丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子/增强子的研究

目的 :探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法 :以重组质粒pcDNA3 core(含有HCV核心蛋白编码基因 )转染HepG2细胞 ,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,检测 β 半乳糖苷酶表达活性 ,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子 /增强子功能的影响。结果 :质粒pcDNA3 core在HepG2细胞瞬时表达核心蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 core组 β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 5 4倍。结论 :HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子 /增强子的特性 。

丙型肝炎病毒核心蛋白活化NF-κB介导的信号传导途径

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core protein)致病作用的细胞内信号传导途径。方法将人HCV核心蛋白cDNA克隆至载体pCXN2上，经基因测序及转染Cos-7细胞后检测核心蛋白表达等方法选出构建成功的pCXN2-core重组质粒，用该质粒分别与环AMP反应分子(CRE)、血清反应因子(SRF)、血清反应分子(SRE)、活化蛋白-1(AP-1)及核转录因子κB (NF-κB)重组表达质粒共转染Hela细胞，通过检测转染后细胞内荧光素酶活性确定与核心蛋白作用的因子。结果HCV核心蛋白可激活NF-κB介导的信号传导途径，且随着pCXN2-core转染量的增多，NF-κB被活化的程度也升高，两者呈剂量依存关系。结论HCV核心蛋白通过活化NF-κB介导的细胞内信号传导途径发挥其致病作用。

丙型肝炎病毒核心蛋白对胆管癌细胞NFAT1基因表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV C)是否通过调控转录因子NFAT1的表达参与肝内胆管癌的发展及恶性生物学行为。方法构建表达HCV C核心蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-HCV C,通过瞬时转染pEGFP-N3-HCV C质粒,RT-PCR检测肝内胆管癌RBE细胞中NFAT1 mRNA的表达情况,Western blot检测NFAT1蛋白的表达情况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期变化情况。结果转染HCV C后胆管癌细胞NFAT1基因的mRNA及蛋白表达明显上升,差异具有显著性(P<0.05);HCV C能够促进细胞向G2/M期进展及使细胞增殖能力增加。结论 HCV C可上调胆管癌细胞中NFAT1基因的表达,促进细胞周期进展及胆管癌细胞增殖,可能与肝内胆管癌的发展有关。

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP2的克隆

目的:筛选与克隆 HCV 核心蛋白反式激活新型靶基因.方法:以 HCV 核心蛋白表达质粒 pcDNA3.1(-)-core 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取 mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染 pcDNA3.1(-)-core 的 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:新基因命名为 TAHCCP2,编码序列全长为429个核苷酸(nt),编码产物由142个氨基酸残基(aa)组成,测序证实 TAHCCP2克隆正确.在 GenBank 中注册,注册号为 AY039043.结论:筛选与克隆 HCV 核心蛋白反式激活新型靶基因TAHCCP2,为进一步研究 HCV 核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

丙型肝炎病毒核心蛋白对HepG2细胞生长周期的影响

目的:构建丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-core-1b)真核重组质粒,获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,观察HCV-core-1b对HepG2细胞株生长周期及cyclin D1和pRb/p130表达的影响,探讨丙型肝炎病毒慢性感染的可能机制。方法:将HCV-core-1b亚克隆入pBabe-Flag-puro载体,获得重组质粒pBabe-Flag-HCV-core-1b;将重组质粒转染病毒包装细胞Pheonix 293T,筛选获得分泌HCV-core-1b的病毒包装细胞株。利用包装细胞产生的病毒上清感染靶细胞,筛选后获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,流式细胞仪检测靶细胞生长周期的变化,Western blotting检测cyclin D1和pRb/p130蛋白的表达。结果:基因测序确认HCV-core-1b亚型基因编码区完整无移位,与标签蛋白Flag形成融合蛋白。HepG2-HCV-core细胞株成功表达Flag-HCV-core-1b蛋白,并导致细胞cyclin D1和pRb/p130的水平下调,显著改变了HepG2细胞生长周期,使细胞阻滞在G0/G1期。结论:成功构建了pBabe-Flag-HCV-core-1b真核表达质粒,获得稳定表达Flag-HCV-core-1b融合蛋白的HepG2细胞。由于HCV-core-1b蛋白的表达,下调了HepG2细胞cyclin D1和pRb/p130的表达,显著抑制HepG2细胞生长周期。

