蛋白质磷酸化和亚硝基化互作对宰后羊肉嫩度的影响

以宰后羊背最长肌为研究对象,利用磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、S-亚硝基谷胱甘肽和一氧化氮合成酶抑制剂分别调控肉糜样品的磷酸化和亚硝基化修饰程度,通过分析孵育期间(4℃)样品的磷酸化水平、亚硝基化水平、pH值、肌原纤维小片化指数、肌间线蛋白和肌钙蛋白-T降解程度等指标的变化,探究蛋白质磷酸化和亚硝基化互作对宰后羊肉嫩度的影响。结果表明:在孵育前期(12h)和后期(48~72h),磷酸化处理组样品的磷酸化水平显著高于磷酸化和亚硝基化共同处理组(P<0.05),蛋白质亚硝基化会抑制磷酸化修饰反应。当磷酸化和亚硝基化修饰共同作用时,磷酸化修饰对pH值的影响占主导作用,并且亚硝基化可能会促进磷酸化对pH值的进一步影响;相反,蛋白质亚硝基化对宰后羊背最长肌肌原纤维内部结构的破坏起主要作用。当磷酸化和亚硝基化修饰共同存在时,蛋白质磷酸化抑制蛋白质亚硝基化反应,而蛋白质亚硝基化可能会促进蛋白质磷酸化对肌间线蛋白降解的抑制作用。在宰后孵育过程中,蛋白质磷酸化和蛋白质亚硝基化在不同反应时期调控作用不同,但最终均会使肌钙蛋白-T的降解程度下降。综上所述,蛋白质磷酸化和亚硝基化修饰互作负向影响宰后羊肉嫩度。

蛋白质巯基亚硝基化修饰在心血管疾病中作用的研究进展

心血管疾病是全球重大公共卫生问题,其发病机制及作用靶点的研究对临床诊治有重要意义。蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)是一种调节蛋白功能的重要途径,主要包括酰化、磷酸化、甲基化、泛素化等。PTM参与了多种心血管疾病的发病过程,如心肌肥厚、心力衰竭、动脉粥样硬化、血管内皮损伤等。最近有不少研究发现蛋白质巯基亚硝基化(S-nitrosylation,SNO)修饰在心血管疾病中发挥重要的调控作用。本文简要综述了SNO修饰的形成与转化及对蛋白的调控在心肌肥厚、心力衰竭、动脉粥样硬化等常见心血管疾病中作用的研究进展。

基于S-亚硝基化解析一氧化氮对哈密瓜采后抗环血酸-谷胱甘肽循环的影响

为了探究一氧化氮(NO)对哈密瓜采后贮藏期的抗氧化作用,该研究以“西州蜜17”为试材,采用外源NO精准熏蒸方法,分析测定哈密瓜生理指标、S-亚硝基化水平和抗氧化指标的变化,从S-亚硝基化水平的角度探讨NO对哈密瓜采后抗坏血酸-谷胱甘肽循环(glutathione-ascorbate cycle,AsA-GSH cycle)的影响。结果表明,NO熏蒸能较好地维持哈密瓜贮藏品质,降低果实H 2O 2、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,显著提高果实内源NO和S-亚硝基硫醇(S-nitrosothiols,SNO)含量,抑制S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)活性升高。NO熏蒸可以维持较高的抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)和脱氢抗坏血酸(dehydroascorbate,DHA)的比值(AsA/DHA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)的比值(GSH/GSSG)。在整个贮藏期,处理组抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶活性高于对照组。NO熏蒸通过提高哈密瓜果实的S-亚硝基化水平,激活了AsA-GSH循环关键酶的活性,提高了清除H 2O 2的效率,缓解了脂质过氧化,从而维持了哈密瓜采后贮藏品质。

