圣草酚对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞增殖、氧化应激反应及TGF-β1/Smad信号通路活化的影响

目的 探讨圣草酚对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人皮肤成纤维细胞(HSF)的增殖、氧化应激反应及TGF-β1/Smad信号通路活化的影响。方法 将HSF分为对照组、模型组、圣草酚低剂量组、圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组、SB-431542组。对照组不做任何处理,模型组用5.0 ng/mL TGF-β1干预24 h,圣草酚低剂量组、圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组分别用40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L圣草酚和5.0 ng/mL TGF-β1同时干预24 h,SB-431542组用10μmol/L SB-431542和5.0 ng/mL TGF-β1同时干预24 h。检测各组HSF细胞活力、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平、活性氧簇(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性,TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(Co lⅢ)、基质金属蛋白酶2(MMP2)的mRNA表达量及TGF-β1的蛋白表达水平。检测对照组、模型组、圣草酚中剂量组HSF的Smad2、Smad3、磷酸化Smad2 (p-Smad2)、磷酸化Smad3 (p-Smad3)蛋白表达水平。结果 与对照组相比,模型组的HSF细胞活力及α-SMA蛋白表达水平增加,ROS含量增加而SOD活性降低,TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、Co lⅢ和MMP2 mRNA表达量上调,TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达量亦上调(P<0.05)。与模型组相比,圣草酚各剂量组和SB-431542组HSF细胞活力降低、ROS含量降低、SOD活性增强,且α-SMA、ColⅠ、Co lⅢ、MMP2的mRNA表达量和TGF-β1蛋白表达量下调,圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组和SB-431542组HSF细胞中α-SMA蛋白表达水平降低,圣草酚中剂量组及SB-431542组Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量下调(P<0.05)。圣草酚低剂量组、圣草酚中剂量组、圣草酚高剂量组HSF细胞活力、α-SMA蛋白表达水平、ROS含量依次降低,SOD活性依次增强,α-SMA、ColⅠ、Co lⅢmRNA表达量依次降低(P<0.05)。结论 圣草酚可能通过抑制氧化应激反应及TGF-β1/Smad通路的活化,从而剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的HSF细胞纤维化。

小球藻生长因子对UVA诱导人皮肤成纤维细胞紫外损伤的保护作用研究

本研究通过苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法对小球藻生长因子(Chlorella growth factor,CGF)中各营养成分进行含量测定;采用MTT法和酶联免疫吸附(ELISA)法分别测定CGF对紫外损伤的人皮肤成纤维细胞(HSF)的保护作用和胶原蛋白相关因子的表达。结果表明核苷酸在CGF中占比为84.40%±0.73%。CGF预处理能显著减轻UVA对HSF细胞的增殖抑制作用,与模型组相比以50μg/mL浓度CGF处理可使HSF细胞活力提高75.05%,且在5~50μg/mL内存在一定的剂量依赖关系。ELISA实验结果发现CGF可提高HSF细胞中基质金属蛋白酶抑制酶-1(TIMP-1)、I型胶原蛋白(COL-I)的表达,降低基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达。CGF是优异的外源性核苷酸营养物质,能有效减轻UVA引起的HSF细胞损伤,其作用可能与促进胶原蛋白的合成有关。

柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线照射后体外培养人皮肤成纤维细胞衰老的保护作用及机制研究

目的:研究柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线(UVB)照射后体外培养人皮肤成纤维细胞(HSF)衰老的保护作用及衰老相关基因p53、p21、微RNA(miR)-34c和沉默信息相关调节因子(SIRT)1 mRNA表达水平的影响。方法:取对数生长期的HSF,分为对照组、UVB照射组,柴达木黑果枸杞花青素低剂量组(0.1 g/L)、柴达木黑果枸杞花青素中剂量组(0.5 g/L)和柴达木黑果枸杞花青素高剂量组(1.0 g/L)。UVB照射前24 h用不同浓度的柴达木黑果枸杞花青素预处理HSF。UVB照射后72 h,β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测衰老细胞比例,定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中衰老相关基因p53、p21、miR-34c及SIRT1 mRNA的表达水平。结果:与对照组相比,UVB照射组细胞SA-β-gal染色阳性率及p53、p21、miR-34c和SIRT1 mRNA表达水平均升高(P<0.05)。与UVB照射组相比,柴达木黑果枸杞花青素(0.1 g/L、0.5 g/L和1.0 g/L)组细胞SA-β-gal染色阳性率,p53、p21、miR-34c及SIRT1 mRNA的表达水平,均呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论:黑果枸杞花青素可能通过下调p53/miR-34c正反馈调节来减轻HSF的照射损伤,进而发挥抗衰老作用。