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠,为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠,以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用,为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础,更为丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40 polyA的转基因载体pTRE-HCV-C,以显微注射的方法将1.153kb的转基因片段注入BALB/C母鼠的受精卵,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的另一品系转基因小鼠杂交,得到子代F1小鼠,通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠,以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后,得到子代F1小鼠,特定时间与DOX作用后,小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明,TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠,可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定

目的用含丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体,并进行人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定。方法PCR扩增含HCV core蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。扩增人胎肝cDNA文库并纯化、鉴定。结果获得含HCVcore蛋白的cDNA片段,并成功克隆入pGBKT7中。待转化的人肝cDNA文库滴度在5×108左右,纯化后的质粒DNA质量浓度约1 g/L。用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切显示插入片段大小不一。结论成功构建了核心蛋白的酵母双杂交诱饵载体;扩增、纯化的人胎肝cDNA文库的多样性很好,适合于筛选。为用酵母双杂交技术研究与HCV core蛋白相互作用的蛋白打下坚实基础。

丙型肝炎病毒核心蛋白细胞内信号传导途径的探讨

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白致病作用的细胞内信号传导途径 (STPs)。方法 在前期工作已证实HCV核心蛋白激活NF κB介导的细胞内STPs这一结论的基础上 ,对核心蛋白活化NF κB的机制和作用位点进行了测定。用 0 .4μgpCXN2 core与 pNF κB共转染Hela细胞 3h后分别加入 5mmolIKKβ的抑制剂乙酰水杨酸和 2 5 μmol消炎痛 (作为对照 )各 0 .5ml ,继续转染 3 3h ,测定荧光素酶比活性 ,以此检测乙酰水杨酸对NF κB介导的STPs的抑制作用。以 pCXN2 core转染Cos 7细胞 3 6h ,收获细胞溶解液 ,用Western印迹分析检测IκBα表达 ,确定IκBα的降解情况。用pCXN2 core、pMEKK△ (表达非活性MEKK的质粒 )、pNF κB共转染Hela细胞 3 6h ,测定荧光素酶比活性 ,确定HCV核心蛋白是否通过MEKK活化NF κB介导的STPs。结果 ( 1)HCV核心蛋白活化NF κB介导的STPs被乙酰水杨酸抑制 ;( 2 )pCXN2 core转染后的细胞溶解液中IκBα的量较pCXN2 转染后的少 ;( 3 )HCV核心蛋白活化NF κB介导的STPs的作用不被MEKK△阻断。结论 ( 1)乙酰水杨酸通过抑制IKK的IκBα磷酸化作用 ,抑制IκB降解 ,阻断NF κB的活化 ,表明核心蛋白作用位点可能在IKK或其上游某个部位 ;( 2 )在表达HCV核心蛋白的细胞存在IκBα降解的增加 。

丙型肝炎病毒核心蛋白对转录因子的调控作用

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是HCV病毒粒子核衣壳的组分,同时又是一种多功能蛋白。它能与胞内多种蛋白相互作用,调控NF-κB、AP-1、Sp1、Elk-1、STAT3、ATF-2、NF-AT等多种转录因子,影响一系列基因的表达。核心蛋白在HCV感染的病理发生和慢性化及致癌等过程中起着重要作用。

丙型肝炎病毒核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物基因转录的影响

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)基因转录的影响。方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活性,并寻找核心蛋白上调EMMPRIN转录相关的关键启动子区段。结果:HCV核心蛋白可以显著上调EMMPRIN的表达;调节EMMPRIN转录的启动子关键区段为+1～435bp,HCV核心蛋白主要通过该关键区段上调EMMPRIN的转录,并呈现剂量依赖性。结论:HCV核心蛋白有可能通过EMMPRIN启动子关键区段上调EMMPRIN的转录,从而上调基质金属蛋白酶,最终导致肝癌转移。

