犬细小病毒感染生物标志物及其检测方法研究进展

犬细小病毒感染是诱发幼犬肠炎和死亡的重要病因之一,其对各类及各年龄段犬均有较大危害,通过特定生物标志物及配套检测方法对犬的感染状况进行评估,以及对于感染犬的快速诊断及其治疗方案的确定实施有重要意义。文章通过对国内外犬细小病毒感染相关生物标志物及其检测方法方面的研究进展进行总结归纳,以期为犬细小病毒病的检测和诊疗提供参考。

狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节Ⅰ型干扰素作用的差异分析

【目的】狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种高致死性人兽共患传染病。Ⅰ型干扰素(IFN-I)通路在抵抗RABV感染中发挥重要作用。RABV可通过磷蛋白及核蛋白的功能逃逸IFN-I的抗病毒作用,本研究旨在探讨对RABV的致病性有重要影响的糖蛋白(Glycoprotein,G)在调节IFN-I通路方面扮演怎样的角色。【方法】将RABV弱毒株Hep-Flury的G基因替换成致病株CVS-11的G基因,拯救得到重组病毒HepG,分析Hep-Flury、CVS-11和HepG这3种毒株在体内和体外感染对IFN-I通路激活和调控的差别,比较它们在神经细胞中对抗IFN-I抗病毒作用的差异性。【结果】替换了CVS-11的G基因后,重组病毒HepG致病力增强,能够100%致死小鼠,在鼠脑中的增殖水平显著高于亲本株Hep-Flury。在感染鼠脑早期及体外神经细胞时,弱毒株Hep-Flury能够较快地激活IFN-I通路相关基因的表达,重组病毒HepG的激活能力介于HepFlury和CVS-11之间。利用Poly(I:C)激活神经细胞的IFN-I通路后,Hep-Flury的增殖被显著抑制,CVS-11和HepG的复制几乎不受影响,表现出一定的抵抗能力。【结论】RABV的G蛋白在调节和抵抗IFN-I通路方面发挥重要功能,为进一步探究RABV致病毒株的G蛋白如何协助病毒在中枢神经系统中逃逸IFN-I提供了线索和依据。

猪伪狂犬病诊断方法与疫苗研究进展

猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)可引起妊娠母猪繁殖障碍和新生仔猪神经症状,可感染人类并引起脑炎,使感染者出现严重的神经症状,直接危害人类健康,因此对该病的研究具有重大意义。近年该病在世界范围内广泛分布,对世界养猪业造成了巨大的经济损失,受到国内外学者的高度关注,对该病的研究也日益深入,在诊断方法及防控机制等方面取得了重要进展。论文就近年来猪伪狂犬病诊断方法及疫苗的发展进行综述,以期为在猪伪狂犬病诊断方法和疫苗选择上提供参考。

表达外源基因SPAM1重组CAV-2溶瘤病毒的构建与拯救

旨在研究犬腺病毒-2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)作为溶瘤病毒的潜力并进一步探索精子黏附因子(SPAM1)协同CAV-2重塑肿瘤微环境在肿瘤免疫治疗中的应用价值。本研究以P15A-CAV-2反向遗传操作平台为基础,使用RED/ET同源重组系统构建携带SPAM1外源基因的中间载体,使用中间载体将CAV-2骨架载体E3区域缺失并替换SPAM1外源基因表达盒。再利用合成引物敲除kmccdB反向筛选表达盒构建P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆质粒并在MDCK-E1A细胞系中拯救重组溶瘤病毒,对重组病毒体外溶瘤效应进行验证。根据测序与酶切验证结果证明,本研究成功构建并拯救出稳定表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒1株;IFA试验证明,重组毒株能够高水平稳定表达外源基因且外源蛋白具有可弥散分布于细胞间的特点。缺失E3区域表达外源基因SPAM1的重组溶瘤病毒通过光镜观察和CCK8检测发现具有对犬癌细胞系A72强烈的杀伤效应。综上,本研究成功构建1株具有良好溶瘤效应的重组CAV-2,为后续应用于宠物肿瘤治疗奠定了基础。