柴达木黑果枸杞花青素减轻中波紫外线辐射后人皮肤成纤维细胞氧化及炎性损伤的研究

目的 探讨柴达木黑果枸杞花青素减轻中波紫外线(UVB)辐射后人皮肤成纤维细胞(HSFs)氧化及炎性损伤。方法 将体外培养的HSFs细胞采用随机数字表法分为空白对照组(不进行任何处理)、UVB辐射组(30 mJ/cm~2照射30 min)、UVB+花青素低剂量组(0.1 mg/mL+30 mJ/cm~2照射30 min)、UVB+花青素中剂量组(0.5 mg/mL+30 mJ/cm~2照射30 min)、UVB+花青素高剂量组(1 mg/mL+30 mJ/cm~2照射30 min)。柴达木黑果枸杞花青素于UVB照射前24 h加入细胞培养基中,24 h后收集细胞。采用倒置显微镜观察细胞形态;台盼蓝染色观察细胞死亡情况;MTT法测细胞增殖活力;酶标法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力、谷胱甘肽(GSH-PX)含量、丙二醛(MDA)的含量。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测并比较白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)表达水平。结果 倒置显微镜下各组细胞形态:花青素中、高剂量组细胞形态接近于空白对照组,花青素低剂量组细胞形态接近于UVB副射组。台盼蓝染色显示,与空白对照组比较,UVB辐射组HSFs细胞蓝染数量增加,并出现漂浮细胞碎片;与UVB辐射组比较,UVB+低、中、高剂量柴达木黑果枸杞花青素组HSFs细胞蓝染数量下降,漂浮的细胞碎片减少。与空白对照组比较,UVB辐射组MDA、IL-1、IL-6表达水平明显增高(P<0.05);细胞增殖率、SOD活性、CAT活力、GSH-P含量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与UVB辐射组比较,UVB+低、中、高剂量柴达木黑果枸杞花青素组细胞上清液中IL-1、IL-6、MDA表达水平明显降低(P<0.05);细胞增殖率、SOD活性、CAT活力、GSH-P含量均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 柴达木黑果枸杞花青素通过提高抗氧化应激能力、减轻细胞的炎性损伤来改变UVB辐射后HSFs细胞的形态学变化,从而减轻紫外线辐射后引起的皮肤损伤。

丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物基于TGF-β1抑制人皮肤成纤维细胞的研究

目的:研究丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts,HSF)抑制瘢痕形成的影响及分子机制。方法:配制丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物(丹参酮ⅡA与隐丹参酮标准品按照1∶1的比例配置)溶液,采用TGF-β1诱导HSF细胞增殖构建增生性瘢痕体外细胞模型;采用MTT法测定丹参酮ⅡA与隐丹参酮对HSF细胞增殖的影响;采用Western Blot法检测HSF细胞中TGF-β1/Smad信号通路下游信号分子p-Smad2、Smad3蛋白以及Survivin蛋白表达水平变化。结果:丹参酮ⅡA与隐丹参酮能剂量依赖地抑制HSF细胞的增殖,降低p-Smad2、Smad3蛋白和Survivin蛋白表达水平。结论:丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物可能通过下调p-Smad2、3和Survivin蛋白的水平,抑制HSF细胞的增殖,发挥抑制瘢痕的作用。