新基因丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的发现和研究——献礼非酒精性脂肪性肝病

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(hepatitis C virus core protein binding protein 6,HCBP6)是成军教授课题组利用酵母双杂交技术首先发现的与丙型肝炎病毒核心蛋白结合的蛋白。课题组进一步发现HCBP6可以感受肝细胞内总胆固醇与甘油三酯水平变化并调节总胆固醇与甘油三酯水平。动物模型发现,HCBP6基因敲除小鼠在高脂饮食喂养下会出现糖脂代谢紊乱。课题组进而发现韩国红参组分可通过调节HCBP6改善糖脂代谢,推动了含有该组分PTIB001的治疗非酒精性脂肪性肝病(nonalcholic fatty liver disease,NAFLD)的功能食品的问世。这些工作为基于PTIB001的治疗NAFLD药物研发提供了理论依据。

丙型肝炎病毒核心蛋白对HePG_2细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法 观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2 C和作为对照的细胞株HePG2 CMV的细胞形态 ;绘制细胞生长曲线 ;检测细胞周期 ;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA ,P16 ,P2 7,P5 3;半定量RT PCR检测P16 ,P2 7,P5 3mRNA。结果 转染重组质粒PBK HVCC的HePG2 C细胞与转染空载体PBK CMV的HePG2 CMV细胞相比细胞形态未见明显变化。生长曲线显示HePG2 细胞在转染PBK HCVC和空载体PBK CMV后 ,生长速度无明显变化。检测转染空载体的细胞HePG2 CMV 81.3%进入G0 /G1期 ,7.7%进入S期 ;而转染PBK HCVC的细胞HePG2 C 73%进入G0 /G1期 ,13.7%进入S期。在进一步分子机制的探讨中发现HePG2 C细胞PCNA、P5 3表达显著增加 ,P16、P2 7表达显著降低。同样的变化也发生在转录水平。结论 HCV核心蛋白可能通过调节某些基因的转录与表达 ,增加细胞DNA合成 ,扰乱细胞周期 ,进而参与致癌过程。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6在脂肪性肝病患者中的表达及意义

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(hepatitis C virus core-binding protein 6,HCBP6)在脂肪性肝病患者中的表达及意义。方法收集2019年8月至2020年2月首都医科大学附属北京地坛医院确诊的30例脂肪性肝病患者为研究对象,其中酒精性脂肪性肝病(alcoholic liver disease,ALD)组10例,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)组20例,另选取30例同期健康体检者为正常对照组。采用全自动生化分析仪检测血清生物化学指标,包括:丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBil)、直接胆红素(direct bilirubin,DBil)、总胆固醇(cholesterol,CHOL)和甘油三酯(triglyceride,TG)。采用Western blot和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清HCBP6水平。结果脂肪性肝病组患者ALT [(80.16±21.26)U/L vs(29.20±3.58)U/L]、AST [(97.10±20.76)U/L vs(46.30±4.52)U/L]、CHOL [(4.41±0.09)mmol/L vs(3.77±0.08)mmol/L]和TG [(1.92±0.08)mmol/L vs(1.48±0.03)mmol/L]水平均显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P均<0.05),TBil [(91.11±25.75)μmol/L vs(42.90±7.50)μmol/L]和DBil[(65.23±20.12)μmol/L vs(26.14±5.01)μmol/L]差异无统计学意义(P均> 0.05)。NAFLD组、ALD组及正常对照组ALT [(70.25±18.24)U/L vs(99.98±53.82)U/L vs(29.20±3.58)U/L]、AST[(91.35±26.09)U/L vs(98.60±35.93)U/L vs(46.30±4.52)U/L]、CHOL [(4.56±0.10)mmol/L vs(4.12±0.11)mmol/L vs(3.77±0.08)mmol/L]和TG [(1.97±0.02)mmol/L vs(1.81±0.09)mmol/L vs(1.48±0.03)mmol/L]水平差异有统计学意义(P均<0.05),TBil [(97.34±34.91)μmol/Lvs(78.67±35.21)μmol/L vs(42.90±7.50)μmol/L]和DBil [(69.34±27.35)μmol/L vs(57.01±27.24)μmol/L vs(26.14±5.01)μmol/L]差异无统计学意义(P均> 0.05)。其中,NAFLD组和ALD组ALT、AST、CHOL和TG水平均显著高于正常对照组(P均<0.05);NAFLD组CHOL水平显著高于ALD组(t=2.681,P=0.012),两组患者ALT、AST和TG水平差异无统计学意义(P均> 0.05)。脂肪性肝病组患者血清HCBP6水平显著低于正常对照组[(0.46±0.02)μg/L vs(0.67±0.03)μg/L],差异有统计学意义(t=5.737,P <0.001)。NAFLD组、ALD组及正常对照组血清HCBP6水平[(0.46±0.02)μg/L vs(0.47±0.03)μg/L vs(0.67±0.03)μg/L]差异有统计学意义(F=16.190,P <0.001),与正常对照组相比,NAFLD组和ALD组患者HCBP6水平均显著降低(t=4.871,P <0.001;t=3.520,P=0.001)。结论 HCBP6在脂肪性肝病患者,尤其是NAFLD患者外周血中呈低表达。

