基于水稻内含子长度多态性开发禾本科扩增共有序列遗传标记

通过在多态位点两侧的保守编码序列上设计引物,可以开发出在不同物种间通用的基于PCR的分子标记,称为扩增共有序列遗传标记(ACGM)。【目的】探讨利用已公布的水稻籼、粳两亚种的基因组序列开发禾本科ACGM的可行性。【方法】根据水稻两亚种间的内含子长度多态性,开发了38对ACGM引物。用这些引物对玉米、粟、大麦、小麦、竹子、旱稗草和大米草6个属共12个不同材料进行PCR实验。【结果】几乎所有引物都可在至少1种材料中扩增出特异条带,而1/3以上的引物可以在全部供试材料中获得特异扩增产物。在每一种供试材料中,平均大约有2/3的引物可以成功扩增出目的条带。这些引物在各属内不同种、亚种或品种(系)之间的多态性比例在24.1%～90.3%之间,平均为44.6%。【结论】利用水稻基因组序列信息开发禾本科通用型ACGM是可行的。

共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应在呼吸道副黏病毒科病毒诊断中的应用

采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物聚合酶链反应(CODEHOP PCR)体系和商品化RV12试剂盒对急性呼吸道感染患儿下呼吸道标本中的副黏病毒科病毒进行检测,比较CODEHOP PCR与RV12试剂盒检测结果的符合率和敏感度,观察CODEHOP PCR在临床呼吸道标本中对副黏病毒诊断的应用价值,进一步探讨具备检测已知呼吸道病毒和未知新病毒特点的CODEHOP PCR在呼吸道疾病谱和未知潜在呼吸道病毒诊断中的推广价值。采集2011年上海市儿童医院因急性呼吸道感染住院的患儿下呼吸道标本572份,分别采用2种方法对副黏病毒进行检测。CODEHOP PCR检测出阳性标本113例,阳性率为19.76%;RV12试剂盒检测出阳性标本102例,阳性率17.83%;2种方法检测符合率为85.39%。以10倍倍比稀释呼吸道合胞病毒A(RSVA)感染的细胞收获液,检测结果显示,CODEHOP PCR和RV12试剂盒检测下限分别为10-8和10-6。CODEHOP PCR具备简便、易操作和测序精度高等特点,适合疾病预防系统和临床检验科使用。该方法与一些新兴的高通量快速分子诊断技术结合,可提高检测灵敏度,具有高通量、快速检测和筛查未知新病毒的优势,在呼吸道病原体检测领域值得进一步优化和推广。

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应指纹图谱技术用于细菌分型的研究进展

肠道细菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)指纹图谱技术利用普遍存在于生物体内的ERIC进行引物设计,通过基因扩增,获得能够表征其基因组结构的产物,该方法简单易行、重复性好、用时短,被广泛应用于细菌基因分型及同源性判别。本文简述细菌分型的研究背景和ERIC-PCR指纹图谱技术的原理及特点,归纳该技术在细菌基因分型方面的优缺点及其在常见食源性致病菌基因分型中的应用现状,并对ERIC-PCR指纹图谱技术应用于乳品企业污染菌溯源的研究进行展望。

评价全血DNA二代测序共有序列在人类免疫缺陷病毒优势准种研究中的准确性

目的评价二代测序共有序列对人类免疫缺陷病毒(HIV)优势准种分析的代表性和准确性。方法共收集29个HIV感染病例的32份全血样本,其中3个病例在随访期间发生耐药,分别采集治疗前和耐药后的两份样本。提取样本DNA,分别用二代测序和一代测序方法测定HIV pol区扩增产物序列。利用软件Sequencher(4.10.1)和Bowtie 2(v2.2.5)处理一代和二代测序数据,并利用自建分析脚本确定二代测序共有序列,利用Mega软件进行聚类分析,比较二代测序共有序列与一代测序序列的差异。结果聚类分析结果表明,90.6%(29/32)来自于同一样本的序列被聚类在同一分支上,平均可信度为95.5%;与一代测序序列结果相比,二代测序平均每个碱基准确率为99.6%,完全不一致位点中碱基转换占81.6%(155/190),数量最多的为鸟嘌呤(G):腺嘌呤(A),共74个(占39.0%、74/190)。结论二代测序共有序列与一代测序序列具有较高的一致性,二代测序共有序列可用于HIV优势准种分析,具有较好的代表性和准确性。

