乌梢蛇醇溶蛋白质提取工艺优化及其指纹图谱表征

目的优化乌梢蛇醇溶蛋白质提取工艺,并对其进行指纹图谱表征。方法在单因素试验基础上,以料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间为影响因素,提取率为评价指标,响应面法优化提取工艺,再进行FTIR、SDS-PAGE分析。结果最佳条件为料液比1∶43.15,乙醇体积分数46.35%,提取温度37.53℃,提取时间250min,提取率为0.4072%。醇溶蛋白质在4000~400cm-1波数范围内有10个吸收峰,并且其种类丰富,分子量在11.19~158.10kDa范围内,其中26.48、19.67kDa为指纹图谱主峰。结论本实验可为乌梢蛇开发利用及分析鉴定提供依据。

基于网络药理学和分子对接探讨狗脊-乌梢蛇药对治疗类风湿关节炎的机制

目的探讨狗脊-乌梢蛇药对治疗类风湿关节炎的主要活性成分、关键靶点和信号通路。方法使用SymMap和ETCM数据库筛选狗脊-乌梢蛇药对的主要活性成分,SwissTargetPrediction在线预测药物靶点,在DisGeNet数据库中检索类风湿关节炎的靶点,通过venny获得重合的潜在靶点。使用Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-成分-靶点”的网络。运用STRING作蛋白互作分析,Cytoscape筛选关键靶点。运用DAVID对关键靶点进行GO功能分析和KEGG信号通路分析。最后使用AutoDock Vina进行分子对接,Pymol可视化部分结果。结果共筛选出药对11个主要活性成分,12个关键靶点,105条信号通路。柚皮素、山柰酚、亚油酸等是主要的活性成分,MAPK3、MAPK1、IL2、IL6、AKT1等是治疗疾病的关键靶点。涉及PI3K-Akt、TNF、JAK-STAT等信号通路的调控。分子对接结果提示药物主要活性分子和关键靶点能自然结合。结论狗脊-乌梢蛇药对可能通过多个生物过程以及多个信号通路参与调控细胞凋亡、抑制炎症反应、调节免疫等过程治疗类风湿关节炎。

乌梢蛇配方颗粒与常见三种伪品的多重PCR鉴别研究

目的:建立乌梢蛇、王锦蛇、百花锦蛇、灰鼠蛇药材及水提物四重位点特异性聚合酶链反应(PCR)鉴别方法,为配方颗粒的掺伪鉴别提供依据。方法:以线粒体细胞色素C氧化酶1号(CO1)基因为靶基因,设计特异性引物,优化引物最适退火温度、循环次数、聚合酶种类,并用该方法进行混合样品的检测。结果:乌梢蛇、王锦蛇、百花锦蛇、灰鼠蛇聚合酶为Multiplex PCR 5×Master Mix,退火温度为60℃,循环次数为35次时分别扩增出133、180、247、197 bp的特异性条带,空白对照无条带。该方法能同时、准确地鉴定出混合样品的蛇源成分。结论:本方法可同时、准确、快速地鉴定乌梢蛇、王锦蛇、百花锦蛇、灰鼠蛇样品,并适合标准汤剂和配方颗粒样品鉴别。

乌梢蛇和金钱白花蛇中43种无机元素含量差异及判别分析

采用微波消解法处理样品,ICP-MS和ICP测定蛇中43种无机元素含量,利用主成分分析、正交偏最小二乘判别分析和线性判别分析对乌梢蛇、酒乌梢蛇、金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇中无机元素含量数据进行统计分析。结果表明:Li、Cr、Mn、Ni、Zr、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Gd、Tb、Dy、Ho和Tm 16种元素在4种蛇样品中相对含量趋势基于一致,4种蛇样品中,乌梢蛇中Cu、Ti含量高,Zn含量低,酒乌梢蛇中V、As、Mo、Cd、Sb、Co、Sr、Ba含量高;金钱白花蛇中Lu含量高,酒炒金钱白花蛇中Ga、Fe、Al含量高,不同蛇样品具有独特的无机元素含量。主成分分析提取的5个主成分,累计方差贡献率为84.38%;主成分分析和OPLS-DA可以完全区分乌梢蛇和金钱白花蛇;线性判别模型对乌梢蛇、酒乌梢蛇、金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇的判别正确率为100%.实验结果证明基于蛇样品中无机元素含量所建立的判别模型可以有效的识别乌梢蛇、酒乌梢蛇、金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇,为蛇的真伪、分类判别提供基础数据和技术支撑。

中药材乌梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鉴别

ＤＮＡ序列分析鉴别是中药材品种鉴定的新方法［１］，已应用于海马、龟甲、鳖甲等中药材的鉴定［２～７］。目前商品流通中乌梢蛇（ＺＡＯＣＹＳ）药材的混淆品种类较多，游蛇科（Ｃｏｌｕｂｒｉｄａｅ）的常见种类都有可能被当作乌梢蛇制成药材，品种鉴定困难［８］。而...