玉屏风散对紫外线照射的人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的探讨玉屏风散(Yupingfeng Powder,YPF)通过核转录因子NF-E2相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid 2-related factor 2/antioxidant response element,Nrf2/ARE)信号通路对紫外线照射的人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响。方法体外培养人皮肤成纤维ESF-1细胞,紫外线照射建立细胞老化模型,MTT法检测各组细胞活力,比色法、蛋白免疫印迹法检测胶原合成。结果与紫外线组相比,YPF组的细胞活力、羟脯氨酸含量和胶原蛋白含量显著增加,同时也显著增加胶原蛋白I(Collagen I)、胶原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(metalloproteinase tissue inhibitor-1,TIMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-2(metalloproteinase tissue inhibitor,TIMP-2)、Nrf2/ARE信号通路蛋白表达,降低基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)蛋白表达。与UV+YPF-H+siRNA组相比,UV+YPF-H+Nrf2 siRNA组的细胞活力、羟脯氨酸含量和胶原蛋白含量及Nrf2、Collagen I、CollagenⅢ、TIMP-1、TIMP-2蛋白表达降低,MMP-1蛋白表达增加。结论玉屏风散通过抑制Nrf2/ARE信号通路促进紫外线照射的ESF-1细胞胶原蛋白合成。

红山茶组合物诱导的人皮肤成纤维细胞自噬

通过研究确定红山茶组合物(m_(红山茶花提取物):m_(红山茶叶提取物):m_(红山茶籽油)=2:1:17),进而研究红山茶组合物诱导的人皮肤成纤维细胞自噬。采用DPPH清除率来评价红山茶花提取物和红山茶叶提取物的组合物抗氧化能力;红山茶组合物处理后显微镜观察人皮肤成纤维细胞中的自噬小泡;透射电镜观察细胞中自噬溶酶体的出现;Western Blot检测自噬关键蛋白LC3II的表达水平。结果表明:红山茶花提取物和红山茶叶提取物质量比为2:1时,DPPH清除率最高;与对照组相比,体积分数为0.20%、0.40%的红山茶组合物处理人皮肤成纤维细胞72 h后可以诱导细胞自噬,说明红山茶组合物可以诱导人皮肤成纤维细胞自噬。

红外线影响人皮肤成纤维细胞中c-Jun、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达

目的研究红外线对体外培养成纤维细胞(HSF)中c-Jun和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响,为红外线引起光老化损伤的分子机制提供理论依据。方法提取原代皮肤成纤维细胞培养,成纤维细胞被分为对照组(无红外线照射)和实验组(红外线照射);用MTT检测各组细胞活性;用实时定量PCR和免疫细胞化学(ICC)方法检测各组c-Jun和Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA和蛋白的表达。结果MTT检测显示与对照组比较,实验组各组中红外线照射对HSF的增殖有不同程度的抑制作用;红外线照射下调Ⅰ型胶原m RNA和蛋白的表达,随着照射剂量的增加,Ⅰ型胶原的m RNA和蛋白表达下降越明显(P<0.01);红外线照射成纤维细胞12 h后Ⅲ型胶原m RNA和蛋白的表达都呈照射剂量依赖性下调(P<0.05,P<0.01),24 h后Ⅲ型胶原m RNA和蛋白的表达都呈照射剂量依赖性上调(P<0.05,P<0.01);红外线照射上调了c-Jun m RNA和蛋白的表达水平,随着照射剂量的增加,呈照射剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。结论红外线照射人皮肤成纤维细胞后上调c-Jun表达,抑制Ⅰ型胶原表达,干扰Ⅲ型胶原表达,这可能是其引发和促进皮肤光老化的发生机制之一。

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp

神经肽P物质诱导高糖条件下人皮肤成纤维细胞分泌MCP-1的分子机制

目的探讨神经肽P物质(SP)诱导高糖培养环境中的人皮肤成纤维细胞分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的分子机制。方法采用高糖DMEM培养基培养人皮肤成纤维细胞,加入同一浓度(10 nmol/L)SP孵育不同时间,Western blotting检测细胞中核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκBα(p-IκBα)和磷酸化NF-κB亚单位p65(p-NF-κBp65)的表达,免疫荧光方法观测细胞p-NF-κBp65表达和转位情况。将高糖DMEM培养基培养人皮肤成纤维细胞分为对照组、SP组和SP+NF-κB抑制剂(MG132)组(以MG132预处理细胞60 min),Western blotting检测各组细胞内p-NF-κBp65的表达,ELISA方法测定细胞培养上清液中MCP-1的浓度。结果随着SP作用时间的延长,成纤维细胞IκBα的表达量显著减少,p-IκBα的表达量显著增加(P<0.05);同时p-NF-κBp65的表达量在SP作用后显著增加(P<0.05),并保持递增趋势;免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察证实SP作用后细胞胞核内p-NF-κBp65表达增强。与SP组比较,SP+MG132组细胞p-NF-κBp65表达及细胞培养上清液中MCP-1浓度均显著降低(P<0.05)。结论 SP促进人皮肤成纤维细胞分泌MCP-1的作用机制可能与NF-κB信号通路激活有关。

