适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20~100 mmol/L Tris-HCl、50~250 mmol/L KCl、0.01%~0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%~2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5~5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1~5 mg/mL明胶、0.01%~0.10%海藻糖、1%~5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化,采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂,100℃加热3 min,取上清液进行RPA-LFD反应,测试各组分不同浓度配比;并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示,核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂,适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备,有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤,极大地提高了核酸水平病原检测效率。

赤潮异弯藻对中国对虾感染白斑综合症病毒的影响

1 引言 白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是近年来危害我国乃至世界对虾养殖业的主要流行病原[1-4].WSSV病毒暴发流行范围广、致病性强,自出现以来给对虾养殖业造成了巨大的损失.对虾病毒病的发生是对虾自身的健康状况、病原生物。

感染白斑综合症病毒(WSSV)对虾相关免疫因子的研究

12 9尾中国对虾 (Penaeuschinensis)分别捕自未暴发白斑综合症 (WSSV病毒所致 )虾池、WSSV暴发虾池以及曾暴发WSSV虾池。用斑点杂交和组织病理学方法确定各尾对虾的染毒 (WSSV)程度。用 96孔酶标板法测量相应个体血淋巴上清液的抗菌活力 (Ua)、溶菌活力 (UL)、酚氧化酶 (PO)活性以及过氧化酶 (POD)相对活性 ;用硝酸纤维膜斑点法测定其碱性磷酸酶 (ALP)相对活性 ;用血凝法测定其凝集效价(HAT)。通过对以上免疫指标进行统计分析 ,结果表明 ,WSSV感染与对虾血淋巴PO活性以及ALP相对活性变化有紧密联系 ;不同虾池各免疫因子差异显著 ,发病虾池虾样各免疫指标平均值均低于其他虾池 ;曾发病虾池的虾样PO活性较强 ;WSSV与HPV感染无统计学意义上的相关性 ;未发病虾池与曾发病虾池实验对虾的Ua与UL 相关性极显著 ,发病虾池实验对虾Ua与UL 呈负相关 ;发病虾池对虾PO与ALP活性相关性显著。

Ca^(2+)与Mg^(2+)浓度对凡纳滨对虾糠虾幼体育成仔虾成活率和生长的影响

采用浓缩海水与自来水调配的基础海水,以凡纳滨对虾Ⅲ期糠虾幼体(M3)作为试验对象,在小范围(0~100 mg/L)内调节育苗用水中Ca2+、Mg2+浓度,以L9(34)正交表设计,研究育苗用水中不同Ca2+、Mg2+浓度对凡纳滨对虾M3育成仔虾(P10)的成活率和生长的影响。结果表明,在相同饲养条件下,Ca2+浓度为494 mg/L时,增重效果显著(P<0.05);Mg2+浓度为1185 mg/L的增重效果显著优于1135 mg/L水平;Ca2+浓度为444 mg/L和494 mg/L时,对提高M3育成P1和P10的成活效果均具有显著作用(P<0.01);Mg2+浓度为1185 mg/L、Ca2+浓度为494 mg/L(镁钙比值R=2.40)的交互作用对提高M3育成P10的成活效果最佳(P<0.01);Ca2+浓度分别为444、494 mg/L时,其R值可适范围分别为2.67~2.78和2.30~2.50。同时育苗水体中Ca2+与Mg2+浓度及Mg2+/Ca2+均应达到合适的值,方能满足凡纳滨对虾幼体生长发育的需要。在试验浓度梯度范围内,Ca2+是影响凡纳滨对虾增重和成活的主要因子,但对增长无显著影响(P>0.05),其可适范围为444~494 mg/L;Mg2+对凡纳滨对虾生长的影响均不显著;Ca2+与Mg2+浓度的交互作用显著影响M3育成P10的成活率。

白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因的克隆及在蓝藻中表达载体的构建

用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒(WSSV)。设计并合成引物 ,提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板 ,通过PCR ,扩增克隆出VP28基因 ,利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体 pUC19的多克隆位点上 ,得到VP28基因的重组克隆质粒,对其进行双向DNA测序。测序结果表明,该基因含有615个核苷酸 ,与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100 %。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游 ,EcoRI酶切鉴定 ,得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体 ,命名为 pRL VP28。

