丙谷二肽合成酶的改造及性质研究

丙谷二肽是重要的营养补充剂,α-酰基转移酶(SAET)可催化丙氨酸甲酯与谷氨酰胺合成丙谷二肽。为提高该酶的pH稳定性,本实验以前期获得的SAET-QC01菌株为基础,对该菌株的关键位点A537进行饱和突变,构建了19个突变体。突变体酶学性质表明,有五个突变体的酶活比原始酶提高了10%以上,其中突变酶A537G在pH为5.0~9.0范围内酶活稳定,比原始酶(pH为8.0~8.5)更有利于反应的进行。通过同源建模发现A537位于β-折叠片中,突变后增加了主链-侧链间氢键作用力,周围小于6埃范围内氨基酸作用的数量明显减少,因此提高了其pH稳定性。

日粮添加谷氨酰胺、苏氨酸、丙谷二肽对断奶仔兔生长性能、器官发育及血清抗氧化指标的影响

旨在探讨日粮添加谷氨酰胺、苏氨酸、丙谷二肽对断奶仔兔生长性能、器官发育及血清抗氧化指标的影响。选择健康、体重相近的仔兔60窝,随机分为4组,每组5个重复,每个重复3窝,分别饲喂基础日粮(对照组),基础日粮+0.3%谷氨酰胺+0.3%苏氨酸(试验I组),基础日粮+0.6%谷氨酰胺+0.3%苏氨酸(试验Ⅱ组),基础日粮+0.06%丙谷二肽+0.3%苏氨酸(试验Ⅲ组)。试验组、对照组分别在28和35日龄时断奶,试验期21 d,记录个体重、死亡率,试验末屠宰采集血样检测抗氧化指标,记录器官重。结果表明:1)各试验组与对照组仔兔个体重无显著差异(P>0.05),试验组死亡率高于对照组。综合分析,试验Ⅱ组生长性能与对照组相近,35和49日龄个体重高于对照组,平均日增重(ADG)与对照组基本一致,仅死亡率高于对照组。2)试验Ⅲ组肝脏重量显著高于试验Ⅱ组(P<0.05),心脏、脾脏、肾脏和胃的重量各组之间无显著差异(P>0.05)。3)各组之间血清常规指标及相关酶活力无显著差异(P>0.05),日粮添加谷氨酰胺、苏氨酸、丙谷二肽后,仔兔28日龄断奶并未影响仔兔机体代谢,更未影响仔兔的健康。4)各组血清抗氧化指标无显著差异(P>0.05),但试验组血清超氧化物歧化酶(SOD)活力均有提高,其中试验Ⅱ、Ⅲ组提高了9.58%、7.62%,丙二醛(MDA)含量分别下降19.3%、16.0%。综上,在本试验条件下,28日龄断奶仔兔饲喂添加谷氨酰胺、苏氨酸或丙谷二肽日粮后的生长性能、器官发育、血清生化指标与对照组35日龄断奶仔兔相互之间无显著差异,3个试验组中,添加0.6%谷氨酰胺和0.3%苏氨酸的试验Ⅱ组比其他2个试验组效果要好,且提高了仔兔的抗氧化能力,促进仔兔机体健康。

丙谷二肽对γ射线致小鼠肺组织损伤的防护作用

目的:探讨N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽)对γ射线致小鼠肺组织损伤的防护作用及可能的作用机制。方法:将27只雄性昆明小鼠随机分为正常对照组、辐射组和丙谷二肽组,每组9只。丙谷二肽组按照1 000 mg/kg的剂量灌胃给药,1次/d,连续7 d。然后辐射组、丙谷二肽组均给予4.0 Gy60Coγ射线照射3 d,正常对照组不作处理。照射后测定小鼠肺脏指数、肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,MTT法测定肺组织细胞增殖率,AnnexinV和PI双染法测定细胞凋亡率,Western blot法检测肺组织Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:3组小鼠肺脏指数、肺组织SOD活性、细胞凋亡率、肺组织Bcl-2和Bax蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=6.352、51.459、462.790、74.434和675.500,P<0.05)。与正常对照组相比,辐射组小鼠肺组织SOD活性下降,肺脏指数升高,细胞凋亡率增加,肺组织Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高(P均<0.05)。与辐射组比较,丙谷二肽组肺组织SOD活性显著升高,细胞凋亡率降低(P均<0.05),细胞增殖率升高(t=5.294,P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著提高(t=218.920,P<0.05)。结论:丙谷二肽对60Coγ射线辐射损伤小鼠肺组织具有一定的防护作用,这种保护作用可能与调控Bcl-2、Bax表达有关。

