豆豉溶栓酶的分离纯化及其体外溶栓作用

目的：从豆鼓中分离具有纤溶活性的酶，并对其体外溶栓作用作初步研究。方法：采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００和 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０柱层析法纯化该酶，以纤维蛋白平板法测定该酶的纤溶活性；两点法测定该酶对发色底物Ｈ２２５１的水解活性；体外试管法测定该酶对天然人血凝块的溶解作用。结果：经过两次柱层析得到在ＰＡＧＥ中呈单一区带的纤溶酶。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ初步测定其分子量为 ３６ ０００。该酶在平板中可直接溶解纤维蛋白，对Ｓ－２２５１的水解活力与牛纤溶酶相当，并能溶解天然人血凝块。结论：豆鼓中存在一种具有较强纤溶活性的溶栓酶，值得进一步深入研究。

海洋假单胞菌纤溶酶的体外溶栓实验研究

目的确证血纤维蛋白溶酶的体外溶栓作用。方法用血纤维蛋白平板法、体外血块溶解实验研究该酶的纤溶特点及对血块的溶解作用。结果可直接水解血纤维蛋白 ,溶栓活性同蝮蛇抗栓酶类似 ,但对红细胞形态没有影响。结论血纤维蛋白溶酶是一种直接纤溶酶 。

体外溶栓试验确定急性脑梗死治疗中尿激酶用量的研究

目的探讨体外溶栓试验确定尿激酶用量进行急性脑梗死溶栓治疗的效果.方法对急性脑梗死患者立即应用体外溶栓试验寻找处于溶栓状态的尿激酶用量进行溶栓,以后持续7 d应用尿激酶40万U维持溶栓治疗.在溶栓治疗不同时间进行神经功能缺损程度评分及测定纤维蛋白原(Fbg)浓度、聚合反应速率(FMPV)、最大吸光度(ODmax)、FMPV/ODmax.结果溶栓治疗组疗效明显高于非溶栓组(P＜0.05),＜6 h治疗组疗效优于6～24 h治疗组,6～24 h治疗组优于非溶栓组(均P＜0.05).Fbg浓度、FMPV、FMPV/ODmax溶栓后开始下降,而于溶栓后24 h反弹达到高峰,随后再下降,于第5 d再次显著升高,与溶栓后其他时间段相比差异有显著性(均P＜0.05),ODmax无明显变化.溶栓组并发出血1例(2.17%),非溶栓组无出血患者.结论应用体外溶栓试验确定尿激酶用量进行急性脑梗死溶栓治疗是安全有效的.

纳豆激酶的分离纯化及体外溶栓特性研究

通过硫酸铵分步沉淀和Sephadex G-100凝胶过滤层析,分离纯化纳豆激酶,并用SDS-PAGE和PAGE电泳检测纯化效果,体外溶栓试验检测纳豆激酶的溶栓特性。SDS-PAGE显示纳豆激酶为单一条带,分子量为33kDa,而PAGE至少有3个具有纤溶活性的区域,表明纳豆激酶可能由几种同工酶组成,体外溶栓结果表明:与蚓激酶相比,纳豆激酶具有较强的的体外溶栓和抗凝作用,并有一定的溶血作用。

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究

目的研究纳豆纤溶酶体外溶栓和溶血作用。方法体外溶栓和溶血实验方法。结果纳豆激酶粗酶(NKc)体外溶栓作用显著,高剂量(2836U)和低剂量(1418U)作用血凝块6h后,溶解率分别为88%和74%,蚓激酶(150000U)为87%;溶血实验结果表明,NKc有溶血作用。结论NKc有溶栓和溶血作用。

淡豆豉提取物的体外溶栓特性研究

为了探讨各种因子对豆豉溶栓酶体外溶栓能力的影响 ,将豆豉溶栓酶放置于不同温度、酸碱度、金属离子强度及各种不同的化学物质中 ,测定其溶栓能力的大小。再加入各种类型的抑制剂 ,测定其溶栓能力的变化情况。以未经任何处理的同批次豆豉溶栓酶为对照组。结果豆豉提取物的最适存放温度为 4 5℃以下 ,最适pH为 8,Mn2 +、Ca2 +、Mg2 +显然对酶活有激活作用 ,添加明胶对溶栓酶活力起稳定作用。PCMB、TCLK、PMSF、胰酶抑制率几乎达 10 0 %。EDTA、β -巯基乙醇对此酶活性影响不大。

