犬实验性感染乙脑病毒的研究

为探讨犬感染乙型脑炎病毒(JEV)的免疫应答及临床症状。用乙型脑炎病毒强毒株贵州分离株(JEV GZ株)和乙型脑炎病毒弱毒株(SA14-14-2株)感染3月龄比格犬,感染一定时间后检测血液中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)水平和T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+T淋巴细胞变化;RT-PCR检测血液中的乙脑病毒;制作组织切片观察组织病变情况。乙型脑炎病毒强、弱毒株感染犬后,犬血清中IgM、IgG、TNF-α、IFN-γ水平升高,CD4+/CD8+比值升高;RT-PCR未检出病毒;组织切片无明显病变。犬感染乙型脑炎病毒强、弱毒株后,可产生免疫应答,无临床症状,且在组织中未检出病毒。因此,犬作为与人紧密接触的伴侣动物,非常适合作为评估人类JEV感染风险的哨兵动物。

空斑减少中和试验测定血清抗乙脑病毒抗体

目的 对比空斑减少中和试验与反向被动血凝抑制试验在评价人血清抗乙脑病毒抗体时测定结果的异同。方法 对 4 5 0名 6～ 10岁儿童接种灭活乙脑疫苗前后的血清样本用两种方法进行了测定。结果 两种方法在测定免前人血清抗乙脑病毒抗体时存在显著性差异 ,在测定免后人血清抗乙脑病毒抗体时两者没有差异。结论 空斑减少中和试验比反向被动血凝抑制试验在测定人血清抗乙脑病毒抗体时灵敏。

复合RT-PCR检测猪乙脑病毒和猪流感病毒方法的建立

根据GenBank上已发表的猪乙脑病毒(JEV)的E基因序列和猪流感病毒(SIV)的NP基因序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了JEV和SIV的单项RT-PCR诊断方法,通过对扩增条件的筛选,最终成功地建立了JEV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,利用一次RT-PCR反应,即可同时扩增JEV的349 bp和SIV 155 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)核酸扩增结果为阴性,对JEV和SIV的最低检出量分别为100和10 pg的cDNA.该方法适合对JEV和SIV的联合检测和鉴别诊断.

浙江省猪血清中乙脑病毒的分离鉴定及抗体的测定

目的对浙江嘉兴地区采集的猪血清进行乙型脑炎病毒分离鉴定以及了解该地区猪感染乙型脑炎病毒的状况。方法在浙江省嘉兴地区采集猪血清标本,利用病毒分离方法检测猪血清是否携带乙脑病毒,利用间接免疫荧光法对猪血清进行抗体检测。应用荧光定量RT-PCR方法对新分离病毒进行鉴定;设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM—E基因,并对新分离病毒进行基因分型和E基因的分析。结果共采集240份猪血清标本,抗体检测阳性率为61.6%。其中6月中旬50%以上的猪乙脑病毒抗体呈阳性。分离出3株病毒。经荧光定量RT-PCR鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因I型乙脑病毒。对这2株乙脑病毒的E基因区段进行分析,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性均为100%。与疫苗株SA14-14-2相比,核苷酸同源性在87.7%,氨基酸同源在97.0%以上。结论浙江省嘉兴地区猪群中存着乙脑病毒的隐性感染或曾经感染过,提示在该地区自然界中存在着乙脑病毒。

乙脑病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立适用于检测人用猪源性生物制品中外源性乙脑病毒(JEV)的嵌套式RT- PCR方法。方法 根据已公布的JEV序列(GenBank登录号为M5 5 5 0 6 ) ,设计合成两对引物,对JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞抽提RNA进行RT PCR和RT nestedPCR ,将PCR产物进行了克隆测序;同时对猪细小病毒(PPV)、猴空泡病毒4 0 (SV4 0 )及正常乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞提取核酸进行PCR ,并对2 10份临床样品进行了检测。结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,JEV感染的乳鼠脑组织和培养JEV的BHK 2 1细胞均扩增出10 15bp和6 2 2bp目的基因片段,而PPV、SV4 0及未感染JEV的乳鼠脑组织、正常BHK 2 1细胞、PK15细胞、BSC 1细胞均未见特异性扩增条带,2 10份猪组织样品中未检出阳性样品。RT nestedPCR检测的最低限度为10PFU病毒。从样品核酸的提取到PCR扩增及检测结果的报告可在8小时内完成。结论 本研究建立的RT NestedPCR方法具有快速、特异、敏感、可靠的特点,可用于人用猪源性生物制品中外源性JEV的污染检测。

重庆三峡库区2012年乙脑病毒分离株基因序列分析

目的通过分析2012年重庆三峡库区蚊虫中分离乙脑病毒株PrM及E基因序列，揭示毒株的遗传特性。方法对新分离乙脑病毒的PrM及E基因进行PCR扩增，将扩增产物测序。用分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析，并绘制系统进化树。结果新分离的8株乙脑病毒株均为基因I型，与我国其他省市的既往分离株进化关系较近；分离株与减毒活疫苗株SA14—14—2相比较，PrM区核苷酸同源性在85．1％～86．7％之间，氨基酸同源性在95．1％～96．3％之间；E基因区核苷酸同源性在87．6％～87．8％之间，氨基酸同源性在96．9％～97．1％之间。所有新分离株与疫苗株在E基因存在14个氨基酸差异位点。结论2012年8株重庆乙脑分离株为基因I型，在E基因区域与疫苗株相比有部分差异。