登革病毒共有序列候选DNA疫苗的免疫原性和保护性研究

目的研究登革病毒(Dengue virus,DENV)共有序列候选DNA疫苗pVAX1-cE80在小鼠体内的免疫原性及其保护作用。方法首先利用pVAX1-cE80 DNA免疫BALB/c小鼠,通过ELISA和噬斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)分别检测免疫后小鼠血清中抗登革病毒的4种血清型(dengue virus serotype 1-4,DENV1-4)IgG抗体和中和抗体(neutralizing antibody,nAb)效价;利用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测小鼠脾细胞分泌DENV1-4特异性Th1/Th2型细胞因子的能力;通过攻毒试验评价疫苗对DENV1-4感染的保护作用。结果接种疫苗的小鼠可产生针对DENV1-4的四价抗体,其中抗DENV2抗体水平最高,IgG抗体和nAb效价分别为1∶1086和1∶120;免疫后小鼠脾细胞在DENV1-4抗原刺激下均可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;疫苗免疫可为小鼠提供针对DENV1-4的部分保护作用。结论单一共有序列登革病毒候选DNA疫苗可诱导小鼠产生四价体液免疫反应和细胞免疫反应,并为小鼠提供部分保护作用,为登革病毒共有序列疫苗的研发奠定了基础。

SlNPV PK基因的部分序列分析

ＳｌＮＰＶ基因组ＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ－ＸｂａⅠ片段上含有部分的ＰＫ基因．ＳｌＮＰＶＰＫ的氨基酸序列与ＨａＮＰＶ，ＨｚＮＰＶ，ＳｐｌｉＮＰＶ，ＡｆＮＰＶ，ＡｃＮＰＶ，ＬｄＮＰＶＰＫ氨基酸序列的同源性分别为４５％，４４％，８９％，３７％，３８％和３７％，其上含有蛋白激酶的特征序列ＩＶＨＡＮＤＶＫＬＥＮ－ＶＬ．

大数量序列的PCR保守引物设计实践

引物设计前的序列的全面检索,未注释序列的归类,经多序列比对求带有模糊碱基代码标识(IUPAC ambiguity codes)的共有序列,对设计高质量的引物至关重要,是引物设计过程的难点。目前,综合性核酸序列分析软件,单功能应用软件,在解决上述问题时均显不足。应用互联网提供的在线生物应用程序实践了一种多程序组合使用设计大数量序列的保守引物的方法,探讨了实现大数量序列的保守引物设计的一般流程。

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨,并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数。结果显示40株副溶血性弧菌分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性。根据SPSS10.0软件得出的树状图结果,REP-PCR可以把40株菌分为21个型,分辨力指数可达到0.953,优势菌型为G1型;ERIC-PCR可将40株菌分成4个型,分辨力指数为0.5。研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析,REP-PCR具有较好的分型能力。在两种PCR的DNA指纹图谱中,血清型O1群与O3群主条带均非常相似,表明它们之间亲缘关系密切。

进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌分子分型方法的比较研究

为研究来自不同地域幼虫芽孢杆菌的进化关系,建立其分子分型方法,对来自11个国家和地区的50株幼虫芽孢杆菌分离株进行MLST分型分析,并与ERIC分型比较。结果显示,ERIC法将50株分离株分为ERICⅠ、ERICⅡ与ERICⅣ型,但不能区分不同区域菌株;MLST法将菌株分为ST1至ST8共8种序列型,其中ST1为优势型,占比高且分布广泛;其次为ST5(主要为加拿大分离株),ST3(澳大利亚分离株),ST4(法国与匈牙利分离株),ST6(新西兰分离株),ST2(西班牙分离株),ST7(匈牙利分离株)和ST8(澳大利亚分离株)。与ERIC相比,MLST可以对不同地域的幼虫芽孢杆菌进行有效分型,具有更高的分辨率,可作为后续进口蜂蜜中幼虫芽孢杆菌流行病学调查的工具。

重症监护病区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的主动筛查及基因分析

目的调查重症监护病区(ICU)患者在住院期间碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)主动筛查菌株的分布以及CRE耐药基因的检测和分析。方法收集424例ICU患者直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子样本,采用肉汤增菌法进行CRE阳性病例的主动筛查,全自动药敏分析仪进行体外药敏试验,PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因,通过多位点序列分型(MLST)和肠杆菌基因间重复共有序列PCR分析CRE菌株的同源性关系。结果直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子CRE筛查阳性率分别为12.5%、5.0%和4.2%,CRE菌株主要来自肺炎克雷伯菌(82.6%)、大肠埃希菌(9.8%)和产气肠杆菌(4.3%),CRE菌株对替加环素、头孢他啶阿维巴坦敏感性较好(>90%);92株CRE碳青霉类耐药基因检测,以blaKPC-2亚型(91.3%)为主;MLST分型结果显示76株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)主要为ST11型(69.7%)和ST15型(28.9%);ERIC-PCR扩增结果分析显示,76株肺炎克雷伯菌主要为谱型A(69.7%)和谱型B(28.9%)。结论ICU住院患者CRE主动筛查以blaKPC-2亚型的CRKP为主,MLST分型和ERIC-PCR扩增结果聚类分析发现主要存在两个克隆株传播。

肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性分析及ERIC-PCR分型

目的：了解肉鸡生产链中肠炎沙门氏菌耐药性情况以及各生产环节菌株间亲缘关系,为临床用药及菌株追踪溯源提供依据。方法：采用微量肉汤稀释法对171株肠炎沙门氏菌进行13种抗菌药物药敏实验;采用肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR）法对33株不同生产环节耐药菌株进行分子分型;采用SPSS 20.0软件、Gel-Pro Analyer 4.0和NTSYS pc 2.1软件进行分析。结果：171株肠炎沙门氏菌对13种药物耐药情况不同,其中对氨苄西林耐药情况最严重,耐药率高达90.06%,对恩诺沙星、氧氟沙星最为敏感,耐药率均仅为5.26%;不同环节间耐药性差异极显著（P〈0.01）;多重耐药率高达95.32%,共有26种耐药谱型。不同环节的33株肠炎沙门氏菌分为4种（Ⅰ~Ⅳ）基因型,遗传相似性在66%~100%,Ⅰ型为优势基因型;基因型相同的菌株耐药谱不一定相同,反之,耐药谱相同的菌株基因型不一定相同。结论：肉鸡生产链条中沙门氏菌对多种抗菌药物产生耐药性,且耐药谱种类繁多;沙门氏菌能够沿着生产链进行水平传播,肉鸡场环节菌株基因型相对复杂,菌株基因型与耐药表型之间无明显相关性。

大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响

应用肠杆菌基因间重复共有序列基因扩增(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)和聚合酶链式反应--变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)研究大蒜多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的影响。灌胃红星二锅头建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,ERIC-PCR和PCR-DGGE电泳获得肠道菌群指纹图谱,分析肠道菌群的相似性和多样性并鉴定优势条带序列。ERIC-PCR结果表明急性酒精性肝损伤模型小鼠肠道菌群结构发生明显改变,以360 bp的条带为优势条带,610 bp左右的条带强度减弱,大蒜多糖预防给药组中360 bp左右的条带强度减弱。PCR-DGGE结果显示急性酒精性肝损伤的小鼠肠道菌群多样性指数降低,优杆菌属和乳酸菌属细菌明显减少。大蒜多糖高剂量组的多样性指数和均匀度指数最高,优杆菌属和乳酸菌属细菌增多。大蒜多糖可以促进肠道中优杆菌属和乳酸菌属生长,调节急性酒精性肝损伤伴有的肠道菌群失调。

UC和其它肠道疾病肠道菌丛结构的ERIC-PCR指纹图谱分析

目的建立溃疡性结肠炎(UC)和其它肠道疾病的肠道细菌DNA指纹图谱以分析其肠道菌丛的整体差异。方法采集19例UC、11例急性胃肠炎、6例IBS患者及11例正常对照者的粪便标本,提取肠道细菌总DNA;应用ERIC-PCR技术建立各组肠道细菌DNA指纹图谱,分析UC、急性胃肠炎、IBS患者及正常对照者的肠道菌丛的整体差异。结果经分析发现四组研究对象的肠道菌丛存在整体差异:UC组ERIC-PCR指纹图谱电泳DNA条带较少,IBS组、急性胃肠炎组和正常对照组ERIC-PCR指纹图谱电泳DNA条带多;UC组中有18个样本主带分布非常一致,均出现在约0.7 kb处,急性胃肠炎组主带分布也非常一致,均出现在约1.1 kb和0.8 kb处;正常对照组和IBS组主带位置无统一趋势。结论与IBS、急性胃肠炎和正常对照组相比较,UC组肠道优势菌群种类少;UC组和急性胃肠炎组各有分布较一致的主带;UC可能存在较单一的肠道优势细菌,推测其发病机制可能与特定的肠道优势细菌感染有关。

H1亚型流感病毒通用疫苗的构建及其对小鼠免疫保护效力研究

本研究旨在为研制一种安全、有效并具有广泛保护作用的流感病毒通用疫苗进行初步的探索。从Gen-Bank上获得所有H1亚型经典猪源流感病毒和甲型流感病毒的HA基因序列,通过系统进化分析获得其共有序列,并对共有序列进行密码子优化(Optimized consensus,opti-CS),同时将H1亚型的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和重组甲型流感病毒rPan09(H1N1,其HA和NA来自A/Swine/California/04/09,其余6个片段来自PR8的重组病毒)的HA基因分别进行密码子优化(opti-G11,opti-r09),并将这3种片段与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒pCA-opti-CS、pCA-opti-G11和pCA-opti-r09。将重组质粒瞬时转染293T细胞,检测HA基因在哺乳动物细胞中的表达情况。免疫6～8周雌性BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔3周,同时设立空载体pCAGGS对照。三免2周后从每个质粒免疫组中选取一半小鼠每只以50μL 103.87 EID50的剂量接种A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)病毒,另一半小鼠每只以50μL 107.45 EID50的剂量接种rPan09病毒。采集血清,对HA抗体水平、HI滴度、细胞因子产生情况、肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果显示:重组质粒中HA基因均能够在哺乳动物细胞中有效的表达。pCA-opti-CS免疫后能够诱导小鼠产生较高的HA抗体水平,较高的HI滴度,并且能够诱导机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ。肺组织病毒含量测定以及组织病理学观察结果显示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS免疫后能够有效限制病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)和rPan09HA在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。结果提示:HA共有序列密码子优化的DNA疫苗pCA-opti-CS能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,并具有较好的交叉保护效力,能够保护小鼠抵抗异源流感病毒的攻击。本研究为流感通用疫苗的研究提供了有益的参考。