高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品

目的建立一种简便、准确的乌梢蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法根据乌梢蛇及10种常见混淆品线粒体12SrRNA基因序列,设计一对专用于乌梢蛇的鉴别引物HWL-1和HWH-1,用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场上购买的各种乌梢蛇药材。结果PCR结果是在65℃复性温度下,正品乌梢蛇得到约320 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。为检验该方法的准确性,对市售乌梢蛇炮制品随机选取13块进行PCR鉴别验证,其中正品9块,混淆品4块,检出率达100%。结论所设计的鉴别引物对正品乌梢蛇有高度的特异性。PCR方法稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果无影响。本方法简单、准确、快速、灵敏度高、重现性好。

乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白对大鼠佐剂型关节炎滑膜细胞因子的作用

目的:观察乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白(tyPeⅡcollagen,CⅡ)对大鼠佐剂型关节炎(adjuvant arthritis,AA)滑膜细胞因子的作用。方法:限制性胃蛋白酶降解法提取乌梢蛇CⅡ,SDS-PAGE凝胶电泳法和紫外分光光度计法鉴定;采用完全弗氏佐剂(complete Freud′s adjuvant,CFA)足垫皮下注射诱导AA大鼠模型;收集滑膜细胞上清液,L929细胞毒性法检测滑膜细胞上清液中TNF-α生物活性,MTT法检测滑膜细胞上清液中IL-1β生物活性;ELISA法检测滑膜细胞上清液细胞因子水平。结果:提取的CⅡ分子量约为118kD^120 kD,紫外光谱吸收仪测定提取的CⅡ吸收峰为230nm,均与标准的牛鼻中隔CⅡ相符;乌梢蛇CⅡ各剂量组体外对滑膜细胞上清液TNF-α和IL-1β活性没有直接作用;乌梢蛇CⅡ中剂量组可抑制AA大鼠的滑膜细胞和派氏淋巴结共培体系上清液TNF-α和IL-1β活性(P<0.01),乌梢蛇CⅡ低、高剂量可抑制AA大鼠的滑膜细胞和派氏淋巴结(PP)共培体系上清液IL-1β活性(P<0.05);灌服乌梢蛇CⅡ低、中剂量组与模型组比较,TNF-α活性下降(P<0.05);中剂量组与模型组比较,IL-1β活性下降(P<0.05);模型组与空白对照组比较,滑膜上清液TNF-α和IL-1β水平显著升高(P<0.01);乌梢蛇CⅡ中、高剂量组与模型组比较,均能抑制滑膜上清液TNF-α和IL-1β水平(P<0.01);乌梢蛇CⅡ低剂量组能显著抑制滑膜上清液IL-1β水平(P<0.01);乌梢蛇CⅡ中剂量能显著升高滑膜上清液TGF-β(P<0.01);结论:乌梢蛇CⅡ体外对滑膜细胞炎症因子无直接作用,灌服乌梢蛇CⅡ可以抑制滑膜细胞炎症因子的水平和活性。

乌梢蛇药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究

目的：建立乌梢蛇的HPCE指纹图谱分析方法,并比较乌梢蛇药材的一致性。方法：未涂层石英毛细管柱（65 cm×50μm,55 cm）,在80 mmol·L-1硼砂-0.2 mmol·L-1硼酸（p H 8.8）,分离电压18 KV,柱温25℃,检测波长230 nm,压力进样,压力30 mbar,时间3 s。测定10批乌梢蛇药材的HPCE图谱,30 min内完全分离。结果：建立乌梢蛇药材的HPCE指纹图谱,共有7个共有峰,通过与共有模式比较,10批乌梢蛇药材的相似度在0.865~0.987;方法学考察符合要求。结论：10批乌梢蛇药材基本一致;该方法具有良好的精密度和分离效果可作为乌梢蛇药材质量评价的有效方法。