福建省2005-2008年临床乙脑病毒分离株的序列分析

目的分析2005-2008年福建乙脑病毒毒株的部分基因组序列,探索乙脑病毒临床分离株的变异和进化。方法临床标本(血清或脑脊液)接种BHK-21细胞,分离乙脑病毒,从培养液上清提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒基因组片段,并进行克隆、测序以及序列分析。结果共分离到5株乙脑病毒。对病毒C/prM区240bp和全长E基因的序列分析表明,近几年的这些临床分离株基因型仍然全部属于G3型。种系发生分析结果显示,新分离株与2002、2003年分离株存在较大同源性。虽然病毒E基因存在少量氨基酸改变,但总体上这些变异不足以影响病毒的致病性。结论近几年福建省的临床乙脑病毒分离株为G3型,新分离株亲缘关系比较接近2002、2003年毒株。

乙脑病毒E蛋白中和表位与结核杆菌hsp70在大肠杆菌中的融合表达

根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则,人工合成了乙脑病毒E蛋白C末端的中和表位,位于E蛋白上373-399 aa,通过EcoRⅠ和HindⅢ连接构建原核表达载体pET-32a-epitope。将hsp70通过HindⅢ和XhoⅠ连接到载体pET-32a-epitope上中和表位的3′端,构建融合表达载体pet-32a-epitope-hsp70。诱导表达后,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE,结果表明该融合蛋白以包含体形式存在。将包含体在8 mol/L的尿素中过夜溶解,然后将上清过柱,获得良好的纯化结果。融合蛋白的分子量为94 kD。Western blot显示该蛋白兼具对JEV和结核杆菌热休克蛋白70（M.Thsp70）的特异抗原性。

从临床送检的脑炎病人血液和脑脊液中分离出10株乙脑病毒

[目的 ]从脑炎病人的血液和脑脊液中分离乙脑病毒。[方法 ]对发病 5日内的血液 2 4份和脑脊液 2份标本接种C6/3 6细胞 ,再做免疫荧光试验、乳鼠接种、血凝试验和血凝抑制试验。[结果 ]证实有 10株乙脑病毒 ,其中 9株从血液分离 ,1株从脑脊液分离。 6月份分离到 7株、7月份 2株、8月份 1株。[结论 ]说明我省 6月、7月和 8月有乙脑流行。

乙脑病毒非结构蛋白NS1的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的初步建立

克隆表达乙脑病毒非结构蛋白NS1,并以其作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法。用此方法分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)及猪圆环病毒(PCV)阳性血清各3份,以及33份健康非免疫仔猪血清和205份乙型脑炎灭活疫苗免疫的猪血清,评价NS1-ELISA方法的特异性。取54份乙脑病毒感染的猪血清进行NS1-ELISA检测,评价该方法的敏感性。NS1-ELISA检测的特异性为95%,敏感性达90.7%。与商品化试剂盒比较,其符合率达到96.0%。在重复性试验中,NS1-ELISA检测方法重复性较好。本试验为进一步研究不同感染时期NS1抗体水平的差异奠定基础。

三带喙库蚊抗性水平与其对乙脑病毒易感性关系的研究

为了解三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus抗药性水平与其对乙脑病毒易感性之间的关系，本研究采用浸渍法对野外采集的不同种群三带喙库蚊幼虫抗药性水平进行测定，同时对同批次蚊虫经口感染乙脑病毒，RT．PCR法检测感染率。生测结果显示三带喙库蚊幼虫实验室品系（LAB）、南京江浦种群（NJJP）、濉溪南坪种群（SXNP）、安康建民种群（AKJM）F1代和安康建民种群（AKJM）F3代对溴氰菊酯的半数致死浓度（LC50值）分别为0．0009、0．0071、0．0160、0．0027和0．0025mg／L，与敏感品系相比，抗药性指数在2．30～40．05之间；对高效氯氰菊酯的半数致死浓度（LC50值）分别为0．0043、0．0117、0．0528、0．0121和0．0141mg／L，抗药性指数在2．13～26．42之间。感染实验结果显示，三带喙库蚊实验室品系、南京江浦种群、濉溪南坪种群、安康建民种群F1代和安康建民种群F3代对乙脑病毒的感染率分别为84．44％、80．56％、62．5％、86．00％和91．89％。相关性分析结果显示：三带喙库蚊对乙脑病毒的感染率与其对溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的抗性指数之间均有线性负相关关系（腰值分别为0．887和0．783，P值分别为0．0167和0．0460）。表明三带喙库蚊在杀虫剂的选择压力下，可能会影响其对乙脑病毒易感性，但这种影响的机制尚待进一步研究。