参麦方对缺血心肌组织蛋白S-亚硝基化的影响

目的：观察参麦方对急性心肌缺血的保护作用及其对心肌蛋白S-亚硝基化的影响。方法：SD大鼠分为给药组与模型组，给药组灌胃参麦方（3g·kg^-1）5d后，结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia／reperfusion injury，MI／RI）；测定血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）含量，以评价心肌损伤程度；Griess法测定血清一氧化氮（NO）含量，Western blot法检测心肌组织内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达变化；分别采用Biotin Switch法和DAN荧光法对心肌蛋白S-亚硝基化水平进行检测。结果：与模型组比较，参麦方给药组血清CK，LDH活性明显下降（P〈0．05），表明参麦方具有良好的抗心肌缺血效果。此外，血清NO含量显著升高且心肌组织eNOS表达上调（P〈0．01）。相对分子质量90～117×10^3的心肌蛋白发生明显的S-亚硝基化，其S-亚硝基化水平由（4．42±0．60）μmol·g^-1上升至（8．78±1．37）μmol·g^-1 （P〈0．01）。结论：促进缺血心肌组织蛋白的S-亚硝基修饰可能是参麦方抗心肌缺血再灌注损伤的主要作用途径之一。

大蒜素上调蛋白亚硝基化抗动脉粥样硬化研究

目的观察大蒜素对高胆固醇饮食诱导的apoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展的影响,并从蛋白亚硝基化方面探讨其可能的作用机制。方法 30只apoE-/-小鼠随机分3组:对照组(生理盐水,ig)、低剂量组(大蒜素,9mg/kg·d,ig)、高剂量组(大蒜素,18mg/kg·d,ig)。高胆固醇饮食喂养12周,分别于第0、4、8、12周采血检测血脂水平,处理结束后,检测血浆氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)水平;利用苏木精伊红染色与范吉尔森弹性纤维染色观察主动脉根部组织学变化;免疫组化染色检测动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞和血管平滑肌细胞含量;免疫荧光观察主动脉根部蛋白亚硝基化水平的变化。另外,以人脐静脉内皮细胞为体外模型,将其与ox-LDL(50μg/mL)共同培养24h,并用不同剂量(10μmol/L和20μmol/L)大蒜素加以处理,分别采用硝酸还原酶法和免疫荧光法检测细胞上清NO及细胞蛋白亚硝基化水平。结果组织学分析发现,大蒜素组小鼠主动脉根部斑块面积及斑块内巨噬细胞和血管平滑肌细胞含量明显较对照组少(P<0.05)。与对照组相比,大蒜素组小鼠血浆MDA、ox-LDL、TNF-α水平明显降低(P<0.05),血浆NO水平及主动脉根部蛋白亚硝基化水平明显升高(P<0.05),但对其血脂水平无明显影响。体外实验结果显示,与对照组相比,大蒜素能够显著恢复由ox-LDL所导致的人脐静脉内皮细胞的NO和蛋白亚硝基化水平的减少(P<0.01)。结论大蒜素能够有效抑制动脉粥样硬化的进展,其作用机制可能与大蒜素通过上调内皮细胞蛋白亚硝基化水平所发挥抗氧化应激和抗炎作用有关。

亚硝基化谷胱甘肽还原酶:一个调控炎症反应的新分子

炎症因子的表达调控是炎症反应的关键步骤,与自身免疫疾病以及癌症等密切相关.一氧化氮(nitric oxide,NO)在炎症因子表达调控中具有重要作用,但已有的研究多关注于NO合成对炎症因子的调控作用,而对NO代谢的作用知之甚少.亚硝基化谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)是体内NO信号通路代谢调控的关键蛋白.本研究发现脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在RAW264.7细胞中上调诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的同时下调GSNOR的转录和蛋白质表达,该下调作用依赖MEK1/2、p38和PI3K信号通路.抑制GSNOR可促进LPS诱导的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达,而过表达GSNOR作用相反.抗炎症药物曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)能够挽回LPS对GSNOR的下调作用,并且GSNOR抑制剂削弱了TSA对炎症因子IL-6和TNF-α转录的抑制效应.这些结果表明:GSNOR是一个新的重要炎症调控分子,它可能成为调控NO介导的炎症相关信号通路的新的潜在靶点,上调GSNOR可能是抑制炎症的新思路.本研究揭示了巨噬细胞通过上调iNOS和下调GSNOR共同增强免疫炎症反应的新机制,拓展了对NO代谢在炎症反应中作用机制的认识.