一种犬源干扰素α制备工艺开发及体内外活性研究

目的:开发一种高活性的犬源干扰素α(CIFNα)制备工艺。方法:构建CIFNα表达载体,筛选表达菌株,通过诱导表达包涵体,采用优化后的纯化工艺对包涵体进行纯化,获得高纯度CIFNα,通过体外活性测定及体内攻毒治疗实验,考察CIFNα的生物活性。结果:制备的CIFNα纯度在95%以上,体外活性测定中比活为8.39×10~6 U/mg,优于已经上市的CIFNα;体内攻毒结果表明,制备的CIFNα具有显著的治疗犬细小病毒疾病的作用。结论:开发了操作简便、安全、有效、质量可靠的CIFNα制备工艺,适用于商业规模化生产,为CIFNα的实际生产和应用提供了技术支持。

犬细小病毒病的诊断及治疗

犬细小病毒病(Canine parvovirus disease,CPV)是犬的一种烈性传染病。该病传染性强,不同季节、不同品种及各年龄段的犬均可发病,如不及时治疗,常会导致病犬死亡。作者对前来医院就诊的2例肠炎型和心肌炎型犬细小病毒病例进行基本的临床检查、血常规检查以及胶体金快速诊断卡检查进行诊断,使用特异性治疗法、支持疗法、对症治疗等对患病犬进行治疗。最终肠炎型病例痊愈,心肌炎型病例死亡。结果可为不同型犬细小病毒临床病例的诊治提供参考。

我国犬瘟热病毒的生态学调查研究

本研究应用电子显微镜技术检查了１７种毛皮动物和野生动物的６７６份材料，从犬、貂、貉、狐、熊、小熊猫、大熊猫、狼、狮、虎、猞猁、金猫等１２种动物病料中，检出含有ＣＤＶ材料４８７份。应用间接ＥＬＩＳＡ、免疫荧光和中和试验等技术检测了８种动物１５８份血清，其中从犬、狐、小熊猫、虎、金猫，狼等６种动物的１０６份血清中检出了抗ＣＤＶ抗体。应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因探针检查了４种动物的３７份材料，其中有２９份阳性。本研究证实的大熊猫、虎、狮、小熊猫、金猫、猞猁、熊、狼等动物对犬瘟热病毒的感染，丰富了犬瘟热病毒生态学的内容。

犬瘟热病毒反转录-聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用

根据Ｂａｒｅｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录，以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ扩增条件进行了优化。经鉴定，以此对引物进行的ＰＣＲ扩增，得到了与设计片段大小和酶切位点相同的产物，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸，这表明此方法为特异性的。对２７条（只）临床病例和３２份细胞培养物进行检查，并与电子显微镜负染检查结果进行了比较。初步应用研究的结果表明，此方法可用于犬瘟热病毒的临床诊断和实验研究。

犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析

根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHT,用重组质粒pPROEXTMHT-N转化感受态E.coliDH5a细胞,用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白,占菌体总蛋白18%。经Westernblot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性,将表达产物用ProBondTM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应,经琼扩试验测定其效价为1∶16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原,建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏度达15.6ng(0.156μg/mL),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等无交叉反应。批间和批内变异系数较小,分别为6.39%和4.1%。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测,发现二者的符合率可达到77.4%,比PCR敏感。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可广泛应用于动物组织中PrV的检测。

犬瘟热病毒野毒株H蛋白基因的序列分析

对引起长春某犬场犬死亡的犬瘟热病毒（ Ｃ Ｄ Ｖ）野毒株（ Ｌ Ｉ Ｕ）附着或血凝蛋白（ Ｈ）基因进行了全基因序列测定，并与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株作了比较。用 ４ 对引物对 Ｌ Ｉ Ｕ 株进行了 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增，将扩增得到的 ４ 个阳性 Ｐ Ｃ Ｒ 片段纯化后直接测序。将所测序列拼接后，去掉侧翼的 Ｆ 基因和 Ｌ 基因序列，得到了 Ｈ蛋白的全基因序列。该基因全长为 １ ９４６ ｂｐ，开放阅读框架（ Ｏ Ｒ Ｆ）始于 ２１～２３ 位的 Ａ Ｔ Ｇ，终止于 １ ８４２～１ ８４４位的 Ｔ Ｇ Ａ，编码 ６０７ 个氨基酸。将 Ｌ Ｉ Ｕ 毒株与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株进行比较，二者 Ｈ 基因核苷酸序列的同源性为 ９１．７％ ，推导的 Ｈ 蛋白氨基酸序列的同源性为 ９０．２％ 。 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株的 Ｈ 蛋白潜在的 Ｎ 联糖基化位点为 ４ 个，而 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白为 ８ 个。糖基化位点的不同可能对 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白的抗原性产生影响。２ 个毒株 Ｈ 蛋白的半胱氨酸残基数目均为 １２ 个，且位置是保守的；疏水性有一定的不同，但推测的穿膜区位置是相同的，位于 ３５～５５ 位氨基酸之间。

伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建

用限制性核酸内切酶ＮｃｏＩ消化含有伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｆａ侏ＢａｍＨＩ－７片段的质粒ＰＰＢ７，以低融点琼脂糖回收目的片段，经连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ｄ，获得缺失３ｇＩ和部分ｇｐ６３基因的重组质粒ＰＰＢ７－１。将ＰＲＶＦａ与ＰＰＢ７－１ＤＮＡ共同转染ＰＫ１５单层细胞，待出现５０％以上细胞病变时收获病毒，并以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为ＰＦＤＩ／Ｄ６３。小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定的免疫原性。

犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定

从病死犬肺、肝和淋巴结分离到２株ＣＤＶ，ＣＤＶ９３０３９和ＣＤＶ９３０４１。消除小牛血清中的干扰因素和３３℃培养是分离成功的主要因素。两株病毒均在Ｖｅｒｏ细胞生长良好，传２～４代毒力稳定，ＣＰＥ产生明显，ＴＣＩＤ５０为１０－６．５０～１０－６．７７，明显高于国内外野毒株和弱毒株的毒力效价。人工感染犬死亡率较高，表明该分离株致病力较强，作者推测我国犬群可能存在ＣＤＶ强毒变异株。

用RT-PCR检测病料中犬瘟热病毒的研究

利用RT-PCR技术检测了来自不同地区水貂、狐狸、貉子和老虎病料中是否存在犬瘟热病毒。根据犬瘟热病毒H和N基因核苷酸序列,设计合成2对引物。利用这2对引物分别对14份病料进行了检测。利用H基因引物从7份病料中扩增出761 bp的核酸片段,利用N基因引物也从同样的7份病料中扩增出586 bp的核酸片段。其余病料的检测结果为阴性。2对引物对病料的检测结果一致。

湖南湘西地区外观健康犬携带狂犬病病毒的调查研究

为了解湖南湘西地区外观健康犬携带狂犬病病毒的情况,我们于2005年9月从湘西狂犬病疫点采集38份扑杀的外观健康的犬脑组织,并于2006年1月在湘西农贸市场采集了168份外观健康的犬脑组织。RT-PCR和直接荧光抗体试验(FAT)检测表明共有5份犬脑标本为阳性,并用乳鼠脑内接种的方法分离得到了5株狂犬病病毒毒株,分子流行病学分析表明这5株病毒均为野毒。在这5份阳性标本,疫点有4份,检出率为10.5%,市场1份,检出率为0.59%。我们的调查结果表明疫点的外观健康犬携带狂犬病病毒的检出率与国内的其它报道接近,而从市场采集的标本的检出率却要低很多。

犬瘟热病毒野毒株融合蛋白主要功能区基因的变异研究

根据犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白（Ｆ）基因的核苷酸序列，设计合成了１０条引物。用１对引物从延吉犬病料中扩增出了含Ｆ２区基因的３１４ｂｐ的片段，除两端引物序列外为２６５ｂｐ，编码８８个氨基酸。它与日本弱毒株（ＣＤＶ－Ｊ）、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株（ＣＤＶ－ＯＮ）、海豹瘟热病毒２型（ＰＤＶ２）、１型（ＰＤＶ１）在核苷酸和氨基酸水平上的同源性，分别为９８．１％和９５．５％、９６．２％和９３．２％、９４．３％和９３．２％、７７．４％和８７．５％。对５份来自不同地区的ＣＤＶ病料的融合区基因片段进行了扩增、克隆和序列分析，其中北京１号犬（ＣＤＶ－Ｂ１）、２号犬（ＣＤＶ－Ｂ２）、沈阳犬（ＣＤＶ－Ｓ）和长春犬（ＣＤＶ－Ｚ）的２８３ｂｐ片段完全相同，而与哈尔滨犬（ＣＤＶ－Ｈ）的该片段有３个核苷酸和２个氨基酸不同。在核苷酸和氨基酸水平，北京犬野毒株等与ＣＤＶ－Ｈ、ＣＤＶ－Ｊ、ＣＤＶ－ＯＮ、ＰＤＶ２、ＰＤＶ１的同源性分别为９８．９％和９７．９％、９７．９％和９５．８％、９６．５％和９７．９％、９３．３％和９８．９％、７７．０％和８４．２％。本研究揭示了ＣＤＶ的流行毒株和相关毒株在融合蛋白上的亲缘关系，进一步证实了ＰＤＶ２?

