母猪繁殖力基因遗传育种研究进展

我国是世界上最大的生猪生产国和猪肉消费国,但仍存在着母系猪繁殖力普遍较低的重要问题,选育具有高繁殖性状的母系猪已成为当前研究的焦点和热点。目前,已明确多个影响母猪产仔数的已知基因,包括雌激素受体(estrogen receptors,ESR)基因、泌乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因、视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4,RBP4)基因、瘦素(leptin,LEP)基因、备解素(complement factor b,BF)基因、胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein,IGFBP)基因、连环蛋白阿尔法样蛋白1(catenin alpha-like protein 1,CTNNAL1)、无翼型MMTV结合位点家族10B(wingless-type mmtv integration site family member 10B,WNT 10B)基因、转录因子12(transcription factor 12,TCF12)基因、无精症样删除基因家族(deleted in azoospermia-like,DAZL)、无名指蛋白4(ring finger protein 4,RNF4)基因以及骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)家族等基因。这些基因通过复杂的相互作用网络影响母猪的繁殖力性状表现,但少数几个基因的位点效应对母猪的繁殖力表型影响较为有限,因此在母猪繁殖性能方面的育种遗传进展相对较小。全基因组关联分析(genome-wide association studies,GWAS)技术基于全基因组策略,利用覆盖全基因组的遗传标记信息,分析整个基因组中的全部遗传变异多态性作为分子遗传标记,并与表型和系谱信息进行对照和统计分析,从而加速了重要单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点、数量性状位点(quantitative trait locus,QTLs)和候选基因的发现过程。全基因组选育(genomic selection,GS)利用系谱信息、表型数据以及全基因组的SNP分型信息,为母猪繁殖性能等低遗传力性状的育种工作提供了更快速、准确的个体全基因组估计育种值(genomic estimated breeding value,GEBV),从而显著加快了育种遗传进展。

浅谈种猪人工授精技术

种猪人工授精技术是种猪培育和商品猪生产中最科学有效的方法之一。它是在自然繁殖的基础上发展起来的一种实用的新技术。自推广应用以来,对畜牧业生产的发展起到了巨大的推动作用。主要从种猪挑选、采精技术、精液品质检查等方面进行探讨,为养殖场种猪合理利用、人工授精技术的推广应用提供参考。

母猪深部输精技术探索与推广研究

人工授精技术广泛应用于各大养殖场,传统人工授精技术十分容易出现精液倒流等现象,致使配种受胎率低下。伴随着人工授精技术的进步发展,母猪深部输精技术得到了广泛的应用,有效弥补了常规授精技术的诸多弊端,显著提升了母猪的受精率和生产性能。结合实验数据分析,总结母猪深部输精技术的应用效果,并对其应用优势和注意事项展开了详细的论述。

基于多组学与网络药理学探究淫羊藿对后备母猪发情的作用

旨在揭示淫羊藿对后备母猪发情的作用及其机理。本试验选择210~220日龄,体重(99.547±1.987)kg,发育成熟且符合配种条件的后备待配二元母猪32头,随机分为对照组和试验组,每组16头母猪,每个重复1头母猪。对照组饲喂基础日粮,试验组在饲喂基础日粮的基础上补充淫羊藿粗提物50 mg·d^(-1)。试验饲喂28 d。结果表明,试验组母猪发情提前,血清FSH、LH和E_2显著增加(P<0.05)。卵巢转录组结果表明,检测出477个上调差异mRNAs,754个下调差异mRNAs。GO富集分析发现,差异的mRNA主要富集在运输囊泡、脂肪细胞分化、节律行为、发情周期等过程;KEGG富集分析发现,差异的mRNA主要富集在紧密连接、碳水化合物代谢、刺猬信号通路、GnRH分泌和PI3K-AKT信号通路等信号通路。卵巢代谢组结果表明共有1616个代谢物上调,1254个代谢物下调。KEGG富集分析表明,差异代谢物主要富集在α-亚麻酸代谢、ATP转运蛋白、亚油酸代谢、β-丙氨酸代谢、氨基苯甲酸盐降解、生物素代谢等通路。网络药理学分析结果表明淫羊藿作用卵巢的潜在作用靶点共161个。PPI互作网络得到degree前10的蛋白作为核心靶点,根据得分依次为TP53、SRC、AKT1、CCND1、TNF、ESR1、EP300、ERBB2、JAK2、PARP1。GO分析结果表明,淫羊藿作用卵巢的靶点主要参与了蛋白磷酸化、MAPK级联反应的正调控、生物节律、基因表达的正调控、细胞凋亡过程的负调控、细胞内钙离子浓度的正调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等生物学过程。KEGG分析结果显示,靶点蛋白信号通路富集在PI3K-Akt信号通路、细胞周期、细胞衰老、HIF-1信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟等途径。以上结果从活体、代谢、转录和分子层面揭示了淫羊藿对后备母猪发情的影响和作用途径,本研究发现饲喂淫羊藿能够改变后备母猪卵巢转录与代谢模式,显著提高FSH、LH和E_2水平,进而促进母猪发情,淫羊藿的主要成分能够与TP53、SRC、AKT1、CCND1、TNF、ESR1、EP300、ERBB2、JAK2、PARP1结合发挥调控作用。本研究为淫羊藿应用提高后备母猪发情利用率提供理论依据。