用DNA斑点杂交法检测对虾及其饵料和环境生物携带白斑综合症病毒状况的调查

于 1996～ 1998年采用DNA斑点杂交法 ,完成了共计 836份养殖对虾 ,2 13份对虾饵料和环境生物样品的检测。结果显示 ,对虾在每年的 4～ 10月都可检测出白斑综合症病毒 (WSSV) ,6月出现最高峰 ,阳性检出率达到 4 2 .6 % ;其次 ,为 7月和 5月 ,分别达 31.6 %和 2 4 .5 %。在对虾不同生长阶段 (包括亲虾、各期幼体、仔虾、幼虾及成虾 )均可检出WSSV ,其中以仔虾的带毒率最高 ,达 36 .4 % ,其次为糠虾幼体 ,达 34.6 %。体长范围 1.1～ 2 .0cm的仔虾阳性率最高 ,其次体长为 5 .1～ 6 .0cm的幼虾样品。检测的中国对虾样品(6 2 5份 )带毒率为 16 .8% ,日本对虾样品 (2 11份 )带毒率为 4 5 .0 %。对虾主要饵料及环境生物类群包括鱼类、虾类、蟹类、桡足类、端足类、沙蚕、卤虫均可检出WSSV ,其中小型虾类、端足类、桡足类、蟹类样品的WSSV检出率均高于 2 0 %。

WSSV和IHHNV二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据基因库中对虾白斑综合症病毒W SSV(AF369029)和传染性皮下及造血器官坏死病毒IHHNV(AF218226)基因序列,设计了W SSV和IHHNV的两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqM an探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测W SSV和IHHNV的二重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对W SSV和IHHNV的检测敏感性分别达到2和20个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对W SSV和IHHNV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这二个病毒。对保存的30份经常规PCR检测仅为W SSV或IHHNV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中1份为W SSV和IHHNV混合感染。本研究建立的二重实时荧光PCR方法用于W SSV和IHHNV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。

β-葡聚糖在中国对虾（Penaeus chinensis）育苗中的应用

分别用5种不同浓度(O，O．1，O．3，O．5，1mg/ml)的β-葡聚糖溶液对中国对虾蚤状、糠虾幼体进行3h浸浴，48h后用浓度为5．9×10^6cfu／ml的副溶血弧菌(Vibrio para-haemolyticus)进行攻毒。攻毒后再养殖48h。结果显示，0．1、0．3和0．5mg/ml处理组均显著提高(P<0．05)蚤状和糠虾幼体攻毒后的存活率，其中，0．3和0．5mg/ml的处理组还显著提高(P<0．05)蚤状幼体的变态率和生长，但对糠虾幼体生长的影响不显著(P>0．05)。本研究结果表明，p一葡聚糖可以作为免疫增强剂在中国对虾育苗阶段使用，建议浸浴使用的浓度为0．3～0．5mg/ml。

中国对虾血淋巴抗凝剂的筛选

依据中国对虾血细胞电镜照片中血细胞整体形态和细胞器、细胞核的变化 ,研究对虾抗凝剂成分配比。初步确认了一种理想的抗凝剂配方NaCl45 0mM、KCl10mM、EDTA .Na2 10mM、HEPES 10mM (pH 7.45 )。它能够良好的保持细胞的整体形态以及细胞器、细胞核的形态。

海水养殖与低盐养殖凡纳滨对虾生长性能、酶活及RNA／DNA比值的差异

以初始体重为4.04±0.14 g的凡纳滨对虾为研究对象,分别在盐度1.5和30的水体中用同一种配合饲料喂养50d,探讨海水养殖和低盐养殖对凡纳滨对虾生长性能、碱性磷酸酶及酸性磷酸酶和RNA/DNA比值的影响。结果显示,海水养殖凡纳滨对虾的成活率、特殊增长率(SGR)高于低盐养殖对虾(P<0.05);海水养殖凡纳滨对虾的饲料系数(FCR)明显低于低盐养殖对虾(P<0.05);海水养殖凡纳滨对虾肝胰脏碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均明显高于低盐养殖对虾(P<0.05);海水养殖凡纳滨对虾肌肉RNA/DNA比值明显高于低盐养殖凡纳滨对虾(P<0.05)。