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的:筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索HCBP6基因表达对肝细胞基 因表达谱的影响。方法:应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinformatics)技术,筛选得到的人HCV核心蛋白结 合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1( ) HCBP6,应用抑制性消减杂交技术对 重组表达质粒pcDNA3.1( ) HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将 富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后 进行测序及同源性分析。结果:消减文库扩增后得到30个阳性克隆,菌落PCR分析显示,其中24个克隆含有200 ～1000bp插入片段。对插入片段测序,并通过生物信息学分析,结果共获得11种蛋白编码基因。结论:应用SSH 技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因,本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息,为进 一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。

丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21^(waf1)在丙型肝炎中的表达及相互关系

目的 调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白、P2 1、Bcl 2的表达以及相互间关系 ,探讨HCV核心蛋白是否抑制P2 1和促进Bcl 2表达。方法 收集 2 3例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织 ,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P2 1、Bcl 2表达 ,并用统计学方法分析三者间的表达关系。结果 HCV核心蛋白和突变P2 1的阳性表达主要位于细胞核中 ,Bcl 2的阳性表达主要位于细胞质 ;HCV核心蛋白表达阳性组织中 ,P2 1阳性表达率仅 13 % ,Bcl 2阳性表达率则达 95 .7% ,三组间比较差异有显著性 (P =0 .0 12 )。HCV核心蛋白和Bcl 2二组间比较差异无显著性 (P =0 .5 61) ;HCV核心蛋白与Bcl 2、p2 1阳性强度两者间P值分别为 0 .0 12和 0 .2。结论 三种蛋白的表达有相关性 ,HCV核心蛋白可能促进Bcl 2蛋白的表达 ,抑制P2

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白

0 引言 1989年应用分子生物学技术发现了丙型肝炎病毒(hepatitisC virus,HCV),并证实可导致肝脏慢性疾病[1,2],是输血后肝炎的主要病因.全世界有1.7亿人感染HCV,面临肝硬化和肝细胞癌的威胁[3-6].随着基因组测序工作的完成,随后就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道HCV对人体有着广泛的作用,如引起人体免疫紊乱、慢性肝炎、肝硬化、肝肿瘤发生等,但是他们是如何作用的目前不是很清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.目前鉴定的与HCV核心蛋白相互作用的蛋白有多种,为阐明HCV感染的发病机制,奠定了坚实的基础.

丙型肝炎病毒核心蛋白与JNK/SAPK信号转导通路

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是一种多功能的病毒核衣壳蛋白,对细胞信号转导途径具有明显作用,从而影响相关的靶基因。JNK/SAPK信号转导通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用,是正常与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。

丙型肝炎病毒核心蛋白激活肝门部胆管癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝门部胆管癌生长和转移的影响。方法 首先构建表达HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3-HCVcore,再将含有 pcDNA3-HCVcore的载体和不含 pcDNA3-HCV core的空载体分别导入肝门部胆管癌细胞株 QBC939中,RT-PCR和免疫组织化学检测 VEGF mRNA和蛋白表达。结果 重组质粒 pcDNA3-HCVcore在 QBC939细胞中有稳定表达;表达 HCV核心蛋白的细胞QBC939的 VEGF在蛋白水平和 mRNA水平较转染空载体的细胞QBC939明显升高。结论 HCV核心蛋白能激活VEGF表达,可能对肝门部胆管癌的生长和转移具有促进作用。