克里米亚-刚果出血热病毒新型治疗性抗体研制展望

随着人们认识的增加,烈性传染性病毒不断被发现和鉴定,高致病性、高传播性的病毒往往由于变异,导致反复流行。如在非洲和阿拉伯半岛多次暴发1931年首次分离到的裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)[1];1937年发现于非洲,并于1999年传入美国且在多个州暴发的西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)[2-3];1944、1956、1965年分别发现于俄国克里米亚、非洲刚果和我国新疆巴楚地区的克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus,CCHFV),1967年分离出该病毒,被我国称为新疆出血热病毒(Xinjiang haemorrhagic fever virus,XHFV)[4]。1967年在德国首次发现马尔堡病毒(Marburgvirus,MARV)[5];1976年发现,随后在非洲反复暴发流行的埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)[6];1998—1999年在马来西亚暴发,2001—2009年连续在印度和孟加拉国流行的尼帕病毒(Nipahvirus,NiV)[7-8];2002年底出现,2003年在我国暴发流行的SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)[9];2012年出现于沙特阿拉伯,具有高致死率的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)[10];2013年在我国多地出现的H7N9型流感病毒[11]。自2009年以来,中国加强了急性发热性疾病的监测与管理,发现了一种不明原因的严重发热伴血小板减少综合征(SFTS),该病由一种新型病毒引起,命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒,简称新布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome visus,SFTSV)[12]。目前,上述病毒感染几乎没有特效药物和疫苗,因此,针对其研制特效药物,对于提高其防治水平、保障我国国民健康,具有非常重要的意义。

天山黑客──克里米亚-刚果出血热病毒

克里米亚－刚果出血热病毒（ＣＣＨＦＶ）属于布尼亚病毒科内罗病毒属，是分节段单负链ＲＮＡ虫媒病毒。该病毒引起的以发热、出血为典型特征的急性烈性传染疾病－克里米亚－刚果出血热（ＣＣＨＦ），病死率高达６７％。我国的新疆出血热病毒（ＸＨＦＶ）为ＣＣＨＦＶ成员，所引起的新疆出血热曾两度爆发流行，危害甚大。本文综述了ＣＣＨＦＶ／ＸＨＦＶ的形态结构、理化性质及某些生物学特性。

克里米亚-刚果出血热的诊断与治疗进展

克里米亚－刚果出血热（ＣＣＨＦ）是由克里米亚－刚果出血热病毒（ＣＣＨＦＶ）引起的以发热、出血为典型特征的病死率极高的急性烈性传染性疾病。我国发生的ＣＣＨＦ称为新疆出血热（ＸＨＦ）。本文综述了该病的病原诊断、抗体检测及抗病毒治疗方面的进展。

克里米亚-刚果出血热病毒反向遗传学系统的开发及应用

克里米亚-刚果出血热正内罗病毒(CCHFV)是引发烈性传染病克里米亚-刚果出血热的病原体。由于CCHFV基因组为3节段负链RNA,且最大的节段长达12 kb,操作难度极大,因此其反向遗传学系统的发展较为缓慢,直至2015年才成功构建了基于质粒的全病毒拯救系统。本文就克里米亚-刚果出血热正内罗病毒反向遗传学系统的研究进展及应用做简要综述。

克里米亚-刚果出血热病毒流行和预防

据医学空间网10月4日报道（原载Curr Opin Infect Dis 2007 Oct；20（5）：495—500），关于克里米亚-刚果出血热病毒的流行和预防，希腊科学家Vorou教授和同事指出，克里米亚-刚果出血热病毒是由蜱传播的、从人到人的、动物源性传染病，在亚洲、欧洲东南部和非洲的广阔区域都有流行，疾病后期主要表现为出血症状，病死率在10％-50％。他们回顾了最近关于克里米亚-刚果出血热病毒流行和治疗的文献。