HPLC法测定商品乌梢蛇中核苷类成分的含量

目的：建立HPLC法测定乌梢蛇药材中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤的含量。方法：采用高效液相色谱法。色谱条件为DoamonsilC18（5μm,200mm×4.6mm）柱,以0.05mol/L磷酸水溶液（pH=8.4）为流动相;检测波长为254nm;流速：1mL/min。结果：尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤分别在0.06-0.14μg、0.17-0.50μg、0.27-0.6μg范围内具有良好线性关系（r分别为0.9996、0.9998、0.9996）;平均加样回收率分别为102.0%、98.4%、100.3%;RSD分别为2.10%、2.67%、2.89%。结论：该法可用于测定乌梢蛇药材中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤的含量,从而控制乌梢蛇药材的质量。

乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白的鉴定及其对胶原诱导性关节炎小鼠的干预研究

目的：分析乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白（Zaocys type Ⅱ collagen，ZC Ⅱ）与其他物种Ⅱ型胶原蛋白（C Ⅱ collagen）的同源性，探讨其对胶原诱导性关节炎（Collagen—induced arthritis，CIA）小鼠关节炎症的影响。方法：采用限制性胃蛋白酶消化法提取ZCⅡ；SDS—PAGE凝胶电泳及紫外分光光度计法对其鉴定，质谱分析其同源性。鸡CⅡ小鼠尾根部皮下注射诱导CIA模型；口服ZCII高、中、低剂量干预，视觉评分法对关节炎评分，HE染色评价小鼠膝关节病理变化。结果：提取的ZCU分子量约为110～140kD，紫外吸收峰为230nm左右；质谱分析所得肽质量指纹图谱与其他物种有4个以上肽段匹配，蛋白评分大于95％。在关节炎症方面，与正常对照组比较，CIA小鼠关节炎及组织病理学评分升高（P〈0．05）；与CIA模型组比较，不同剂量ZCU干预组关节炎及组织病理学评分显著降低（P〈0．05）。结论：质谱分析结果提示ZCⅡ与其他物种CⅡ具有较高同源性；ZCII能显著抑制CIA小鼠的关节肿胀，改善关节组织病理变化。

乌梢蛇精巢显微结构的年周期变化

用光镜观察了乌梢蛇(Zaocys dhumnades)精巢显微结构的年周期变化,并结合精巢重量、精巢体积及精巢系数的年周期变化探讨了其生殖规律。结果表明,乌梢蛇精巢重量、精巢体积、精巢系数、曲细精管直径、生精上皮厚度及组成均具有明显的季节性变化。据此将乌梢蛇精巢的年周期活动划分为6个时期,其精子发生属于非连续型,生殖周期的类型属于交配后型。用精巢系数的年周期变化作为参数来判定精子发生进程是可靠的。

乌梢蛇的化学成分研究

目的研究乌梢蛇的化学成分。方法采用硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析进行分离纯化,通过理化性质和波谱数据分析进行结构鉴定。结果从乌梢蛇的甲醇提取物中分离了6个化合物,分别为brachystemidines A(Ⅰ)、邻苯二甲酸丁酯异丁酯(Ⅱ)、二氢阿魏酸(Ⅲ)、β-谷甾醇(Ⅳ)、胸腺嘧啶(Ⅴ)和4-羟基苯甲醛(Ⅵ)。结论所有化合物均为首次从该动物中分离得到。

乌梢蛇的人工孵化与冬眠前的人工饲养

室内人工孵化乌梢蛇卵16 7枚。平均卵重10 . 4 1g ,孵化出幼蛇14 2条,孵化率85 % ,其中11枚未受精,受精率93. 5 %。对幼蛇做了形体度量,挑选活泼健康的幼蛇98条,平均体重6 . 2 6±0 . 89g ,随机分成3组进行人工饲养,一组为群体饲养,另两组为单个饲养。开口饲料采用两种处理,一种是人工填喂瘦猪肉,另一种是饲喂活幼体泽蛙。饲养时间为冬眠前两个月。群体饲养组冬眠前平均增重率达4 0. 4 % ,单个饲养组平均增重率达4 6. 5 % ,未达差异显著(P >0 . 0 5 )。结果表明。

动物药整理研究——乌梢蛇

乌梢蛇是我国传统动物药材之一,在几千年的中医药发展史中以其特有的功效一直沿用至今,具有祛风湿、通经络、定惊止痉等功效。根据其传统功效,临床上主要将其用于风湿顽痹、麻木拘挛、抽搐痉挛、破伤风症、麻风疥癣、瘰疬恶疮等症的治疗。可见研究乌梢蛇的传统药用规律是指导现代临床用药的依据。