草甘膦的亚硝基化单扫描示波极谱法测定及其应用

草甘膦与亚硝酸钠在室温下发生亚硝基化反应,得到其亚硝基化衍生物N-亚硝基-N-膦酸甲基甘氨酸,在盐酸-醋酸钠(pH0.7)介质中该衍生物于-0.81V(vs.SCE)处产生一个灵敏的极谱波,其二阶导数峰峰电流I与草甘膦质量浓度在1.2×10-4～6.0×10-2g/L范围内呈良好的线性关系(r=0.9965,n=9),检测下限为9.6×10-5g/L(S/N=3),9次测定6.0×10-3g/L草甘膦相对标准偏差(RSD)为1.7%。该法简单、快速,可用于制剂与土壤样品中草甘膦的测定。

丁苯酞对S-亚硝基化谷胱甘肽诱导脑微血管内皮细胞损伤的保护作用及机制研究

目的:构建S-亚硝基化谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)诱导脑微血管内皮细胞的损伤模型,探讨丁苯酞(Butylphthalide,dL-NBP)对脑微血管内皮细胞的保护作用与可能的分子调控机制。方法:建立损伤bEnd.3细胞模型,以MTT法检测细胞存活率。DCFH染色检测细胞活性氧水平。Western blot法检测p-ERK,ERK,cleaved caspase 9,pro-caspase 9,cleaved caspase 3,pro-caspase 3蛋白表达。RT-PCR法检测糖皮质激素受体(GR)、SGK、MKP-1基因表达水平。结果:dL-NBP(5,10,20 μmol/L)可减少GSNO引起的脑微血管内皮细胞损伤,提高细胞存活率,减少ROS发生。此外,dL-NBP可激活SGK和MKP-1转录水平的增加,上调ERK磷酸化,抑制cleaved caspase 9,cleaved caspase 3蛋白上调。结论:dL-NBP对GSNO诱导的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用,其作用机制与激活PR活性下游基因SGK和MKP-1,上调ERK磷酸化水平,抑制caspase级联反应密切相关。

蛋白质巯基亚硝基化对细胞功能的调控作用

近年来,人们发现一氧化氮（nitric oxide,NO）可对半胱氨酸巯基（-SH）进行氧化修饰,生成低分子量的亚硝基硫醇（RSNO）和高分子量的亚硝基化蛋白质（S-nitrosylated protein,PSNO）,前者包括亚硝基半胱氨酸（S-nitrosocysteine,CyS-SNO）和亚硝基半胱氨酸（S—nitrosocysteine，CyS—SNO）和亚硝基谷胱甘肽（Js—nitrosoglutathione，GSNO），后者又称蛋白质巯基亚硝基化（proteinS—nitrosylation）。

香烟提取物对人脐静脉内皮细胞蛋白亚硝基化的影响及机制

目的探讨香烟提取物(CSE)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)蛋白亚硝基化的影响。方法以HUVEC为体外模型,利用免疫荧光染色对细胞蛋白亚硝基化进行检测,并用生物素转化方法对荧光结果进行验证;利用Western blot对蛋白进行了检测;另外,在实验过程中,对超氧阴离子水平也进行了检测。结果不同浓度CSE(0.005%、0.01%、0.02%和0.04%)均能够明显减少蛋白的亚硝基化水平,且随着浓度增加,蛋白亚硝基化水平减少越明显。NO供体药物硝普钠(SNP)、内源性供体亚硝基谷胱甘肽(GSNO)、长效NO供体NO亲和复合体(NONOate)和NADPH氧化酶抑制剂加拿大麻素均能够恢复被CSE所导致的蛋白亚硝基化减少。另外,CSE能够增加超氧阴离子水平,这种作用能够被加拿大麻素所抑制。结论 CSE能够减少HUVEC蛋白亚硝基化水平。这种作用与其激活NDAPH氧化酶所引起的超氧阴离子积聚和NO产生通路的阻断有关。