中国对虾(Fenneropenaeus Chinensis)自然感染与人工感染WSSV抗病力的比较

取30个通过人工授精和自然交尾建立的中国对虾家系,分别进行人工感染和自然感染实验。实验过程中,两实验组样本总体存活率在35%左右时统计各家系的存活率,以分析其抗白斑综合征病毒情况。用四格表的卡方检验分析中国对虾各家系存活率,结果发现23个家系的存活率在两种感染方式实验间差异不显著(P>0.05),两种感染方式实验间家系存活率一致性为77%。用独立样本T检验对两种感染方式实验中4个杂交组合的存活率进行比较,结果发现4个杂交组合的存活率在两种感染方式实验间差异不显著(P>0.05),说明人工感染和自然感染实验对中国对虾抗病力的反映情况基本是一致的。另外,对两个实验中各家系的抗病力进行分析,综合结果表明有5个家系对WSSV可能有较强的抗病力。

马尾藻多糖对南美白对虾免疫调节作用

[目的]研究马尾藻多糖对南美白对虾免疫功能的影响。[方法]用含不同比例(0、0.10%、0.15%和0.20%)马尾藻多糖的虾饲料喂养对虾14 d,测定虾血淋巴液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、酚氧化物酶和酸性磷酸酶的活性,计算攻毒感染后不同处理对虾存活率。[结果]含马尾藻多糖0.20%的虾饲料能极显著提高溶菌酶和酚氧化物酶活性,显著提高超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性和攻毒虾存活率,溶菌酶和酚氧化物酶含量分别达到(0.209±0.076)(、258.800±203.080)U/ml;含马尾藻多糖0.15%的虾饲料能极显著提高酚氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,显著提高溶菌酶活性和攻毒虾存活率,酚氧化物酶和超氧化物歧化酶含量分别达到(321.267±218.406)和(0.453±0.190)U/ml。[结论]马尾藻多糖能显著增强南美白对虾的免疫功能,其加入量为0.20%时效果最好。

同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法。研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测。

噬菌蛭弧菌和粘红酵母对中国对虾生长及非特异免疫因子的影响

将噬菌蛭弧菌(Bd)、粘红酵母(Rh)及二者混合物分别以1%的比例添加到中国对虾基础饲料里,同时以基础饲料为对照。采用连续投喂的方法,饲喂1.5cm左右的稚虾25d,分别测定第5、10、15、20和25天的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、溶菌活力等免疫因子活性。试验结束后,试验组中Rh组存活率达到63%,Bd组和Bd+Rh组分别为45%和40%,二者间无显著差异(P>0.05)。投喂Rh组的增长率、增重率至少高于其他组10.72%和105.05%,比对照组高出36.37%和320.22%。试验组酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶活力、溶菌活力从第10天起均高于对照组两倍左右。试验结果表明,饲养实验结束7d后,用鳗弧菌攻毒,在8d内,对照组的死亡率显著高于试验组(P<0.05),试验组免疫保护率为50%～65%,以Rh组最为显著。试验结果表明,微生态制剂能有效促进对虾的生长及提高免疫因子的活性;从免疫水平和生长水平综合考虑,建议单独使用粘红酵母,添加量为1%左右为宜。

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)PCR检测方法的建立

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大。本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19. 85fg(8. 83×103 病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应。本方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染和携带IHHNV状况,为对虾健康养殖、无特定病原(SPF)种群选育及流行病调查提供了有效的检测手段。