玉竹水提液对长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞损伤的保护作用

目的探讨玉竹水提液对长波紫外线(UVA)诱导的人皮肤成纤维细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法用30 J/cm2的UVA照射人皮肤成纤维细胞建立光老化细胞模型,以不同浓度玉竹提取物处理光老化细胞,MTT法检测细胞活力,羟胺法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,TBA法检测丙二醛(MDA)含量。结果 UVA照射成纤维细胞后,细胞活力下降,SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量升高(P<0.01),玉竹水提液中(100μg/ml)、高(200μg/ml)剂量组能显著提高成纤维细胞细胞活力、SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)。结论玉竹水提液可在一定程度上抑制UVA引起的成纤维细胞活性下降,其机制可能与其抑制氧化损伤和增强细胞抗氧化能力有关。

二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞中生长因子mRNA表达的比较研究

探讨经二维或三维培养的人皮肤成纤维细胞在细胞因子表达能力方面是否有差异。以平面培养皿作为成纤维细胞二维培养系统 ,用胶原凝胶作为成纤维细胞三维培养系统 ,分别提取二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞总RNA ,采用RT PCR方法检测两种培养系统中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA的表达。结果显示 ,虽然二维和三维培养的人皮肤成纤维细胞形态不同 ,但二维和三维培养的成纤维细胞均有VEGF/bFGF设计大小的条带显示 ,且两者条带相对灰度无明显差异。

枸杞叶含药血清对长波紫外线损伤人皮肤成纤维细胞的保护作用

目的探讨不同浓度枸杞叶(LBL)含药血清对长波紫外线(UVA)辐射致人真皮成纤维细胞(HSF)损伤的防护作用及其作用机制。方法采用强度2.8J.cm-2的UVA照射HSF损伤造模,实验分为空白组、对照组、UVA模型组、空白血清组、UVA+0.15g.mL-1LBL组,UVA+1.5 g.mL-1LBL组和VitC阳性对照组,用MTT法检测细胞增殖活性,酶生化法检测MDA含量及培养液中LDH漏出量。结果正常大鼠血清不影响HSF功能,UVA照射HSF损伤法可造成HSF增殖活性降低,MDA含量升高,LDH漏出增加,与空白组相比差异有统计学意义(P均<0.05);不同浓度的LBL及VitC均能增加细胞的增殖活性,减少MDA含量和LDH的漏出量,但LBL作用更优(P<0.05)。结论不同浓度LBL对UVA损伤的HSF均有一定的保护作用,其机制可能与LBL的抗氧化作用及促进细胞增殖活性有关。

茶多酚提取物EGCG对人皮肤成纤维细胞自然老化及慢性光损伤的影响

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)对正常生理代谢状态下人皮肤成纤维细胞(hu-man skin fibroblast,HSF)自然老化以及经长、中波紫外线(UVA及UVB)多次辐射后HSF光损伤的影响。方法分离新生儿包皮获得原代HSF,将其分为正常生理代谢传代实验组(A组)和多次UV照射实验组(B组)。预实验选定EGCG有效作用质量浓度25 mg.L-1。A组细胞包括加入EGCG干预组和空白对照组,共孵育80 d。B组HSF细胞分组包括:空白对照组、EGCG干预组、多次UVA组、多次UVA+EGCG组、多次UVB组及多次UVB+EGCG组,其中UVA和UVB均采用文献提示日常生理剂量,每天照射,持续照射2周。采用组织化学染色法检测细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶的表达量,观察细胞自然老化及照光后的老化情况;采用流式细胞仪测定细胞周期及细胞凋亡率。结果A组中,EGCG组的β-半乳糖苷酶阳性细胞数较正常对照组下降了47.60%(P<0.05)。B组中正常细胞组及EGCG组均只见少量的β-半乳糖苷酶阳性细胞。其余几组阳性细胞比率为:多次UVB组<多次UVA组<EGCG+多次UVB组<EGCG+多次UVA组,4组细胞间阳性比率差异均有统计学意义(P<0.05)。日常剂量UV多次辐射后可上调HSF的凋亡率,经EGCG处理的两组细胞凋亡率与单纯UVB组和单纯UVA组比较分别增加了87.08%和56.92%。结论EGCG可减缓生理代谢状态下的HSF老化;EGCG可进一步增加UV多次辐射后的细胞老化及细胞凋亡,此可能是EGCG减轻自然老化去除多次光损伤不同机制所致。