大鼠脑缺血/再灌注诱导的海马CA1区Fyn亚硝基化

目的 观察大鼠脑缺血/再灌注诱导海马CA1区酪氨酸蛋白激酶Fyn的巯基亚硝基化水平变化,并探讨其变化的可能机制.方法 采用Pulsinelli-Brierley四动脉阻断法制作大鼠全脑缺血/再灌注模型,生物素转化法检测亚硝基化的Fyn.结果 大鼠脑缺血/再灌注可以引起Fyn的巯基亚硝基化,亚硝基化的Fyn随再灌注时间延长逐渐增加,再灌注6 h增加最为明显;缺血前20 min注射神经元型一氧化氮合酶的抑制剂7-硝基吲唑可以明显抑制Fyn的巯基亚硝基化.结论 大鼠脑缺血/再灌注早期可以通过神经元型一氧化氮合酶产生的一氧化氮诱导Fyn的巯基亚硝基化.

脑缺血再灌注中nNOS介导的ASK1巯基亚硝基化促进其激活

目的本文主要研究在脑缺血再灌注早期,神经性一氧化氮合酶(nNOS)来源的NO是否能够引起凋亡信号调节激酶蛋白1(ASK1)巯基亚硝基化,以及ASK1的巯基亚硝基化与其激活的关系。方法 SD大鼠分为正常对照组,缺血复灌6 h组,7NI给药组,AMT给药组,生理盐水对照组。采用四动脉结扎去结扎法构建大鼠全脑缺血再灌注模型。运用SDS-PAGE、免疫印迹、免疫沉淀和免疫组织化学方法对蛋白质的磷酸化以及蛋白质之间的相互作用进行研究;蛋白质的S-亚硝基化的检测主要是通过"生物素转化法"(Biotin-Swich method)。结果 nNOS的抑制剂7NI能够降低ASK1的亚硝基化水平,进而降低了ASK1的磷酸化水平(P<0.05)即ASK1的活性。结论 7NI通过降低nNOS介导的ASK1巯基亚硝基化,对SD大鼠海马区脑缺血再灌注损伤的神经元起到保护作用。

依达拉奉对脑缺血/再灌注大鼠海马组织MKK4亚硝基化影响

目的研究依达拉奉对脑缺血/再灌注诱导大鼠海马组织MKK4亚硝基化影响,并分析其改变的可能机制。方法 SD大鼠随机分为假手术组(sham)、脑缺血/再灌注组(I/R)、药物对照组(NS)和依达拉奉处理组(Ed)。Pulsinelli-Brierley四动脉结扎法建立大鼠I/R实验模型。MKK4亚硝基化检测:海马组织匀浆,蛋白样品用抗MKK4抗体作免疫沉淀,抗-SNO-Cys抗体作免疫印迹。结果 MKK4亚硝基化水平I/R组、NS组较sham组明显增加(P <0. 05),Ed组较NS组降低明显(P <0. 05),各组间MKK4蛋白表达差异无显著性(P> 0. 05)。结论依达拉奉可能通过抑制脑I/R诱导海马组织MKK4的巯基亚硝基化,减少其活化,调节JNK、p38 MAPK信号通路,保护神经元,减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。

一氧化氮和蛋白质亚硝基化对鲜肉品质的影响研究进展

肉的成熟指动物宰后由肌肉变为可食用肉的过程,是肉品领域研究的核心问题之一。动物屠宰放血后,肌细胞处于缺血缺氧的环境中,肌细胞主要通过糖酵解供能,代谢产生乳酸导致肌细胞pH下降。与此同时肌浆网钙离子的释放导致细胞质中钙离子浓度升高,线粒体膜的功能紊乱释放多种促细胞凋亡因子而激活细胞凋亡酶,引发细胞凋亡。

自由基清除剂对癫痫大鼠海马组织Fyn的亚硝基化影响

目的研究自由基清除剂对癫痫大鼠海马组织Fyn的亚硝基化影响,并探讨其变化的可能机制。方法 SD大鼠随机分为癫痫对照组(saline组)、癫痫组(KA组)和药物对照组(KA+saline组)及MCI-186组(KA+MCI-186组)。采用脑室注射海人酸制作大鼠癫痫模型。海马组织匀浆,取蛋白样品用抗Fyn抗体作免疫沉淀,然后用抗-SNO-Cys抗体做免疫印迹,检测Fyn巯基亚硝基化。结果 Fyn的亚硝基化水平癫痫组和药物对照组增加(P<0.05),MCI-186组较药物对照组降低(P<0.05),Fyn的蛋白表达各组间差异无显著性(P>0.05)。结论自由基清除剂可能通过抑制癫痫诱导海马组织Fyn的巯基亚硝基化,调节NMDA受体NR2B亚基磷酸化,进而调节NMDA受体通道功能,对神经元起保护作用。