猪卵泡液外泌体处理卵巢颗粒细胞的SNP/Indel筛选分析

旨在分析卵泡液外泌体对卵巢颗粒细胞基因的影响,了解卵泡液外泌体在卵泡发育过程中的调控机理,为母猪繁殖研究提供理论依据。本研究选取6月龄、健康状态良好且体重相近的二元母猪为材料,屠宰后收集卵巢150枚,利用梯度离心法获取卵泡液外泌体与猪卵巢颗粒细胞(porcine ovarian granulosa cells,POGCs),并在体外将卵泡液外泌体与猪卵巢颗粒细胞共培养。通过RNA-seq技术对猪卵巢颗粒细胞(granulosa cell samples,GC,n=3)和与外泌体共培养的猪卵巢颗粒细胞(granulosa-exosome co-culture samples,GCE,n=3)进行测序。结果显示,在GC和GCE组中平均每个样品获得5.54×10^(7)条clean reads,Q20和Q30质量得分均在92%以上。在GC和GCE组的6个样品中共获得1310979个SNPs突变和104498个InDel突变,其中纯合型SNP/Indel突变数量为170426个,杂合型SNP/Indel突变数量为1245052个,突变杂合子数目明显高于纯合子且SNP的发生率较高。另外,在突变类型中,转换类型共计973003个,颠换类型339974个,转换的类型显著高于颠换类型。经基因注释,突变主要发生在基因3′UTR、5′UTR、内含子区域,其次为外显子和基因间隔区。另外,通过与差异基因对比后,够筛选出1583个候选基因,经GO和KEGG功能富集发现,候选基因主要与细胞周期以及细胞增殖/凋亡过程相关。此外,共发现14个与细胞周期、增殖/凋亡通路相关的关键候选基因,其中11个基因存在互作关系。本研究获得的这些SNP/Indel信息可为后续研究外泌体在母猪生殖上的调控奠定科学基础。

miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用

旨在探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的影响。本试验收集180日龄健康母猪的卵巢组织,每次试验取20对卵巢进行颗粒细胞的分离培养,将miR-24-3p的mimics及inhibitor转染进颗粒细胞,通过ELISA、RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告试验等技术探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用。结果表明,过表达miR-24-3p可显著促进雌二醇的合成(P<0.01),并加快StAR、CYP19A1和CYP11A1的转录和翻译(P<0.05);而干扰miR-24-3p则显著抑制雌二醇的合成(P<0.05),并显著下调CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。进一步研究发现,TOP 1是miR-24-3p的直接靶基因,过表达miR-24-3p可显著抑制TOP1的表达(P<0.05),干扰miR-24-3p可显著上调TOP1的表达(P<0.05)。而过表达TOP 1则可减弱miR-24-3p对颗粒细胞雌二醇合成的促进作用(P<0.05)。综上所述,miR-24-3p通过靶向TOP 1抑制其mRNA和蛋白水平,促进雌二醇合成相关基因的表达水平从而促进颗粒细胞的雌二醇合成。鉴于颗粒细胞的雌二醇合成能力直接影响卵巢卵泡的发育状态,因此本研究为筛选提高母猪繁殖性能的miRNA提供理论依据。