紫外线及黄芪甲苷对人皮肤成纤维细胞E3连接酶Hrd1表达的影响

目的:探讨紫外线(UV)对人皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1表达的影响及黄芪甲苷的干预作用。方法:分离培养人原代成纤维细胞,分别以10J/cm^2UVA和30mJ/cm^2 UVB进行照射,黄芪甲苷进行干预处理。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的黄芪甲苷对成纤维细胞增殖活性的影响;荧光定量PCR法检测成纤维细胞中Hrd1的mRNA表达;免疫组化法观察成纤维细胞Hrd1的蛋白表达。结果:MTT结果示:在适宜浓度下,黄芪甲苷对体外培养的成纤维细胞有显著的促增殖作用,药物浓度为10、20、30mg/L时最为明显(P<0.001);荧光定量PCR结果示:UVA、UVB照射组成纤维细胞Hrd1 mRNA表达量明显高于正常对照组,而黄芪甲苷可显著抑制UV辐射后成纤维细胞中Hrd1的表达(P<0.001);免疫组化结果示:UV照射(UVA或UVB)可增加Hrd1的蛋白表达,黄芪甲苷可显著抑制UV照射后成纤维细胞中Hrd1的蛋白表达。结论:UV辐射可以上调人皮肤成纤维细胞中E3连接酶Hrd1的表达,而黄芪甲苷对这一现象具有逆转作用。

中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞衰老及机制研究

目的探讨中波紫外线(UVB)对人皮肤成纤维细胞的诱导衰老作用及可能机制。方法使用组织块法分离培养原代人皮肤成纤维细胞,通过观察不同剂量UVB照射后的细胞形态学改变以及β-半乳糖苷酶(β-gal)细胞衰老染色情况,确定后续实验诱导皮肤成纤维细胞衰老的UVB单次照射剂量。于经确定剂量UVB照射后的不同时点(12、24、48、72h)收集细胞及其细胞培养上清液,Western blotting检测诱导衰老的皮肤成纤维细胞衰老相关蛋白P16表达;ELISA法检测诱导衰老细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶1、3(MMP1、MMP3)表达。结果经40mJ/cm2 UVB单次照射的人皮肤成纤维细胞呈现典型的衰老细胞形态学改变,β-gal细胞衰老染色阳性细胞百分比为(88.75±5.32)%,确定诱导衰老UVB单次照射剂量为40mJ/cm2。Western blotting显示,诱导衰老皮肤成纤维细胞P16蛋白表达随UVB照射时间的延长而明显升高;ELISA法检测发现诱导衰老细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达随UVB照射时间的延长而明显减少,MMP1和MMP3表达则随UVB照射时间的延长而显著增加。结论 UVB照射能诱导人皮肤成纤维细胞发生衰老,其机制可能与细胞胶原合成减少而降解增加有关。

体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞

目的探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞(UMC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)的方法。方法用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶和0.25%胰蛋白酶消化法原代分离培养UMC细胞,用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞,镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果脐带组织分离培养第3天,有少量UMC贴壁生长,细胞膜周围有折光性,形态类似于成纤维细胞;皮肤组织块贴壁培养第7天,有HSF爬出,呈长梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长,UMC和HSF数量逐渐增多,细胞生长状态良好。结论应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培养出UMC和HSF。