欧洲克里米亚-刚果出血热的流行现状

克里米亚．刚果出血热（CCHF）是一种急性的高致病性人畜共患病，主要在非洲、亚洲、中东和欧洲东部流行。牛、绵羊、山羊和野兔是主要的动物宿主。人可通过璃眼蜱属（Hyalomma）叮咬或直接接触CCHF病毒感染者血液和组织而感染。典型的临床症状有突发高热、头痛和胃肠道不适。10％～50％的患者以出血为主要症状。

肯尼亚首次发现人克里米亚-刚果出血热病例

2000年10月21日,一名以往健康的25岁男性农民因患急性出血性疾病而住入肯尼亚西部的一家医院。患者在入院前4天发病,突然出现发热、头痛、恶心、呕吐、严重肌痛、腹泻和血样便等症状。入院时体温36.4℃、脉搏60次/分、呼吸20次/分、血压90/40mmHg,并出现颈项强直。鉴别诊断包括细菌性痢疾和脑膜炎;血涂片疟原虫检查和伤寒肥达氏试验阴性,脑脊液和尿检正常。

克里米亚-刚果出血热病毒特征核酸序列克隆载体的构建

目的构建含有克里米亚-刚果出血热病毒特征序列的克隆载体。方法设计RT-PCR引物及反应体系,从克里米亚-刚果出血热病毒RNA中扩增获得目的序列,进行分离纯化和回收,将纯化的扩增片段与pMD18-T载体进行连接,进行酶切鉴定与测序鉴定。结果确定检测克里米亚-刚果出血热病毒一步法RT-PCR的反应条件及体系,引物终浓度为400 nmol/L,反应条件为:50℃30 min,94℃4 min,94℃30s,57℃30 s,72℃30 s,35cycles.成功将CCHF的特征序列片段克隆,pMD18-T载体经DNA测序鉴定正确。结论构建的pMD18-CCHF质粒,可用于克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR实验的阳性对照。

新疆克里米亚-刚果出血热病毒株S基因分子生物学特性研究

目的对新疆地区2005年分离自亚洲璃眼蜱的3株克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒株进行S基因序列测定并分析比较该病毒的分子生物学遗传特性。方法应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒基因组S片段,纯化后直接测定其核苷酸序列,用DNASTAR软件对测定的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行比较分析。结果3株病毒s基因都由1673个核苷酸组成,开放阅读框均为1449个核苷酸,编码482个氨基酸,3株病毒间核苷酸及氨基酸同源性序列为99．5％,与其他已发表的9株CCHF病毒株的核苷酸序列同源性在92．7％-99．8％之间。这3株病毒与已分离的7001和79121株同属1个基因组,序列相差2％-3％之间。与尼日利亚的原型株IBAR10200的差异性为13％,远大于与中国原型株66019之间的6．8％的差异。结论中国株为相对独立的一个类群,新疆自治区境内不同地区分离的CCHF病毒S基因分子结构差异相对较小。

克里米亚-刚果出血热相关生物学研究进展

克里米亚-刚果出血热（CCHF）是一种典型的蜱传自然疫源性疾病，是在特定的生态环境中由病原体（克里米亚-刚果出血热病毒，CCHFV）、宿主媒介、动物（蜱类、大型草食动物和啮齿动物）构成的不依赖于人类而在自然界中可独立存在的传染性疾病，广泛分布于非洲、欧洲、亚洲和中东地区的30多个国家。

基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法的建立

目的建立基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法。方法建立探针偶联至荧光微球、多重PCR扩增方法、杂交检测方法,并对所建立的液相芯片检测方法的灵敏度和特异性进行评价。结果建立的液相芯片检测方法能对基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒中的任意1种、任意2种或者3种同时进行筛查检测,基孔肯亚热病毒检测的灵敏度为1×104copies/PCR,克里米亚-刚果出血热病毒检测的灵敏度为1×105copies/PCR,裂谷热病毒检测的灵敏度为1×103 copies/PCR。该方法对汉坦病毒、埃博拉病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、马尔堡病毒的检测结果均为阴性。结论该方法具有高通量、多重检测、快速、敏感、特异的特点,为基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒的筛查检测提供一种新方法。