乌梢蛇胃上皮的组织学研究

用光镜和电镜观察了乌梢蛇胃上皮的组织结构 ,结果表明 ,①胃表面上皮均为单层柱状上皮 ,上皮细胞上部充满电子密度较高的椭圆形或杆状黏液颗粒 ,PAS反应呈强阳性 ;②胃体及幽门区上皮分别内陷形成单管状的胃底腺和幽门腺 ,无贲门腺 ;③胃底腺腺管分颈部和颈下部 ,颈部上皮细胞充满电子密度较低的近圆形的黏液颗粒 ,PAS反应呈强阳性 ,颈下部上皮细胞均分泌酶原颗粒 ,PAS反应呈阴性 ;④幽门腺细胞中亦充满电子密度较低、近圆形的黏液颗粒 ,PAS反应呈强阳性 ;⑤胃腺上皮细胞之间和腺细胞基部有不同类型的内分泌细胞分布。本文认为 ,乌梢蛇胃的消化能力较弱 ,其胃的进化在爬行动物中处于较低等的地位。

乌梢蛇及其常见伪品的鉴别研究

目的:鉴别乌梢蛇及其5种常见伪品红点锦蛇、黑眉锦蛇、滑鼠蛇、灰鼠蛇、赤链蛇。方法:采用紫外吸收光谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行研究。结果:紫外吸收光谱法中,正品乌梢蛇与其伪品的石油醚浸出液吸收曲线的最大吸收峰峰形、波长及吸收峰数目均有一定差异;聚丙烯酰胺凝胶电泳法中,乌梢蛇及其伪品的电泳结果也有一定差异。结论:紫外吸收光谱法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法均可用于乌梢蛇及其常见伪品的鉴别。

乌梢蛇的胶束电动毛细管色谱指纹图谱研究

乌梢蛇具有祛风、通络、止痉功能，其鉴别方法主要有薄层色谱法和电泳法。毛细管电泳（CE）的分离柱效与样品分子的扩散系数呈反比，比较适合分离含蛋白质、多肽的动物药。CE已用于海马、海龙、牛黄的鉴别和鸡内金、鸭内金、穿山甲、狗脊等的蛋白多肽的分析等。

地龙、乌梢蛇对系膜增生性肾炎大鼠诱导型一氧化氮合酶、内皮素-1表达的影响

目的观察地龙、乌梢蛇对系膜增生性肾炎(MsPGN)大鼠诱导型一氧化氮合酶(iN-OS)、内皮素-1(ET-1)表达的影响,探讨其治疗作用及机制。方法用改良慢性血清病法制备MsPGN大鼠模型,以地龙、乌梢蛇高低剂量灌胃,设正常对照组及模型组,治疗8周后测血白蛋白(ALB)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),观察肾脏病理变化及iNOS、ET-1表达。结果与正常对照组比较,模型组24 h尿蛋白、Scr及BUN升高(P<0.01)而ALB降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组24 h尿蛋白、Scr及BUN降低(P<0.05)且ALB升高(P<0.01),降24 h尿蛋白和升ALB作用地龙高剂量组优于低剂量组(P<0.05)。iNOS、ET-1表达水平模型组高于正常对照组(P<0.01),各治疗组低于模型组(P<0.01)。结论地龙、乌梢蛇均能降低MsPGN大鼠蛋白尿,升高ALB,地龙高剂量优于低剂量,乌梢蛇高、低剂量差异无统计学意义(P>0.05),二药均可降低Scr、BUN,其机制可能与抑制iNOS、ET-1在肾组织表达有关。

乌梢蛇血清对小鼠白细胞数和NK细胞活性的影响

目的 :探讨乌梢蛇血清对小鼠免疫功能的正向调节作用。方法 :正常BALB/C小鼠与环磷酰胺处理小鼠分别灌服乌梢蛇血清 2 0d ,测定外周血白细胞数与NK细胞活性。结果 :乌梢蛇血清能升高小鼠白细胞数与NK细胞活性 ,对环磷酰胺诱发的NK细胞活性降低有恢复作用。结论 :乌梢蛇血清对机体免疫功能具有正向调节作用。

乌梢蛇鉴别技术研究

乌梢蛇,出自《本草纲目》,又名乌蛇,始载于《开宝本草》,主要在中国分布,国外未见报道。乌梢蛇作为的临床功效确切的中药材,其质量鉴别技术至关重要。全文就20年来鉴别技术的研究发展,从传统技术和现代鉴别技术2个方面阐述,主要包括性状、显微、色谱法、PCR技术以及电泳等鉴别方法。对近年来乌梢蛇基于PCR技术,开发一系列高效、准确的分子水平的鉴别方法及基于化学成分分析,高效毛细管电泳技术的应用进行了总结概述,为以后蛇类鉴别技术的发展以及研究奠定了基础,也为动物药的质量保证的提供参考。