UVB诱导人皮肤成纤维细胞中beta-catenin基因的变化研究

目的:观察中波紫外线(UVB)诱导人皮肤成纤维细胞中β-catenin及其下游基因c-myc的变化,探讨其在紫外线诱导光老化和肿瘤发生中的作用。方法:使用组织块法分离培养原代成纤维细胞,使用第2～8代人皮肤成纤维细胞进行紫外线处理,倒置荧光显微镜观察其形态学改变,β-gal半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒染色衰老细胞、western blot检测衰老相关蛋白P16的表达,western blot检测紫外线处理人皮肤成纤维细胞各时相点β-catenin、c-myc蛋白表达水平,RT-PCR检测紫外线处理人皮肤成纤维细胞各时像点β-catenin、c-mycmRNA水平的表达变化。结果:40mJ/cm2UVB单次照射后可以诱导人皮肤成纤维细胞衰老,β-gal衰老染色阳性率达到约90%,衰老相关基因P16蛋白表达明显升高,β-catenin、c-myc蛋白表达水平和mRNA水平照射后较未照射组均明显降低。结论:紫外线UVB处理人皮肤成纤维细胞可以诱导其发生衰老改变,衰老细胞中β-catenin、c-myc表达水平明显降低,这些结果与皮肤黑色素细胞瘤相关基因改变的研究相近,为以后皮肤恶性肿瘤的研究提供了线索。

人皮肤成纤维细胞与PGA进行组织构建的适宜接种浓度

目的可吸收生物材料聚羟乙酸(PGA)与成纤维细胞已被证实可以应用于体外组织工程肌腱的构建,本试验旨在探讨应用人皮肤成纤维细胞与PGA在体外进行组织构建时的适宜接种浓度。方法酶消化法获得人皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增至第2代,按照低、中、高三种浓度接种于PGA材料分别作为实验组1、2、3,传统浓度细胞接种的作为对照组,各组样本数n均为3,分别于接种后3天、1周、2周和4周进行观察和检测。结果接种后3天实验各组无明显差异,细胞在材料上黏附伸展良好。1周和2周时,各组细胞均有明显增殖,并分泌细胞外基质(ECM extra cellular matrix),但实验组1、2的ECM不如实验组3和对照组丰富,此后该现象更为明显。至第4周时,实验组1仅形成厚薄不均的薄膜状物,其余三组均形成组织样结构,但实验组2形成的细胞--材料复合物结构略为松散。结论应用本实验组中高浓度接种皮肤成纤维细胞在体外构建工程化组织可以达到传统所用更高浓度的接种效果,以节约细胞,减少取材。

α2-巨球蛋白对X线照射后人皮肤成纤维细胞的抗氧化及抗纤维化的作用

【目的】研究α2-巨球蛋白(α2M)对X线照射后人皮肤成纤维细胞(HSF)超氧阴离子(.O_2^-)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和HSF细胞向肌成纤维细胞转化过程中的影响。【方法】分别使用0、5、10、15、20 Gy X线照射HSF细胞,在照射后第1天检测细胞培养基上清液中。O_2^-含量、SOD活性的变化,在照射后第5天采用Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达变化,以选定合适的照射剂量。用以上合适剂量照射HSF细胞,分别于照射前1 h、照射后1 h实验组细胞培养基中加入终浓度为0.25 mg/m L,0.5 mg/mL的α2M,检测并比较不同实验组细胞培养基上清液中.O_2^-含量、SOD活性和α-SMA蛋白表达的变化情况。【结果】5~20 Gy X线照射HSF细胞后,.O_2^-含量逐渐增多,SOD活性逐渐降低,α-SMA蛋白表达量逐渐升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。10 Gy X线照射后1 h加入α2M,可明显减少照射后HSF细胞。O_2^-含量,提高SOD活性,下调放射后HSF细胞α-SMA的蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05),照射前1 h给药则无明显变化。【结论】X线照射后的HSF细胞明显增加.O_2^-释放量,同时SOD活性降低,并有向肌成纤维细胞转化的趋势;而X线照射后加入α2M可明显减少受照射HSF细胞的.O_2^-释放量,提高其SOD活性,并抑制向肌成纤维细胞转化的趋势,说明α2M可通过抗氧化和抗纤维化起到放射保护作用。