生殖激素对母猪生殖活动的调节

我国是世界第一养猪大国,生猪存栏量和猪肉产量均是世界第一。能繁母猪是猪场的“发动机”,母猪群繁殖性能的好坏直接影响养猪场的盈利能力,母猪发情、妊娠和分娩等生殖活动的正常运行是发挥繁殖性能的基础,受到生殖激素的影响,生殖激素受“下丘脑—垂体—性腺”调节轴的精准调控。近年,许多中小规模养猪场为提高生产效率、减少成本支出,纷纷开始探索使用外源性生殖激素控制母猪同期发情、提高受胎率、维持妊娠、促进同期分娩、减少难产、诱导发情等。该文就生殖激素的种类、激素间互相影响、对母猪生殖活动的调节及应用进行综述,以期对养殖从业者提供参考。

熟地黄多糖对猪精液低温保存效果的影响

本试验旨在探讨熟地黄多糖(RGP)对巴克夏黑猪精液低温保存效果的影响。试验分为对照组和RGP试验组,试验组分别添加0.025、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL RGP,将精液置于低温(4℃)环境下保存6 d,分别于保存第1、3、5天检测猪精子的活率、活力、质膜完整性、线粒体活性,第2、6天时检测猪精液的抗氧化指标,最终根据保存效果筛选出适宜的RGP添加浓度。结果显示:与对照组相比,RGP组猪精液的活率提高(P<0.05);0.2 mg/mL RGP组精子活率、活力、质膜完整性、线粒体活性,抗氧化酶超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均高于对照组,丙二醛(MDA)含量低于对照组(P<0.05);0.3、0.4 mg/mL RGP组精子活力、质膜完整性、线粒体活性以及SOD活性、MDA含量均高于对照组(P<0.05),但0.3、0.4 mg/mL RGP组间无显著性差异。由此可见,在猪精液低温保存中添加RGP均可改善精液品质,RGP添加量为0.2 mg/mL时较为适宜。

精氨酸及其代谢物抑制热应激诱导仔猪支持细胞凋亡的机制

旨在分析精氨酸及其代谢物在调节热应激诱导仔猪支持细胞凋亡中的作用。本试验选择3周龄健康雄性仔猪25只,采集睾丸并从中分离支持细胞,随机分为3组,每组3个重复。将体外培养的仔猪睾丸支持细胞在44℃条件下处理30 min作为热应激模型,质谱多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)氨基酸代谢物,添加外源精氨酸和精胺,运用流式细胞术检测细胞的凋亡率,使用Western blotting检测iNOS、BAX、FAS、ARG1,ODC和SSAT1的表达,通过荧光定量PCR检测Arg1、Arg 2和Odc mRNA水平,通过试剂盒检测精胺水平。结果显示,热应激显著降低了精氨酸(P<0.01)和瓜氨酸(P<0.05)水平,提高了腐胺(P<0.05)和鸟氨酸(P<0.01)水平,但精胺(P>0.05)水平无显著变化;热应激也显著增加了Inos(P<0.01)、Arg1(P<0.01)、Arg2(P<0.01)和Odc(P<0.05)mRNA的表达以及NO(P<0.01)的含量并导致细胞凋亡率上升(P<0.01)。添加0.05 mmol·L^(-1)外源精氨酸提高了热应激条件下SCs的活力(P<0.05)和精氨酸(P<0.01)含量,降低了BAX(P<0.05)和FAS(P<0.05)蛋白水平和相对凋亡率(P<0.01),同时也显著降低了iNOS(P<0.01)蛋白水平和NO(P<0.01)含量,提高了精胺(P<0.01)含量,缓解了热应激下SCs的凋亡(P<0.01);添加外源精胺也得到了类似的结果。以上结果表明,热处理通过增强Arg-NO代谢途径诱导SCs凋亡;添加外源性精氨酸和精胺可增强Arg-精胺代谢,减少NO的产生,从而抑制热应激诱导的SCs细胞凋亡。

黄芩多糖对长白猪精液冷冻保存效果的研究

本研究旨在探讨不同浓度的黄芩多糖添加方案对猪冷冻精液保存效果的影响。猪冷冻处理的精液共6组,分别为空白对照组和添加不同浓度黄芩多糖的试验组(在冷冻稀释液中分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L黄芩多糖),对冷冻-复苏的精液进行精子活力及相关运动参数、精子质膜完整性、顶体完整率等指标检测。结果表明:与空白对照组相比,添加0.4 g/L的黄芩多糖对冷冻-复苏后的精子直线速度、曲线速度、平均路径速度、顶体完整率、DNA完整率和精子抗氧化酶活性均有提高(P<0.05)。0.6 g/L黄芩多糖组精液冷冻复苏后精子的运动参数、顶体完整率及抗氧化酶活性与0.4 g/L黄芩多糖组无显著差异。此外,0.8 g/L黄岑多糖组的质膜完整率及直线性高于其他组(P<0.05)。综上所述,添加不同浓度的黄芩多糖均可提高猪冷冻精液品质,其中提高猪冷冻精液保存质量的最适添加量是0.4 g/L。