利用重组枯草芽孢杆菌L-氨基酸连接酶合成丙谷二肽

利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE 3)克隆并表达来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 15245的L-氨基酸连接酶(L-amino acid ligase,Lal)基因,采用Ni-NAT亲和层析法分离纯化得到重组的Lal,并以L-丙氨酸和L-谷氨酰胺为底物制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(丙谷二肽).Lal属于ATP依赖酶,研究结果表明其最适反应温度和pH值分别为37℃和9.0,连续催化反应14h可催化等摩尔的底物氨基酸(30mmol/L)生成22.4mmol/L的丙谷二肽,最高摩尔转化率可达74.7%.成功克隆表达了枯草芽孢杆菌的L-氨基酸连接酶,并将其应用于丙谷二肽的酶法合成,研究结果可为丙谷二肽的生物制造奠定理论基础.

5%新型复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液(创伤用)在健康受试者中的安全性、耐受性研究——滴速考察试验

目的 观察新型复方氨基酸（19）丙谷二肽注射液（创伤用）不同滴速在健康受试者中的安全性、耐受性.方法 滴速试验采用逐渐递增的探索性研究方法.录入24例健康受试者,分为3组,每组男女各半,分别按照1.0、2.0、3.0mL/min的滴速进行给药,给药量均为500 mL,规格为250 mL：12.6 g（氨基酸/丙谷二肽）（5％）.晨起早餐后30 min经由外周静脉滴注给药.观察受试者的生命体征、实验室指标、心电图及不良事件.结果 共24例健康志愿者完成了滴速考察耐受性试验.共发生7个不良事件,其中3个可能与试验药物有关.试验中未发生严重不良事件.受试者的生命体征、实验室指标及心电图均未发现有临床意义的异常.结论 单次静脉滴注5％新型复方氨基酸（19）丙谷二肽注射液（创伤用）,在1.0 ～ 3.0 mL/min滴速范围之内,对中国健康受试者,安全且能够很好耐受.

5%新型复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液(创伤用)在健康受试者中剂量研究

目的观察不同剂量5%新型复方氨基酸（19）丙谷二肽注射液（创伤用）在健康受试者中的安全性和耐受性。方法采用剂量逐渐递增的探索性研究方法。将32例健康受试者分为A、B、C、D组各8例,每组男女各半,分别按照500,750,1 000,1 250 m L剂量静脉滴注给予5%新型复方氨基酸（19）丙谷二肽注射液,滴速2.0 m L·min^-1,早餐后30 min给药。观察受试者生命体征、实验室检查结果、心电图及不良事件。结果 32例健康受试者均完成试验,发生8例轻度不良事件,表现为血生化、尿常规指标异常和心率下降,未予处理,均自行恢复正常。受试者生命体征、其他实验室指标及心电图均未发生有临床意义的改变。结论中国健康受试者以2.0 m L·min^-1单次静脉滴注5%新型复方氨基酸（19）丙谷二肽注射液（创伤用）500-1 250 m L安全、可耐受。

重组大肠杆菌的高密度培养及在丙谷二肽生产中的应用

以表达α-酯酰基转移酶的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂,连接丙氨酸甲酯盐酸盐与谷氨酰胺合成丙谷二肽,是目前生产丙谷二肽最理想的方法。利用高密度发酵法,能提高微生物的生产量,降低二肽生产成本。首先,在摇瓶水平下,利用响应面模型对于基础培养基碳源、氮源、无机盐等因素进行研究,在此基础上,对补料培养的重要因素如补料种类、补料方式等进行研究。最后,利用高密度培养的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂进行丙谷二肽的合成。确定了最佳半合成培养基的组成为:葡萄糖质量浓度为10g/L、混合氮源质量浓度为24g/L、KH2PO4质量浓度为4.62g/L、K2HPO4质量浓度为25.08g/L;确定了溶氧反馈补料的最佳补料控制条件,在30h内,菌体OD620值最高达到了67,是优化前摇瓶培养的14倍。丙谷二肽的质量浓度达到34.56g/L,生产效率约为7g/(L·min)。研究为高效低成本生产丙谷二肽奠定了基础。

