中我们发现鸭疫里默氏杆菌T9SS的效应分子大多具有酶活性,可能参与其生命活动或与致病性相关。为探索鸭疫里默氏杆菌T9SS分泌蛋白AS87_RS03090的功能及其与细菌毒力的关系,本研究根据鸭疫里默氏杆菌AS87_RS03090基因序列设计了特异性引物,并在其上、下游引物中分别添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位点,将其克隆到pCold TF载体上构建原核表达载体,诱导表达和纯化出鸭疫里默氏杆菌AS87_RS03090重组蛋白(rAS87_RS03090);本研究还利用自然转化的方式成功构建了AS87_RS03090基因突变株Yb2Δ03090。研究结果将有助于进一步鉴定鸭疫里默氏杆菌T9SS在其致病过程中发挥的作用。

新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定

2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理（DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA）对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示：病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属（Flavi-virus）坦布苏病毒（Tembusu virus）基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010（简称JS804）。研究结果表明：此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。

鸭疫里默氏杆菌AS87_05150基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为探究鸭疫里默氏杆菌(RA)IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87_05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建,缺失株的表型为16S r RNA^(+)AS87_05150 ORF^(-),回补株的表型为16S r RNA^(+)AS87_05150 ORF^(+)。采用荧光定量PCR(qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87_05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD_(600nm)值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将10^(7)cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示,cYb2Δ5150株中AS87_05150 m RNA相对转录水平比Yb2株高约19倍(P<0.0001),Yb2Δ5150株未扩增到AS87_05150基因;生长曲线结果显示,Yb2Δ5150与Yb2株的生长曲线基本一致,但cYb2Δ5150生长速度与Yb2Δ5150株相比极显著下降(P<0.01);BF测定结果显示,Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株BF的形成能力与Yb2株相比均极显著降低(P<0.0001);黏附和侵袭力结果显示,这3株菌对Vero细胞的黏附和侵袭力均无显著差异。将3株菌分别以10^(8)cfu/只~10^(4)cfu/只、10^(10)cfu/只~10^(6)cfu/只和10^(9)cfu/只~10^(5)cfu/只的剂量经肌肉注射接种雏鸭,感染后观察雏鸭的发病情况,并采用Reed-Muench法计算3株菌对雏鸭的半数致死量(LD_(50));将3株菌均以10^(7)cfu/只经肌肉注射感染雏鸭,24 h后剖杀,无菌采集各组鸭血液、肝脏和脑组织,作相应处理后涂板采用平板计数法测定载菌量。根据各组鸭的死亡情况,计算Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株的LD_(50)分别为6.85×10^(5)cfu、8.75×10^(7)cfu和4.681×10^(8)cfu,即缺失株LD_(50)比野生株高约127倍,但回补株的LD_(50)比缺失株高约5倍。载菌量测定结果显示,Yb2Δ5150株和cYb2Δ5150株感染鸭血液、肝脏、脑组织中的细菌载量比Yb2株感染鸭的载菌量均极显著降低(P<0.001),但前两者之间上述指标均无显著差异。本实验结果表明AS87_05150与RA Yb2株的BF形成和致病性相关,但回补株对雏鸭的毒力和致病性均未回复到野生株的水平。本研究为进一步解析RA AS87_05150的功能及分子致病机制等奠定了基础。

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术克隆了猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2蛋白基因,测序结果表明:序列长度为270bp,包含258bp的编码区,编码85个氨基酸,与GenBank中西班牙分离株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为99%;将该基因成熟肽部分亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,进行SDS-PAGE初步分析,在34ku位置有1条蛋白条带,与预期结果一致。通过GST亲和纯化获得了较高纯度的重组融合蛋白,Western blot结果表明,纯化后的重组融合蛋白可与兔抗全囊囊尾蚴血清发生特异性反应。排泄分泌抗原Ts8B2的成功表达、纯化为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。

鹅黄病毒JS804株的生物学特性

2010年4月以来,江苏、浙江、福建、安徽、山东、河南和河北等省的鸭、鹅发生了一种具有脑炎样神经症状的传染病。发病的种（蛋）鸭、种鹅产蛋量大幅下降甚至绝产,且其死亡率为2%～15%,而肉鸭、肉鹅死亡率为10%～55%,给鸭鹅养殖业造成了重大的经济损失。通过流行病学调查。