2型糖尿病患者肠道菌群两种分子指纹图谱分析研究

目的：利用重复共有序列（ERIC）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）两种分子指纹图谱技术对2型糖尿病患者肠道菌群结构特征分析，探讨2型糖尿病与肠道菌群的相关性及对两种方法的评价。方法收集8例健康人和7例2型糖尿病患者粪便样本，提取粪便菌群总 DNA，采用 ERIC-PCR 和 DGGE-PCR 分子指纹图谱技术对两组人群肠道菌群结构分析，比较其多样性、相似性等生态学特征。结果与健康对照组比较，2型糖尿病患者肠道菌群图谱条带和 Shannon-Wiener 多样性指数降低，但无统计学意义；组内相似性降低差异有统计学意义（P ＜0.05），菌群结构发生变化；两种指纹图谱技术均能直观反映肠道菌群结构特征，ERIC 方法简便，反映菌群多样性良好，但是实验影响因素较多，不可切胶测序；DGGE 能较好反映菌群多样性、相似性等生态学特征，而且可选择条带切胶测序。结论2型糖尿病患者肠道菌群组成结构发生改变，糖尿病的发生与肠道菌群有一定相关性；ERIC 和 DGGE 是研究肠道菌群分辨效率高、重复性好的指纹图谱技术， DGGE 并可进行切胶测序比对鉴定细菌，二者可结合使用。

基因表达芯片探针选择的一种有效方法

为了减少基因表达芯片探针选择的计算量,采用最大共有序列准则大大减少了需要计算的候选探针数量,并通过不断扩大进行计算的探针数目保证探针选择的效果.结果表明该方法是十分有效的,探针选择的结果也是令人满意的.

简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR(CODEHOP-PCR)在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。

巴斯德杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立巴斯德杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为实验动物的呼吸道细菌的控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对Genbank中13株巴斯德杆菌的RNA聚合酶β亚基(rpo B)氨基酸序列设计简并引物。对建立CODEHOP PCR方法用21株参考菌株进行特异性和敏感性评价,并应用于实验动物中的巴斯德杆菌检测。结果简并引物Past F6/PastR5扩增标准菌株的目的片段为200 bp左右。能够区分受试的巴斯德杆菌和主要的实验动物呼吸道病原菌。敏感性为0.2 pg/μL^2 pg/μL。在受试的609只实验动物中呼吸道样品中检测出巴斯德杆菌阳性率为19.1%。样品阳性片段经测序验证,准确率为100%。结论所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于动物样品中巴斯德杆菌的检测。

利用分子标记早期筛选光皮桦核心种质

利用扩增共有序列遗传标记对光皮桦种质资源基因园中62份样品所代表的519份光皮桦种质资源的遗传多样性进行分析,结果筛选出36份光皮桦的核心种质。t检验结果表明,核心种质的观测等位基因数、有效等位基因数、Nei遗传多样性指数和Shannon信息指数在概率0.01水平上与初始种质差异不显著,说明核心种质能很好的代替初始种质。

慢传输便秘大鼠肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱分析

目的应用细菌基因共有重复序列指纹图谱技术,探讨慢传输便秘肠道菌群的变化。方法选取Wistar大鼠30只,随机分为对照组15只、造模组15只,造模组给予易蒙停灌胃。收集每24 h排出粪便,计数排便粒数,称量粪便质量,及24 h进食量及进水量,通过碳末灌胃测定肠道传输时间。留取造模组与对照组不同时段粪便,提取肠道细菌DNA,进行ERIC-PCR指纹图谱分析。结果造模组大鼠24 h内排便粒数、排便质量、进食量较对照组明显减少,进水量没有明显差异。造模组大鼠肠道传输时间明显高于对照组。造模组大鼠肠道菌群ERIC-PCR结果优势条带依然存在,但是较对照组及给药前条带增多且亮度增高。结论易蒙停给药致慢传输便秘大鼠造模成功,造模组大鼠肠道菌群较对照组ERIC-PCR结果可能存在细菌数量及种类增多。