L-氨基酸连接酶偶联乙酸激酶催化合成丙谷二肽

枯草芽孢杆菌来源的L-氨基酸连接酶(YwfE)是一种ATP依赖酶,可以催化L-丙氨酸(Ala)和L-谷氨酰胺(Gln)合成丙谷二肽。为了降低反应中ATP的使用量,研究使用不同微生物来源的乙酸激酶(Ack)用于丙谷二肽合成反应中ATP的再生,发现丙酮丁醇梭菌来源的乙酸激酶Ack3和YwfE的偶联效果最好。确定最优的催化反应体系包括Ala 30 mmol/L,Gln 30 mmol/L,MgSO 450 mmol/L,ATP 5 mmol/L,ACP-Li 60 mmol/L,纯化的YwfE蛋白200 mg/L,纯化的Ack3蛋白80 mg/L。在37℃,pH 9条件下反应16 h生成24.3 mmol/L的丙谷二肽,摩尔转化率为81%,同时产生2.3 mmol/L的副产物丙丙二肽。研究表明:ATP再生系统的引入有助于提高丙谷二肽的摩尔转化率,降低催化反应的成本。

响应面法优化重组大肠杆菌全细胞催化合成丙谷二肽

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)是重要的肠外营养补充剂,有着广泛的应用。本文利用表达α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌QC01,进行全细胞催化法合成丙谷二肽。通过最陡爬坡实验筛选出对全细胞催化影响最显著的三个因素:QC01细胞浓度、底物比例和反应温度,再利用响应面实验,研究了这三个因素的交互作用。最终确定全细胞催化条件为:QC01细胞浓度3g/L、底物丙氨酸甲酯盐酸盐与谷氨酰胺的摩尔比为1∶0.6、反应温度30℃、底物浓度(以丙氨酸甲酯为准)300mmol/L、反应起始pH9.0、反应时间为40min,优化后底物转化率从22.75%提高到73.85%,为全细胞法制备丙谷二肽的工业化生产提供借鉴。

总有机碳分析方法用于复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液清洁验证效果考察

目的探讨总有机碳分析法用于复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液清洁验证的效果。方法采用棉签擦拭法擦取清洁验证样品;采用总有机碳分析法测定复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液中污染物的含量,氧化剂流速为0.1μL/min。结果N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺质量浓度在0.199~2.988μg/m L范围内与总有机碳响应值线性关系良好;检测限和定量限分别为0.01819μg/m L和0.05447μg/m L;精密度试验结果的RSD为2.92%(n=6);平均擦拭回收率为104.73%,RSD为3.83%(n=9);供试品溶液在室温下放置12 h稳定。结论该方法分析时间短、灵敏度高、结果准确,可用于复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液生产后的清洁验证。

丙谷二肽的生物合成研究进展

丙谷二肽是一种重要的氨基酸类营养补充剂,具有广泛的药理学活性,在医疗与营养健康方面具有重要的应用价值。本文对丙谷二肽的理化性质、临床应用及生物合成进行了综述,以期对丙谷二肽的生物合成具有较系统的认识。

肠外营养药物专利项目丙谷二肽投产

据新华社信息，获得中国专利授权的肠外营养药物丙谷二肽已在厦门投产。丙谷二肽合成上艺是中国科学院院士、厦门大学化学化工学院教授赵玉芬带领课题组通过三年的技术攻关，采用全新的合成路线合成出来的。该项目2004年6月成为目前该领域国内唯一获专利授权的技术成果，2004年10月获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书和药品生产许可证。

我国自行研发的丙谷二肽产品年底面世

中科院院士、厦门大学教授赵玉芬率领的科研小组研发的丙谷二肽合成新工艺即将实现产业化，预计今年年底丙谷二肽产品就可面世。

国产丙谷二肽年内有望产业化

由中科院院士赵玉芬主持研发的丙谷二肽合成新工艺即将实现产业化，成本只有国外产品1／4至1／3的丙谷二肽产品将于年底问世。届时，具有价格优势的丙谷二肽将进入被进口产品长期垄断的市场。