亚硝基化的二硫键异构酶介导甲基苯丙胺致小鼠相关脑区α-突触核蛋白表达升高

目的研究亚硝基化的二硫键异构酶(PDI)对甲基苯丙胺(METH)致小鼠海马及纹状体区α-突触核蛋白(α-SN)表达的影响。方法利用C57小鼠METH亚急性中毒模型,使用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)与METH共同造模,实验分为对照组、L-NNA组、METH组、METH+L-NNA组。Western Blotting技术检测各组海马及纹状体区内一氧化氮合酶(NOS)、PDI及其S亚硝基化(PDI-SNO)和α-SN表达情况。一氧化氮试剂盒检测各组一氧化氮含量。结果 METH给药后NOS、一氧化氮含量、PDI-SNO、α-SN表达较对照组均明显升高(P<0.05);L-NNA与METH共处理后与METH组对比,NOS表达下降(P<0.05),一氧化氮含量明显减少(P<0.05),能够显著抑制PDI-SNO表达(P<0.05),伴随α-SN表达降低(P<0.05)。而MET H+L-NNA组、L-NNA组与对照组比较均无明显差异(P>0.05)。结论 METH作用后诱导NOS活化,一氧化氮含量升高,PDI发生显著S亚硝基化而功能失活,导致相关脑区α-SN表达升高,而NOS抑制剂L-NNA能部分缓解METH神经毒性作用。

淫羊藿苷对S-亚硝基化谷胱甘肽诱导损伤的内皮细胞的保护作用

目的探讨淫羊藿苷对S-亚硝基化谷胱甘肽诱导损伤的内皮细胞的保护作用。方法内皮细胞(EA.hy926)预先给予不同浓度ICA(高浓度:10μmol/L,中浓度:1μmol/L,低浓度:0.1μmol/L),之后给予S-亚硝基化谷胱甘肽(1mmol/L)损伤,建立模型。采用:噻唑兰染色法检测细胞存活率,通过对乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、活性氧、细胞色素C、Caspase-3等相关指标的测定进行分析。结果淫羊藿苷可明显提高内皮细胞内超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活性,抑制活性氧的产生,降低细胞色素C的释放以及Caspase-3的活性,从而减少细胞的凋亡,差异有统计学意义(P<0.01),对S-亚硝基化谷胱甘肽诱导损伤的内皮细胞起到保护作用。结论淫羊藿苷对S-亚硝基化谷胱甘肽诱导损伤的内皮细胞具有保护作用,其机制可能与淫羊藿苷可提高细胞内超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活性,抑制活性氧的产生和减少细胞色素C的释放有关。

NO参与的S-亚硝基化反应及其生理意义

S-亚硝基化,即在蛋白质半胱氨酸残基上形成S-亚硝基,近年来发现这种修饰有着重要的生理功能。本文从一氧化氮的化学反应特性对S-亚硝基化反应及其生理意义进行了综述。

共振拉曼光谱检测S-亚硝基化蛋白质

蛋白质S-亚硝基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,它对蛋白质功能的表达和多种疾病的产生有着重要的影响。能够准确定量S-亚硝基化蛋白质对疾病的早期预防有着重要的意义。目前,建立一种高效灵敏的S-亚硝基化蛋白质检测方法仍然存在诸多挑战。提出了一种基于亚铁细胞色素c共振拉曼散射的S-亚硝化蛋白质的无标记检测方法。光照诱导S-亚硝基蛋白质释放NO,后者与亚铁细胞色素c中的血红素发生氧化反应,利用细胞色素c共振拉曼光谱的变化实现对S-亚硝基化蛋白质的定量分析。实验结果均表明该方法可以快速灵敏的定量检测S-亚硝基化蛋白质,并且在临床上有潜在的应用价值。