酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B相互作用的蛋白质

应用酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B(hPRB)发生相互作用的蛋白质,有助于进一步阐明其在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用的调控机制。应用酵母双杂交系统3,以hPRB不同结构域为诱饵,筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用X-α-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。最终以AF1-DBD结构域作为诱饵最终筛出了1个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这个克隆所编码的蛋白为PIAS3(活化的STAT3的蛋白抑制剂)。结果表明,孕激素受体可以和PIAS3发生相互作用,它们的相互作用有可能参与乳腺癌的生长调控。

人孕酮受体激素结合区片段在大肠杆菌中的表达条件

本试验研究了人孕酮受体激素结合区片段在大肠杆菌中的表达条件 ,结果发现 ,随着诱导时间的延长 ,表达量增加 ,4h时 ,表达量最大 ,诱导时间进一步延长 ,表达量并未增加 ;当诱导剂浓度增加时 ,表达量增加 ,浓度为 1mmol/ L时 ,表达量最大 ,浓度进一步增加 ,表达量无明显变化 ;培养液中青霉素浓度在 10 0～ 180 μg/ m L 时表达量最大 ,进一步增加青霉素浓度 ,表达量开始下降。当浓度为 30 0μg/ m L时 ,仅见一条非常模糊的带。用 Western印迹检测时发现 ,在与 45k Da平行的位置 ,最适反应条件下的产物与不加 IPTG时相比 。

人孕酮受体膜组分1表达载体的构建及其重组蛋白对体外血管形成的诱导作用

目的:构建含人孕酮受体膜组分(progesterone receptor membrane component,PGRMC)1的重组表达质粒,转染人卵巢癌细胞,研究其调控卵巢癌细胞血管生成的作用。方法:以卵巢癌细胞为模板,采用PCR技术扩增PGRMC1基因编码序列,插入真核载体pSecTag-2B构建重组表达载体;然后,将重组载体pST-PGRMC1分别转染人胚肾上皮细胞HEK293T和卵巢癌细胞SKOV-3,采用蛋白质印迹法检测PGRMC1蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测卵巢癌细胞中VEGF m RNA的变化,用ELISA法检测上清液中VEGF的分泌情况。体外血管生成实验进一步观察PGRMC1促进体外血管生成的情况。结果:重组表达载体pST-PGRMC1构建成功,重组蛋白PGRMC1在HEK293T和SKOV-3细胞中都能够表达;PGRMC1过表达可促使卵巢癌细胞合成VEGF,并且促进体外血管的形成。结论:重组蛋白PGRMC1在促进卵巢癌细胞体外血管形成中起着重要作用,可能促进卵巢癌细胞的远处转移。