品种、月龄、季节因素对猪精液冷冻效果的影响

本实验旨在探究品种、月龄、季节等因素对猪精液冷冻效果的影响。采集3个品种(杜洛克、长白、大白)4个月龄阶段(7~12、12~24、24~36月龄、36月龄后)、4个季节(春、夏、秋、冬)的公猪精液,并通过质检、冷冻、解冻等冷冻精液处理,比较解冻前、后精子活力指标。结果表明:①解冻后精子活力为长白>大白>杜洛克(68.62%vs.68.06%vs.61.66%,P<0.01),冷冻造成上述品种公猪的精子活力值降幅分别为7.15%、7.94%、8.13%(P<0.01)。②长白猪在12~24月龄时精子冷冻效果最佳,解冻后精子活力为70.61%;大白猪在24~36月龄时精子冷冻效果最佳,解冻后精子活力为71.94%;在4个月龄阶段,长白猪解冻后精子活力值相较于冷冻前降幅分别为6%、2.49%、0.57%、14.51%,大白猪降幅分别为7.11%、2.42%、0.43%、-1.58%。③不同季节,长白、大白和杜洛克解冻后活力在冬季最佳,夏季最差;长白、大白和杜洛克解冻后精子活力在夏季的降幅分别为9.41%、12.34%、21.9%,冬季降幅分别为3.64%、5%、6.97%。由此可见,长白猪在12~24月龄、大白猪在24~36月龄的精液冷冻效果最佳;长白、大白、杜洛克均在冬季采精的冷冻效果最佳。

基于Smart-seq2探究玻璃化冷冻对猪孤雌激活囊胚基因表达的影响

旨在探究玻璃化冷冻对猪孤雌激活(parthenogenetic activation,PA)囊胚基因表达的影响。本研究以猪PA囊胚为研究对象,根据试验处理分为新鲜组、玻璃化冷冻组Ⅰ和玻璃化冷冻组Ⅱ,随后从每组挑选3枚形态良好的囊胚,利用Smart-seq2单细胞全长转录组测序技术进行转录组测序分析。结果显示,玻璃化冷冻组Ⅰ与新鲜组相比,共鉴定到772个差异表达基因(differential expression genes,DEGs),GO和KEGG富集分析结果显示,这些DEGs与细胞脂质代谢过程、细胞葡萄糖稳态、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等相关;玻璃化冷冻组Ⅱ与新鲜组相比,共鉴定到1613个DEGs,主要与糖异生、代谢途径、氨基酸生物合成等相关;玻璃化冷冻组Ⅱ与玻璃化冷冻组Ⅰ相比,鉴定到822个DEGs,主要与丙酮酸代谢过程、N-聚糖生物合成、细胞衰老等相关。综上,本研究基于Smart-seq2单细胞全长转录组测序技术揭示了玻璃化冷冻对猪PA囊胚脂质代谢、能量代谢、MAPK信号通路等相关基因表达的影响。

基于基因组重测序的公猪精液品质候选基因研究

本研究基于某企业公猪站172头纯种大白猪10 316条精液品质记录,分别针对精液体积、精液密度、有效精子密度、精子活力、精子畸形率以及直线运动比例进行统计分析,绘制每种性状的分布情况。相关性分析发现,精液体积与精液密度呈负相关,精子活力与直线运动比例呈正相关、与畸形率呈负相关。进一步分别选取精液体积性状极端高和极端低的10个样品,提取基因组DNA,进行15×全基因组重测序,共获得高质量SNPs和InDels 11 400 036个。以10 kb为window、5 kb为步长进行遗传分化系数(Fixation Index,Fst)分析,以0.1%的window为阈值,筛选精液体积高低组的极端分化区域,共获得4.43Mb的区域,包含142个候选基因。利用David工具进行GO富集分析,结果表明候选基因主要参与细胞分裂(GO:0051301)、白细胞运动(GO:1903238)、信号转导(GO:0007165)以及受体聚集(GO:0043113)等生物学过程。其中CDK6、CDK13、CDK14、STAG1和TNKS等基因主要参与细胞分裂过程,且均有与精子质量相关的报道,可作为影响公猪精液品质的候选基因,为后续分子标记的发掘提供理论依据。

