应用依赖随机化末端连接物聚合酶链反应技术研究重铬酸钾对大鼠肺p53基因DNA损伤

应用依赖随机化末端连接物PCR(RandomizedTerminalLinker-dependentPCR ,RDPCR)技术于体内试验的研究 ,从而检测特定基因的DNA损伤。腹腔注射重铬酸钾染毒大鼠 ,提取肺组织基因组DNA ,经p5 3基因外显子 7特异性引物P1重复直线延伸后与接头 (Linker)连接 ,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR扩增 ,电泳、转印 ,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果显示 ,在 2 0 .0mg kg和 40 .0mg kg剂量下 ,出现了两条清晰的杂交带 ,表明重铬酸钾可引起大鼠肺p5 3基因外显子 7的DNA损伤 ,且有两个损伤位点。此结果有助于进一步探讨六价铬化合物的致突变机制 。

p53基因单链探针在RDPCR技术中的应用研究

目的 制备单链探针替代原有的双链探针 ,以解决RDPCR技术中存在的杂交效率较低及特异性较差的问题。方法 应用不对称PCR及单引物PCR技术制备大鼠p5 3基因外显子 7单链探针 ,再经RDPCR扩增比较单链与双链探针的杂交效果。结果 不对称PCR及单引物PCR技术制备单链探针均获得成功 ;目的基因单链探针杂交条带清晰且几乎无背景值。结论 与双链探针比较 ,单链探针的应用可以明显提高RDPCR技术杂交的敏感性及特异性。

应用RDPCR技术检测饮用水有机浓集物对大鼠p53基因的损伤作用

目的运用依赖随机化末端连接物聚合酶链式反应(RDPCR)技术检测环境中混合污染物的DNA损伤作用。方法将水样有机浓集物腹腔注射染毒SD大鼠,提取肝、肺、肾及白细胞的DNA,运用RDPCR技术检测其对大鼠p53基因外显子7的DNA损伤作用。结果水样有机浓集物对大鼠的基因组DNA具有断裂作用;经RDPCR、杂交显色后在大鼠肝、肾组织中检测到了杂交条带,而血及肺组织中未检测到杂交条带。结论RDPCR技术可成功地运用于检测环境混合污染物。水样有机浓集物对大鼠p53基因外显子7具有DNA损伤作用,其主要靶器官为肝和肾。

氯化消毒饮用水浓集物对ras基因的DNA损伤作用

目的运用依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)技术检测氯化消毒饮用水浓集物对ras基因的DNA损伤作用,探讨其可能致癌作用分子机制。方法采用酚-氯仿-异戊醇法提取人的类淋巴母细胞(TK6)的DNA,采用PCR法制备人类N-ras基因外显子1、2和H-ras基因外显子1、2(以下分别简称为N1、N2、H1、H2)单链探针。将采集的某自来水厂水源水和管网末梢水各150L进行浓集,分别以0.1、0.5、1L/ml的剂量(相当于原水)对TK6细胞进行染毒,提取基因组DNA,再经RDPCR扩增,扩增产物与N1、N2、H1、H2单链探针杂交、显色。结果管网末梢水水样浓集物染毒组DNA经N2特异性引物指导下的RDPCR扩增产物,与N2单链探针杂交,在1L/ml浓度组观察到1条杂交显色条带,在0.1、0.5L/ml浓度组均未观察到杂交条带;经H1、H2、N1特异性引物指导下的RDPCR扩增产物与相应的基因特异性单链探针杂交,在0.1、0.5、1L/ml浓度组均未观察到杂交条带。水源水水样浓集物染毒组DNA经N1、N2、H1、H2特异性引物指导下的RDPCR扩增产物与相应的基因特异性单链探针杂交,在0.1、0.5、1L/ml浓度组均未观察到杂交条带。结论氯化消毒饮用水浓集物对N2具有DNA损伤作用,具有遗传毒性。

联苯胺对大鼠P53基因损伤作用及器官特异性研究

目的探讨联苯胺对大鼠作用的主要靶器官及其遗传毒性作用机制。方法将联苯胺腹腔注射染毒SD大鼠,提取肝、肺、肾及膀胱组织的DNA,运用单链探针依赖随机化末端连接物聚合酶链反应(RDPCR)技术检测其对大鼠P53基因外显子7的DNA损伤作用。结果杂交显色后在大鼠肝、膀胱、肺组织检测到了杂交条带,而肾组织未检测到杂交条带。结论联苯胺对大鼠P53基因外显子7具有DNA损伤作用,其致癌机制可能与P53基因损伤有关,联苯胺对大鼠的主要靶器官为肝、膀胱和肺。

二氯乙酸对ras基因的DNA损伤作用

目的研究二氯乙酸(dichloroacetic acid,DCA)对ras基因的DNA损伤作用,探讨其致癌作用分子机制。方法制备各ras基因外显子单链探针;DCA染毒TK6细胞,提取基因组DNA,再经RDPCR扩增,扩增产物与探针杂交显色。结果成功制备各ras基因外显子单链探针,Southern杂交检测到DCA对N-ras基因外显子2和H-ras基因外显子2的DNA损伤片段杂交条带,未检测出其对N-ras基因外显子1和H-ras基因外显子1的DNA损伤作用。结论DCA可造成ras基因DNA损伤,可能与其致癌作用机制密切相关,属于遗传毒性物质。