一种新型重组抗体导向溶栓剂的体外溶栓研究

目的 :探讨一种新型重组融合基因抗体导向溶栓剂SZ5 1Hu scuPA的体外溶栓效力。方法 :通过转瓶扩大生产获得的大量基因重组融合蛋白SZ5 1Hu scuPA ,通过抗体竞争结合实验确定融合蛋白的抗体亲和力 ;进而与尿激酶进行不同浓度血小板血浆凝块体外溶栓比较。结果 :该融合蛋白体外纤溶活性为 390 0 0U mg ;其抗体亲和力是鼠源性单抗的 6 7% ;体外溶栓效力较uPA提高 4.1～ 8.4倍。结论 :体外溶栓结果证明 ,融合蛋白SZ5 1Hu scuPA既兼有与人活化血小板结合特性又有纤溶酶原激活剂特性的双功能分子 。

体外溶栓试验确定急性脑梗死治疗中rt-PA用量的研究

目的 应用体外溶栓试验确定急性脑梗死重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）溶栓剂量,了解个体化rt-PA治疗的有效性及安全性。方法 对发病6h内的急性脑梗死（ACI）患者,根据体外溶栓试验中处于溶栓状态的rt-PA剂量作为个体化溶栓治疗剂量,进行溶栓治疗,监测患者溶栓前及溶栓后24h自然状态体外血栓长度、湿质量,并于溶栓前和溶栓后2h、24h、10d进行临床神经功能缺损评分,监测并发症,并与非溶栓组比较。结果 不同患者应用rt-PA溶栓治疗剂量不同,介于0.6~0.8mg;不同浓度rt-PA状态下体外血栓长度不同,随浓度增加呈逐渐缩短趋势（P〈0.05）;溶栓后24h体外血栓长度、湿质量与溶栓前相比均降低（P〈0.05）;2组患者治疗前NIHSS评分差异无统计学意义（P〉0.05）,治疗后NIHSS评分均呈下降趋势,溶栓组溶栓后各时间点NIHSS评分均低于非溶栓组（P〈0.05）;全部病例均无出血并发症发生。结论 应用体外溶栓试验确定rt-PA用量行急性脑梗死个体化溶栓治疗安全有效。

低频超声联合尿激酶体外溶栓效果观察

目的:观察低频超声与尿激酶联合应用对体外血栓的促溶作用,并对其作用机理进行探讨。方法:制备全血血栓块按照不同实验方法分组:(1)生理盐水组(NS组);(2)尿激酶组(UK组);(3)超声组(US组);(4)超声联合尿激酶组(UK+US组)进行处理,检测处理后的血块重量丢失比和纤维蛋白降解产物D-D二聚体含量评价各组处理的溶栓效果。结果:US组与NS组相比血块重量丢失比和D-D二聚体含量的差异均有统计学差异意义,说明低频超声有明确的促溶作用;UK+US组的血块重量丢失比和纤维蛋白降解产物D-D二聚体含量相比UK组或US组均有显著的统计学差异。结论:低频超声可促进尿激酶的溶栓作用。

磁性纳米介孔材料携载尿激酶的体外溶栓实验研究

目的评价携载尿激酶的磁性纳米介孔材料在体外流体环境中的溶栓效果。方法制备血栓,接入体外流体模型中,分为4组,分别注入生理盐水、尿激酶、磁性尿激酶和磁性尿激酶加外磁场。称量溶栓前后的血栓质量,计算溶栓率,并记录再通的液体量。结果磁性尿激酶加外磁场组在靶位置可见明显的磁性尿激酶聚集。尿激酶组和磁性尿激酶组溶栓率相近,分别为(76.89±0.048)%和(75.42±0.094)%(P>0.05),磁性尿激酶加外磁场组溶解率达到(90.45±0.076)%,高于尿激酶组和磁性尿激酶组(P<0.05)。尿激酶组和磁性尿激酶组收集到再通的液体量分别为(42.47±1.834)mL和(39.70±5.028)mL(P>0.05);磁性尿激酶加外磁场组收集到的液体量达到(60.29±3.216)mL,高于前两组(P<0.05)。结论磁性纳米介孔材料作为溶栓药物的载体可以增强尿激酶溶栓的靶向性,能在流体条件下提高血栓的溶解率,为在体研究静脉阻塞的靶向性溶栓治疗奠定基础。