红景天多糖对低氧环境下猪睾丸间质细胞增殖及凋亡的影响

本研究探讨了红景天多糖(rhodiola sachalinensis polysaccaride, RSP)对缺氧条件下猪睾丸间质细胞增殖和凋亡的影响及其机制。通过CCK-8法测定细胞活力,筛选出RSP的最适宜浓度和预处理时间;设正常组、低氧组、低氧+RSP组,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率,RT-qPCR检测细胞增殖和凋亡相关基因(CCND1、CDK4、IL-6、TNF-a、Bcl-2、Bax、Caspase-3) mRNA表达水平,Western blot检测Bax、Bcl-2、p21、JNK、p-JNK、p53表达水平。低氧条件下,猪睾丸间质细胞活力下降,经0.012 5mg·mL^(-1) RSP预处理18 h后,细胞活力有所提高。流式细胞术结果显示,RSP能缓解猪睾丸间质细胞低氧引起的细胞周期阻滞。RSP显著上调Bcl-2、CCND1、CDK4的表达(P<0.05),下调TNF-α、IL-6、Bax、Caspase-3、p21、p53、pJNK/JNK的表达(P<0.05)。RSP能保证低氧环境下猪睾丸间质细胞由S期进入G2期,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,推测RSP通过p53/p21和JNK通路调控细胞增殖和凋亡。

猪胚胎冷冻保存的研究进展

胚胎冷冻保存对于胚胎的远距离移植和遗传资源的保护具有重要意义。然而,猪胚胎由于其胞质脂肪含量高,对低温敏感,增加了其保存难度。研究表明,通过降低脂质含量、优化培养基成分、保护细胞骨架以及恢复线粒体功能等方式,能够提高猪胚胎冷冻保存技术的效率,从而促进其广泛应用。因此,本文介绍了胚胎冷冻保存技术,总结了提高胚胎冷冻效率的多种方法和措施。同时,笔者团队将通过讨论猪胚胎的内在特性以及低温保存对转录组改变的影响,进一步关注猪胚胎低温保存的机制,从而更好地了解和推进猪胚胎低温保存的研究。

芝麻酚对猪精液17℃保存效果的影响

本实验旨在探究芝麻酚对猪精液品质、运动性能及抗氧化等指标的影响。在猪精液稀释液中分别添加4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mg/L芝麻酚,0 mg/L添加组为对照组。在17℃环境下保存7 d,并在第1、3、5、7天检测精子活力、质膜完整率等品质指标以及曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均路径速度(VAP)等运动参数指标;在常温保存第5天和第7天检测精子中活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平,筛选出精液稀释液中芝麻酚的最佳添加浓度。结果表明:随着芝麻酚添加浓度的增加,精液品质呈现先升高后降低的趋势;17℃保存精液至第5天时,5.5 mg/L芝麻酚添加组精子活力、质膜完整率、VCL、VSL、VAP等运动能力及顶体完整率均显著高于对照组,且总抗氧化能力水平、过氧化氢酶活性也显著高于对照组,在第6天BCL-2相对表达量极显著高于对照组,BAX和CASPASE3相对表达量极显著低于对照组。本实验条件下,精液稀释液中添加浓度为5.5 mg/L的芝麻酚作为抗氧化剂效果最好。

β-谷甾醇对猪卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响

旨在探索一种自然植物提取的抗氧化分子——β-谷甾醇(β-sitosterol,SITO)对猪卵母细胞体外成熟效率和早期胚胎体外发育质量的影响。本研究以在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加不同浓度SITO为试验组,不添加SITO(含0.16%DMSO)的培养基为对照组,对屠宰场所得猪卵巢中收集到的卵母细胞进行体外培养,试验组浓度分别为10、20、40μmol·L~(-1),不同浓度各重复3次,每组培养卵母细胞150~200枚。培养46 h后,对卵母细胞成熟率进行统计,并收集成熟卵母细胞进行活性氧、细胞凋亡、线粒体膜电位染色以及相关基因的实时荧光定量PCR;对成熟卵母细胞进行孤雌激活,2 d后统计卵裂率,7 d后统计囊胚率,并统计囊胚细胞总数。结果发现,20μmol·L~(-1)SITO处理显著提高了猪卵母细胞的体外成熟率,且促进了孤雌激活后囊胚的形成并增加了囊胚细胞数,降低了卵母细胞中ROS含量,提高了抗氧化应激基因SOD和CAT的表达;同时,SITO降低卵母细胞的凋亡水平,增加抗凋亡基因BCL-2的表达,降低促凋亡基因Caspase 3和BAX的表达。此外,SITO可增强线粒体膜电位(ΔΨm),增加TFAM基因的表达。综上所述,本研究结果表明,在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加20μmol·L^(-1)SITO能够显著促进猪卵母细胞的体外成熟率、提高胚胎的体外发育能力和胚胎质量。