克里米亚-刚果出血热病毒可视化逆转录环介导等温扩增快速检测法的建立

目的 建立克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV）的可视化逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RTLAMP）快速检测法.方法 体外合成CCHFV的S基因,构建重组质粒,体外转录为模板RNA,在线设计3组LAMP引物,使用实时浊度仪筛选出最佳引物,以羟基萘酚蓝（Hydroxynaphthol blue,HNB）作为指示剂,建立可视化RT-LAMP反应体系.结果 实时浊度检测结果显示合成的3组LAMP引物中第1组引物的扩增效率最高,峰值出现于20 min.添加环引物后,扩增效率进一步提高,13 min即可达到峰值.利用最佳引物建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法最低检测限浓度为10拷贝/μl,检出时间为30 min,较巢式RT-PCR法和实时定量RT-PCR法分别高1-3个数量级.该方法稳定性好,不会与症状相近的病原体如肾综合征出血热汉坦病毒（汉滩型和汉城型）、马尔堡病毒、新型布尼亚病毒、埃博拉病毒（GP蛋白和VP蛋白）产生交叉反应.结论 建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法,灵敏度好、特异度高、快速廉价、操作简单,无需开盖即可直接观察结果,适用于条件有限的基层单位和偏远地区.但仍需临床样本进行进一步验证.

NanoLuc标记的重组克里米亚-刚果出血热病毒及其初步用于抗病毒药物筛选

目的为了构建可分泌表达NanoLuc荧光素酶的重组克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)并探讨其用于抗病毒药物高通量快速初筛的可行性。方法将NanoLuc基因与CCHFVM节段上的mucin编码框融合,拯救重组病毒,并以利巴韦林为阳性对照,评估Furin抑制剂在体外对重组病毒的抑制效果。结果成功获得可分泌表达NanoLuc荧光素酶的重组CCHFV(rCCHFV_mucin_NLuc),且在感染细胞上清中,表示NanoLuc活性的相对光单位(relative light unit,RLU)与病毒半数组织感染剂量(TCID50)呈显著正相关性(cor=0.998,P=0.001)。10μmol/L浓度下,Furin抑制剂处理后1~3d感染细胞上清中NanoLuc荧光素酶活力与利巴韦林处理组无明显差异(P>0.1),但第4天Furin抑制剂处理组上清中RLU值显著高于利巴韦林处理组(P=0.001),且与未处理病毒对照组无明显差异(P>0.1)。结论成功构建1株NanoLuc标记的rCCHFV并可用于抗病毒药物的体外快速初筛。

克里米亚-刚果出血热病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感检测克里米亚-刚果出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法分析克里米亚-刚果出血热病毒S基因片段核酸序列的保守性,设计实时荧光RT-PCR引物和探针,优化引物和探针浓度,确定最佳反应体系,并进行灵敏性、重复性、特异性检测。结果建立的克里米亚-刚果出血热病毒实时荧光RT-PCR方法的检测灵敏性为7.26×10^2 copies/μl,重复性好,与汉坦病毒等无交叉反应。结论建立的克里米亚-刚果出血热病毒实时荧光RT-PCR法能准确、快速地检测克里米亚-刚果出血热病毒。

感染乳鼠组织中克里米亚-刚果出血热病毒的RT-PCR检测与形态学鉴定

目的:检测并鉴定感染组织中的克里米亚-刚果出血热病毒。方法:分别经皮下与腹腔两种途径感染乳小鼠;应用RT-PCR技术对病毒核酸进行检测;利用透射电镜超薄切片技术对病毒进行形态学鉴定。结果:RT-PCR可在心脏、肝脏、脾脏、肾脏以及脑组织内检测到病毒核酸,透射电镜下可在肝细胞胞浆内观察到形态典型的病毒粒子。结论:应用RT-PCR技术可以对感染组织中的克里米亚-刚果出血热病毒进行检测,利用透射电镜可以对病毒的形态进行观察与鉴定。