纳豆芽孢杆菌发酵液体外溶栓效果试验

纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌的重要代谢产物。为探究纳豆激酶的溶栓效果,以纳豆浸提液、纳豆激酶发酵液为供试材料,以鸡血块、人工血栓为供试反应底物,观察各反应物的溶栓效果。试验结果表明:纳豆激酶发酵液、纳豆浸提液有溶解人工血栓的作用;纳豆激酶发酵液和纳豆浸提液对鸡血块的溶解率分别为60%和52%。

重组SZ51Hu-scuPA融合蛋白的体外溶栓研究

目的 获得大量人源化抗人活化血小板单抗SZ5 1Hu和尿激酶原 (scuPA)融合蛋白SZ5 1Hu scuPA并测定该基因重组抗体导向溶栓剂的导向溶栓性。方法 通过转瓶扩大培养系统获得大量SZ5 1Hu scuPA ;通过抗体竞争结合实验证明融合蛋白的抗体亲和力 ;进而与尿激酶进行比较对不同浓度血小板血浆凝块的溶栓研究。结果 该融合蛋白在培养上清中的表达量为 5mg/ml;其纤溶活性为 390 0 0IU/mg ;抗体亲和力是鼠源性单抗的 6 7% ;体外溶栓效力较uPA提高 4 1～ 8 4倍。结论 该融合蛋白比uPA具有更高、更快的溶栓效率 。

富含纤溶酶豆豉冻干粉体外溶栓作用及急性毒性

使用本实验室制备的富含纤溶酶豆豉冻干粉,测定其提取液对大鼠血块的溶解率,并采用最大给药量法测定其急性毒性。结果表明10%、2.5%富含纤溶酶豆豉提取液对血块的溶解率分别为59.64%±5.69%和40.58%±6.37%,前者具有体外溶栓作用,而后者没有;富含纤溶酶豆豉冻干粉对小鼠经口急性毒性剂量大于16g/kg。可见,10%富含纤溶酶豆豉提取液具有体外溶栓作用,并且该豆豉冻干粉无毒,具有进一步的开发价值。

急性脑梗死体外溶栓试验血栓超微结构研究

目的:通过光镜和透射电镜观察急性脑梗死患者溶栓治疗过程中体外溶栓试验所得血栓纤维蛋白骨架结构致密度的变化,探讨溶栓治疗急性脑梗死的血栓结构动态改变的特征。方法:对发病12h内的急性脑梗死患者30例,立即应用体外溶栓试验寻找处于溶栓状态的尿激酶用量进行溶栓,并测定体外溶栓试验中血栓的长度、湿重,同时留取血栓做病理切片,观察体外血栓病理结构的改变,透射电镜下测量体外血栓图像中纤维蛋白的长度,然后用医学图像分析系统分析体外血栓电镜图像中纤维蛋白的百分含量(面密度)。入选的患者以后持续7d应用尿激酶40万单位维持溶栓治疗。并于溶栓前、溶栓后第1天、第3天、第7天对患者进行神经功能缺损评分。结果:不同浓度尿激酶状态下体外血栓纤维蛋白的长度及面密度不同,两两相比差异均有统计学意义(P<0.05);光镜下可见血栓的结构为纤维蛋白网罗红细胞、白细胞、血小板的混合性血栓结构。结论:体外模拟血栓的病理组织结构与人体内血栓组织结构相似,体外模拟血栓建模成功,体外溶栓试验可以用于临床指导急性脑梗死动态溶栓治疗。

纳豆激酶粗提液的体外溶栓抑菌实验

目的 探讨纳豆激酶粗提液的体外溶栓、抑菌作用。 方法 以大豆为培养基 ,米曲霉为菌种 ,发酵制得成熟纳豆 ,用不同饱和度 ( NH4) 2 SO4对粗提液进行盐析 ,所得沉淀溶于生理盐水中 ,用纤维蛋白平板法测定其活性 ,确定提取纳豆激酶的分级沉淀范围。用体外溶栓法测纳豆激酶粗提液的体外溶栓作用。用平板打孔法及纸片扩散法测不同浓度纳豆抑菌物质的体外抑大肠杆菌作用。 结果 纳豆激酶的( NH4) 2 SO4分级沉淀范围选择在 6 0 %。纳豆激酶粗提液对血块的溶解作用较同样活力大小的尿激酶强。纳豆抑菌物质粗提液对大肠杆菌都具有一定的体外抑制作用 ,当浓度大于 50 % ,抑菌圈直径随着浓度的增高而增大。 结论 纳豆激酶粗提液具有较好的体外溶栓作用 。