聚乙二醇与维生素E联用对沂蒙黑猪精液冷冻保存效果的影响

本实验旨在研究聚乙二醇(PEG)与维生素E联用对沂蒙黑猪精液冷冻保存效果的影响。实验共分为6组,将基础稀释液以1:1的比例缓慢加入精液中,然后按照1:4的比例分别添加100 mg/L维生素E溶液(E100组)、300 mg/L维生素E溶液(E 300组)、100 mL/L PEG+100 mg/L维生素E溶液(P+E 100组)、100 mL/L PEG+300 mg/L维生素E溶液(P+E 300组)、100 mL/L PEG溶液(PEG组)和无处理冷冻保存液(对照组)。结果表明:与对照组相比,维生素E组和PEG+维生素E组精液解冻后其精子活力、顶体完整性、精子的抗氧化性及线粒体膜电位等指标均提高(P<0.05),PEG组以上指标均无显著差异;相同条件下,添加较高浓度的维生素E对精液冷冻保存质量的提升效果优于低浓度维生素E添加组(P<0.05);与单独添加维生素E相比,联合添加PEG与维生素E通过提高精子活力、质膜完整性、抗氧化能力和线粒体膜电位等指标进一步改善了冷冻精液解冻后的质量(P<0.05)。由此可见,联合添加PEG与维生素E可显著提高沂蒙黑猪精液的冷冻保存效果,原因可能是PEG促进了维生素E的溶解,提高了维生素E在猪精液冷冻保存液中的浓度所致。

广西巴马小型猪睾丸发育过程中组织形态及生殖激素水平的变化

为探究广西巴马小型猪睾丸的生长发育规律,为初情期和性成熟的判定提供依据,本实验采集广西巴马小型猪胚胎期65、90、105 d和出生后0、30、60、90、120、150、180、300 d的睾丸组织,测定睾丸长径、短径、厚径、重量等形态学指标,通过HE染色观察其组织特征,并使用ELISA方法测定出生后不同日龄的生殖激素水平。结果显示:随着日龄增加,睾丸各形态学指标持续增大,0~30 d各项指标增长速度最快,睾丸指数呈现先升高后降低的趋势,并在出生后60 d达到最大值;睾丸的各形态学指标间均呈正相关(P<0.01)。组织学观察表明,出生后60 d的睾丸和附睾中各部位内开始出现精子,已达到初情期;胚胎期生精小管的直径与面积在不同胎龄间差异不显著,出生后,与30 d相比,60 d睾丸的生精小管直径和面积增加(P<0.05)。促性腺激素释放激素(GnRH)存在2个快速上升的阶段(0~30 d和90~120 d),120 d之后迅速下降,卵泡刺激素(FSH)在出生后呈现阶梯式上升的趋势,30~60 d出现首次快速上升,黄体生成素(LH)在120 d快速增长至150 d后逐渐下降,睾酮(T)在出生后经过短暂下降逐步上升至120 d,120~150 d出现一次快速上升,180 d达到峰值后快速下降。本实验发现,广西巴马小型猪胚胎期65~90 d和出生后0~60 d是其睾丸快速发育的时期;出生后30~60 d是精子发生的关键时期,初情期在30~60 d;巴马小型猪睾丸在60 d时已具备基本的生精能力,在150 d时基本发育成熟。

猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体的构建

本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞(ST)中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降(P<0.001),成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功构建重组质粒ACE-shSPAG6-pcDNA3.1,转染ST细胞48h后SPAG6蛋白表达量较阴性对照组显著下调(P<0.001)。本研究成功构建了猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体,并在ST细胞中验证了其具有较好的干扰效果。