丙谷二肽的合成研究进展

丙谷二肽(L-alanyl-L-glutamine,Ala-Gln)是一种重要的二肽,其在体内可分解为L-谷氨酰胺(L-Gln),该氨基酸具有不可替代的生理生化作用。传统化学法合成Ala-Gln存在污染高、转化率低、纯度低等缺点,并伴随有毒副产物产生,这限制了其规模化应用。随着生物学的快速发展,研究者们解析了Ala-Gln的合成方式,并对菌株进行了定向改造,为绿色高效生产Ala-Gln开启了新纪元。主要对Ala-Gln的应用、传统化学法和生物法合成Ala-Gln的研究进展进行综述,旨在探索如何利用合成生物学、基因组学等学科技术改造Ala-Gln的代谢途径,高效生产Ala-Gln,为Ala-Gln产业化提供理论基础。

基于金属有机沸石咪唑骨架的固定化细胞的制备及其在丙谷二肽制备中的应用

来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)中的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase, SAET),是目前发现的丙谷二肽催化合成能力最高的酶之一,能够以非保护的L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺[即丙谷二肽(L-alanyl-L-glutamine, Ala-Gln)]。为了解决其在催化过程中的稳定问题,本研究在水相体系中采用“一步法”快速制备固定化细胞(SAET@ZIF-8),在构筑金属有机沸石咪唑骨架结构(ZIF-8)的同时,将表达有SAET的大肠杆菌(Escherichia coli)包裹在其内部空间中。在此基础上,对其结构、催化活性和重复使用性及储存稳定性等催化性能进行探究。结果表明,通过该方法制备的SAET@ZIF-8纳米颗粒与文献报道的ZIF-8材料的形貌基本相同,细胞的引入没有明显改变ZIF-8的形貌。重复使用7次后,SAET@ZIF-8仍能保持67%左右的初始酶活;室温下放置4d时,固定化酶还保留有50%左右的初始酶活,表明SAET@ZIF-8具有较好的重复使用及储存稳定性。将SAET@ZIF-8用于丙谷二肽的催化实验中,当反应30min后丙谷二肽的浓度达到62.83mmol/L(13.65g/L),时空产率达到0.455 g/(L·min),相对于谷氨酰胺的转化率为62.83%。以上结果表明,基于金属有机沸石咪唑骨架的固定化细胞是一种高效制备丙谷二肽的方法策略。

丙氨酰谷氨酰胺二肽对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用

目的观察丙氨酰谷氨酰胺二肽(丙谷二肽)对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法在以低氧低糖培养人脐静脉内皮细胞ECV304为细胞损伤模型的基础上,以噻唑蓝(MTT)比色法优化丙谷二肽的最佳作用浓度,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测线粒体膜电位。自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,比色法检测谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的浓度,RT-PCR方法检测细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、热休克蛋白70(HSP70)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA的表达。结果丙谷二肽能够使细胞在缺氧缺糖应激下存活率增加,线粒体损伤减轻,LDH分泌降低,GSH产生增加,HSP70和HIF-1αmRNA的表达增加。结论丙谷二肽对细胞缺氧缺糖损伤有明显的保护作用,这种保护作用可能与保护线粒体、维持细胞膜结构完整、上调细胞中应激基因HSP70和HIF-1α的表达有关。

新型复方氨基酸(19) 丙谷二肽注射液临床耐受性试验

目的评价健康人体对新型复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液(创伤用)的耐受性。方法 48名健康受试者,男女各半,分三部分试验,均经静脉给药。滴速耐受性试验纳入24名受试者,随机分为3组,滴速设为1、1.5、2 mL·min^(-1);剂量耐受剂量试验纳入18名受试者,随机分为3组,剂量分别为500、750、1 000 mL;全静脉营养液滴注试验纳入6名受试者,滴速不超过3 mL·min^(-1)。观察受试者用药前后生命体征、心电图及实验室检查的变化,并记录不良事件。结果滴速耐受性试验、剂量耐受剂量试验和全静脉营养液滴注试验中受试者用药前后生命体征、心电图和实验室检查均未出现有临床意义的改变。共有13名受试者出现轻度不良事件,表现为血管胀痛、头胀、眼干等,未予处理,均自行缓解。结论健康受试者静脉滴注新型复方氨基酸(19)丙谷二肽注射液(创伤用),滴速1～2 mL·min^(-1)、剂量500～1 000 mL,全静脉营养液1700 mL,滴速≤3 mL·min^(-1),可安全耐受。