纳豆激酶体外溶栓作用研究

目的:以初凝的小鼠血块为样本模拟小鼠血栓,研究纳豆激酶不同浓度对小鼠的溶栓作用,从而得到溶栓效果好且不溶血的最佳纳豆激酶浓度。方法:采用天然界筛选的菌种发酵提取的2个批次的纳豆激酶NK-1、NK-2,分别稀释至1 000、500、250、125、62.5、31.25和15.63U/mL溶解小鼠体外血凝块,以尿激酶为对照,观测计算0～7h内血栓溶解率,并用显微镜及试管观察0～18h内溶栓与溶血效果。结果:500、1 000U/mL纳豆激酶在7h内能完全溶解0.12g左右的小鼠体外血凝块,125、250、500、1000U/mL的纳豆激酶溶解血凝块作用依次增强,表现出一定的剂量效应,尤其是发现125～250U/mL纳豆激酶体外溶栓效果较好,且溶血作用不明显,且500～1000U/mL纳豆激酶可能存在溶血作用。结论:该研究结果可为纳豆激酶新型药物的开发提供理论依据,而且具有一定的产业化参考意义。

大肠杆菌分泌表达纳豆激酶及体外溶栓特性分析

以Bacillus subtilis NK4基因组为模板,克隆出纳豆激酶(Nattokinase,NK)前导肽与成熟肽编码基因(NK),并采用同源重组方法将其与已报道的功能肽编码基因Cel或Fe及线性化质粒pET-22b构建出重组表达载体pET22b-Cel-NK与pET22b-Fe-NK,并转化于E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。经IPTG诱导表达后,实现了重组NK在大肠杆菌中的重组表达并具有生物活性,但SDS-PAGE仅检测到重组酶Cel-NK的可分泌表达及其具有酶催化活性,酶活力为(3.36±0.56) IU/mL,体外溶栓实验也表明该重组酶NK具有良好的体外溶栓效果,表明Cel有助于介导蛋白NK可活性分泌表达。

血蛭康胶囊提取工艺优化及其体外抗凝、溶栓活性研究

目的优化血蛭康胶囊提取工艺,并评价其体外抗凝、溶栓活性。方法在单因素试验基础上,以渗漉体积流量、乙醇体积分数、浸泡时间、乙醇用量为影响因素,阿魏酸提取率、干膏得率的综合评分为评价指标,正交试验优化提取工艺。采用凝血酶滴定法考察体外抗凝活性,血凝块溶解法考察体外溶栓活性。结果最佳条件为4倍量70%乙醇浸泡24 h,渗漉体积流量2 mL/min,综合评分为108.49分。胶囊体外抗凝活性值为240 U/g。与阴性组比较,血蛭康胶囊中、高剂量组小鼠血凝块溶解率升高(P<0.05,P<0.01)。结论该方法稳定可行,可用于提取体外抗凝、溶栓活性良好的血蛭康胶囊。

纳豆激酶体外溶栓效果的初步观察

在研究对产纳豆激酶的细菌进行筛选基础上,通过体外血凝块溶解实验、抗血凝实验和红细胞溶血实验,对不同菌株、不同酶活的纳豆激酶的溶栓、抗凝及溶血效果进行初步研究。研究结果显示:不同菌株纳豆激酶的体外溶栓和抗凝效果有很大差异;纳豆激酶酶活性对抗凝、溶栓和溶血效果有很大影响;与同等剂量的尿激酶相比,筛选出的自4、肽园等菌株所产纳豆激酶具有更强的抗凝和溶栓效果,而且安全性好,可望成为一种优良的新型溶栓制剂。

豆豉纤溶酶组分S-7FE-1的酶学性质及体外溶栓特性分析

从分自豆豉中的空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)S-7菌株中分离出1个具有较高活性的纤溶酶组分S-7FE-1,对其酶学性质以及体外溶栓、抗凝溶血特性进行研究。结果显示:S-7FE-1的最适作用温度30℃,最适反应pH8.0,在pH4～9,4～50℃之间活性稳定;Fe3+使S-7FE-1完全失活,而其它离子对其作用不明显;EDTA对S-7FE-1的活性抑制作用较大,PMSF能完全抑制其活性,表明该酶可能是含金属离子的丝氨酸蛋白酶。体外溶栓试验结果表明,其具有良好的溶栓及抗凝作用,不会引起溶血现象。