不同低温持续胁迫对凡纳滨对虾存活的影响

【目的】了解凡纳滨对虾对低温持续胁迫的耐受力,为评估低温对凡纳滨对虾养殖业可能造成的风险及有效应对寒灾提供科学依据。【方法】设7、8、9、10和11℃5个低温持续胁迫试验组和一个空白对照组(室内自然水温20℃),通过观察凡纳滨对虾对不同低温胁迫的行为反应并分别记录死亡历时,应用统计学方法拟合死亡率与死亡历时的关系模型。【结果】试验期间对照组凡纳滨对虾未出现死亡,存活率为100%。凡纳滨对虾在低温持续胁迫下,首尾死亡及100%死亡历时均随胁迫温度的升高而延长,7和11℃低温胁迫时,首尾死亡及100%死亡历时分别为2.6和13.3h、27.0和158.4h。凡纳滨对虾对低温反应敏感,7～11℃的持续胁迫均能导致其死亡,但死亡历时时域不一,7和11℃持续胁迫下,其死亡历时时域分别为24.4和145.1h,即死亡历时随胁迫温度的降低而缩短。5个低温持续期内凡纳滨对虾的死亡率与死亡历时回归方程R2的置信度均高于0.9500,在7、9、11℃持续胁迫下,凡纳滨对虾死亡率与死亡历时的关系均符合幂函数方程,其幂函数指数分别为1.2751、1.0508和1.1173;而8和10℃持续胁迫下,死亡率与死亡历时的关系曲线更符合多项式。【结论】凡纳滨对虾不耐低温,低温胁迫致死过程有一定持续期,但死亡速度随胁迫温度的降低而加快,因此养殖过程遇低温季节应加强应急管理,最大限度规避寒害风险:胁迫温度较低(7℃)时,须在短时间内完成应急管理,最长应急处理时间为1d;胁迫温度较高(11℃)时,可适当延长应急管理,但最长应急处理时间不宜超过6d。

南美白对虾白便综合征病原霍乱弧菌的分离与药敏试验

为确定南美白对虾白便综合征的病原菌及其药物敏感性,采用传统方法从患白便综合征的南美白对虾肝胰腺中分离到病原菌菌株BB31,结合API 20E革兰阴性菌鉴定系统、16SrDNA序列及聚类分析对菌株BB31进行了鉴定,并通过纸片琼脂扩散法对菌株BB31的药物敏感性进行了测定。结果表明,菌株BB31为霍乱弧菌（GenBank登录号：KF446244）,其16SrDNA序列与GenBank数据库中弧菌菌株的16S rDNA序列有99%～100%的同源性,而且与霍乱弧菌菌株RD1（GenBank登录号：KF307775）的亲缘性最近。菌株BB31对四环素、庆大霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等抗生素的敏感性高,对磺胺甲氧嘧啶、呋喃唑酮、复方新诺明等抗生素不敏感。本研究证实霍乱弧菌是南美白对虾白便综合征的病原菌,庆大霉素、诺氟沙星等常规渔药可作为防控霍乱弧菌引起的南美白对虾白便综合征的用药参考。

虾池中桡足类及其休眠卵携带对虾白斑综合症病毒的初步调查研究

探讨对虾白斑综合症（White Spot Syndrome WSS）与虾池中桡足类之间的关系，于2003年5～10月份，在暴发过对虾白斑综合症的池塘中采集桡足类样品共128个，并从冬季底泥样品分离出桡足类休眠卵样品20个，以及此种休眠卵孵化得来的桡足类幼体样品5个。利用PCR斑点杂交法以及巢式PCR法检测样品中对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus WSSV）携带情况。结果表明，5～10月份桡足类样品中均能检测到阳性样品，总的阳性率为56．3％；其中，5月份样品阳性率为37．5％，6，8，9，10月份各取样1次，每次样品中的阳性率均在60％以上。在20例桡足类休眠卵样品中有1例为阳性，阳性率为5％；并且实验室中孵化此种休眠卵得来的桡足类幼体样品中检测到阳性，阳性率为40％。本研究初步表明，桡足类是WSSV的携带者或传播媒介之一，且冬季池塘底泥中携带WSSV的桡足类休眠卵可萌发出带病毒的桡足类。

WSSV-VAP1基因克隆与序列分析

根据已测序的WSSV VAP1全基因序列设计1对引物,经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析,扩增出约838bp的特异条带,将其回收后克隆入pGAPZαA载体中,并进行序列测定与分析。结果表明,扩增序列与GeneBank登录序列(GenBankNo AF411634)核苷酸同源性100%。序列分析表明,WSSV VAP1基因编码蛋白无跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和糖基化位点,并含有RGD序列,预示其为WSSV浸染中的一个重要蛋白。