犬瘟热病毒小熊猫株附着蛋白基因的序列分析

为了从基因水平上研究我们分离的犬瘟热病毒（CDV）。熊猫（LP）毒株与疫苗弱毒Onderstepoort株的差别，本文对LP毒株附着蛋白（H）基因进行了序列测定。我们设计合成了4对引物，对LP株进行了RT-PCR扩增，将扩增得到的4个阳性PCR片段纯化后，直接进行测序，把所测序列拼接后，去掉侧翼的F基因和L基因序列，得到了H蛋白的全基因序列，该基因全长为1946bp，开放阅读框架（ORF）始于21-23位的ATG，终止于1842-1844位的TGA，编码607个氨基酸。将LP毒株与GenBank中疫苗弱毒Onderstepoort株进行比较，二者H基因核苷酸序列的同源性为92％，推导的H蛋白氨基酸序列的同源性为90％。Onderstepert株的H蛋白潜在的N-联糖基化位点为4个，其中2个位于N末端2／3处（一个位于推测的胞质部分，不能利用），另2个位于蛋白质C末端1／3处，而LP株H蛋白潜在的队联糖基化位点为8个，其中4个与Ondersttepoort的N-联糖基化位点完全相同，但另外4个是疫苗株所不具有的，糖基化位点的不同可能对LP株H蛋白的抗原性产生影响;两个毒株H蛋白的丰胱氨酸残基数目均为12个且位置是保守的;疏水性有一定的变化，但推测的穿膜区位置是相同的，约位于35-55位氨基酸之间。上述结果表明LP和Onderstepoort疫苗株的H蛋白及其基因是存在差别的，至?

Real-time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒

为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法。通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高。通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率。

犬瘟热病毒南京分离株的生物学特性鉴定

从南京地区临床诊断疑似为犬瘟热的病犬脑组织分离到 1株病毒 ,经鉴定为犬瘟热病毒 ( CDV) ,命名为 CDV-NJ1 5,对其培养特性、细胞毒力、血凝活性、抗原性、结构多肽和对犬的致病性进行了研究。结果表明 ,除 Vero外 ,CDV-NJ1 5还能在 MDCK、BHK-2 1、FE、DJRK、HEp-2等细胞系有限增殖 ,产生的 CPE特征与 Vero细胞类似 ,但不能在 PK1 5细胞系增殖。在 Vero细胞的 TCID5 0 和空斑形成单位分别为 1 0 - 5 .0 /m L和2 .4× 1 0 5 PFU/m L。参考株 CDV-Onderspoort的培养特性和细胞毒力基本与之相似 ;交叉中和试验表明 ,二者之间具有交叉反应和相同的抗原性 ;二者的结构多肽 NP蛋白和 F蛋白用特异性单克隆抗体免疫转印技术分析 ,未显示差异。动物回归试验表明 ,CDV-NJ1 5对犬表现出弱致病力。以上结果提示 ,该分离株是一持续性感染的弱毒株 。

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型临床症状的病犬肠溶物经 SDS-酚裂解法提取总 DNA,并以此 DNA为模板 ,通过人工合成的两条 2 0 mer引物进行 PCR扩增 ,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白 VP2 基因中间 1 /3区段 ,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定 .试验结果表明 :用 PCR扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性 ,应用该方法检测的 2 7份病犬肠溶物样品均获得了预计长度的 DNA片段 ( 53 1 bp) ,而健康犬的肠溶物样品 PCR结果为阴性 .该方法的检测灵敏度很高 ,最高可将提取的总 DNA样品稀释 1 0 6倍 ,即可以检测到 1 .3 7pg总 DNA样品中所含的病毒 DNA.由于该方法直接利用病犬肠溶物提取总 DNA,检测方法快速、简便 ,结果可靠 ,可在 2 4 h内获得满意结果 。