转瓶培养与生物反应器微载体培养乙脑病毒的比较

分别用15L转瓶与15L生物反应器微载体（2．5g／L CytodexⅢ）系统培养Vero细胞并接种乙型脑炎病毒（简称乙脑病毒）。转瓶培养Vero细胞7～8d，细胞数最高能达到8×10^8；当单层细胞长至3．0—4．5×10^8时接种乙脑病毒，病毒滴度能达到6．5～6．98Ig PFU／ml，并能够连续收获4～5次；采用微载体系统培养Vero细胞，细胞密度最高能达到170×10^8；当单层细胞长至60～70×10^8时接种乙脑病毒，病毒滴度能达到7～7．51gPFU／ml，并能够连续收获13～15次。两种方式培养的乙脑病毒收获液分别经灭活、浓缩、柱层析纯化后制备Vero细胞乙脑纯化疫苗，各项检定指标均符合《中国药典》的相关要求。

猪乙脑病毒分离株BSF．ZZ-1和BSF．ZZ-3在BHK-21细胞上的传代培养及E基因序列稳定性分析

为研究猪乙脑病毒(JEV)分离株遗传基因的稳定性,将JEV分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代60次后病毒E基因趋于稳定,BSF.ZZ-1毒株E蛋白氨基酸位点E21(A→V)、E200(T→A)、E244(G→E)、E279(M→K)和E426(G→D),以及BSF.ZZ-3毒株的E244(G→E)、E255(F→L)、E285(M→L)、E368(L→S)和E497(N→S)传代后发生稳定点突变。与JEV毒力相关的部分位点如E107、E138、E176、E177和E315遗传稳定性较高,经连续传代后均未发生突变,与疫苗株SA14-14-2相应位点完全一致。但是,另外一些位点的遗传稳定性较差,如BSF.ZZ-3的E279(M→K→M)出现反复突变。这些突变是否与JEV的宿主细胞适应性及毒力变化相关有待进一步研究。

云南省洱源县右所镇蚊类乙脑病毒的分离与鉴定

于1986年5月至1988年2月,在洱源县右所镇设点,进行蚊虫季节消长观察及病毒分离。结果从中华按蚊、麻翅库蚊、三带喙库纹及纹腿库蚊中分离到乙脑病毒8株。麻翅库蚊是国内首次证实的乙脑带病毒蚊种。三带喙库蚊的季节消长、病毒检出时间与乙脑流行高峰相一致,认为是当地乙脑的主要传播媒介。中华按蚊出现早、消失晚、数量多,密度高峰与乙脑流行时间相吻合,而且从该蚊种检出的病毒最多、时限最长,因此认为,该蚊不仅是当地乙脑的重要传播媒介,并在乙脑病毒的常年保存和传播中起重要作用。

海口市蚊媒分布及乙脑病毒分离鉴定

目的调查海口市吸血蚊媒分布及蚊虫携带乙脑病毒的情况。方法于2015年7月至2016年6月采用帐诱法捕捉蚊虫,用细胞培养法分离病毒,磁珠法提取病毒RNA、RT-LAMP扩增,并进行分子生物学鉴定。结果于海口市捕捉蚊虫共561只,其中库蚊528只,占94.12%,伊蚊33只,占5.88%;库蚊研磨液接种于BHK21产生典型的细胞病变,RT-LAMP扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,蚊媒体内乙脑病毒阳性。结论海口市存在携带乙脑病毒的吸血蚊媒。

人抗乙脑病毒IgG抗体检测试剂盒的研制和应用

乙脑病毒SA14-14-2株疫苗原液经β丙内酯灭活Sepharose 4FF纯化后作为包被抗原，制备阳性替代品，应用间接ELISA法检测人血清中乙脑病毒抗体。建立内部质量控制血清标准，比较蚀斑减少中和试验（PRNT）与ELISA的相关性。检测46份乙脑相关血清的结果与国内同类试剂进行比较，阳性符合率为93．1％，阴性符合率为89．5％。在成安地区3万多名2—14岁人群中进行乙脑病毒IgG抗体水平普查，阳性率22．5％，与国内同类试剂的符合率为95．7％，使用效果很好。

乙脑病毒E-Hsp70与E-肽连接区对小鼠特异性免疫的比较

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,研究酵母表达的该乙脑病毒(Japaneseencephali-tisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的融合蛋白以及该抗原肽与Hsp70上的一个功能域-肽连接区(Peptidebindingdomain,以下简称BD)融合形成的蛋白,用这三种蛋白分别免疫BALB/c小鼠,以酵母单独表达的E蛋白主要抗原片段免疫作为对照,比较它们对小鼠抗E蛋白主要抗原片段特异性的细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹腔内注射蛋白的方法免疫小鼠,主要从IL-2的mRNA水平,淋巴细胞的增殖和抗体滴度这三个方面进行比较,最后我们得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比E-Hsp70略好一些,所以在本试验中肽连接区是完全可以代替Hsp70独立行使其佐剂功能。