CS87与添加剂对海狸鼠生长及有关激素水平的影响

在幼龄 (3～ 4 5月龄 )海狸鼠基础日粮中添加微量元素、维生素添加剂及CS87,研究其对幼龄海狸鼠生长及有关激素的影响。结果表明 ,微量元素、维生素添加剂及CS87对海狸鼠日增重均有显著影响 ,试验组海狸鼠生长激素和胰岛素样生长因子 Ⅰ水平均有显著提高 。

日粮中相继添加CS87、F89和CIM对山羊瘤胃代谢的影响

选取 5头装有永久性瘤胃瘘管的去势公山羊 ,以青干花生秧 +精料为基础日粮。实验采取前后自身对照的方法。第一阶段为对照期 ;第二阶段基础日粮内添加 15mg/kg·BW·d的CS87;第三阶段精料内添加 8mg/kg的F89。第四阶段精料内添加 0 .1mg/kg·BW的CIM。与第一阶段相比 ,瘤胃液中TVFA水平在第二、第三、第四阶段分别提高 17.4 7% (P <0 .0 5 )、- 12 .82 %和 3.33% ;A/P分别提高 4 .0 9%、7.73%和 0 .4 5 % ;NH3 -N含量分别提高 13.98%(P <0 .0 5 )、5 .38%和 - 9.6 8% ;AAN含量分别提高 1.2 8%、- 32 .6 9% (P <0 .0 5 )、8.33%。MCP在整个过程中没有显著变化。血液中NH3 -N在第二、第三、第四阶段分别升高 - 19.70 % (P <0 .0 5 )、6 7.4 2 % (P <0 .0 1)、- 9.85 % ;AAN分别提高 0 .4 0 %、37.6 5 % (P <0 .0 1)、8.37% ;SUN分别下降 3.4 4 %、6 .0 5 %、15 .4 8%。阶段性相继饲喂CS87、F89和CIM在一定程度上提高瘤胃发酵和氮代谢 。

拮抗产气荚膜梭菌S87的功能性芽孢杆菌的筛选与鉴定

为了筛选拮抗产气荚膜梭菌S87的功能性芽孢杆菌,采集健康鸡的新鲜鸡粪进行80℃水浴处理和琼脂打孔扩散法等方法进行筛选,选取抑菌圈直径最大的菌株进行斜面保藏,送至中国科学院微生物研究所进行鉴定。结果表明:筛选出一株拮抗产气荚膜梭菌S87的芽孢杆菌B-20-81,经过鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,其抑菌圈直径可达22.4mm,可为无抗防治家禽坏死性肠炎提供理论依据。

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。 方法 免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET 2 8c(+ ) ,异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清 ,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。 结果 经原核表达的Ts88重组蛋白 ,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应 ,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。 结论 成功制备Ts88基因的重组蛋白 。

香猪SNP位点rs80894395的多态性及其与体尺指标之间的关联研究

为了探究影响香猪生长发育的功能基因,本试验利用Illumina Porcine SNP60K芯片筛选出N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 2,GALNT2)基因内含子10中一个与腹围呈弱相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs80894395。在此基础上应用等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)技术检测520头雌性香猪群体中该位点的基因型,并与43头大白猪、36头柯乐猪相比较。结果表明,从3个猪群体中检测到rs80894395位点的CC、CT和TT 3种基因型;其中香猪群体以CT为优势基因型,且基因型与香猪的体重、体长和腹围呈弱的正相关;大白猪群体以CC基因型为主,T等位基因频率较香猪极显著减少(P<0.01);柯乐猪群体中CC与CT基因型频率相等,与香猪和大白猪的基因频率间的差异不显著(P>0.05)。生物信息学分析表明,rs80894395位点可能影响GALNT2基因的剪接过程。rs80894395与香猪的生长发育可能有一定的联系。

抗菌肽S807提高肉鸡生产性能的研究

为观察抗菌肽S807(强生肽B)的功效,我们进行了肉仔鸡的饲养效果试验。在不同时间段,分50～300 mg/kg等5个剂量,分别添加到颗粒料和粉料给10-35日龄肉仔鸡饲喂7天以上。结果表明,S807可预防肉仔鸡腹水症,肉鸡的死淘率从16.5%下降至7.88%;每天添加饲喂可使肉鸡平均增重11.0～16.3g,生产性能增加18.6%～22.1%。试验证实抗菌肽可以显著地提高雏鸡成活率,促进肉仔鸡生长。