农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展

在水稻遗传转化过程中,农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多,比如转入的外源DNA结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等,已被广泛应用于转基因技术中。本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述,并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。

农杆菌介导注射法建立番茄子叶瞬时表达系统

背景:转基因植物生产口服疫苗具有较大的优势及广阔的应用前景。目前,关于番茄瞬时表达系统的研究罕见报道,对番茄瞬时表达条件进行优化,可使植株的遗传转化效率大幅度提高。目的:利用农杆菌介导的注射法,建立番茄子叶瞬时表达系统,检测植物表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8中外源基因的转录水平。方法:通过对番茄无菌苗的培育,观察不同番茄品种的出芽数、成苗数及农艺学性状的差异显著性,筛选出适用于此实验的番茄品种,将前期构建的植物表达载体pCAMBIA-E8-APB-DOCK8转化到农杆菌EHA105中,通过对番茄子叶、注射农杆菌浓度、农杆菌注射量、生长苗龄以及共培养天数进行筛选,建立农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,观察报告基因的转录水平。结果与结论:初步建立番茄子叶瞬时表达系统,筛选出适合的番茄品种为欧洲大红(苹果型),选材部位为番茄的子叶,注射农杆菌浓度A600为0.2-0.7,农杆菌注射量为50μL,苗龄为7-10 d,共培养24-48 h。该实验为后期外源基因蛋白表达分析研究提供一种方便、快捷和有效的方法。

基于农杆菌介导法将CP4-EPSPS基因转入玉米自交系B73的研究

【目的】建立玉米遗传转化体系培育抗除草剂玉米材料,解决玉米杂草危害问题。【方法】采用农杆菌介导法在玉米自交系B73幼胚中转入抗除草剂基因(CP4-EPSPS),通过PCR、qRT-PCR鉴定转基因植株;利用ddPCR技术筛选低拷贝转基因植株,并对低拷贝植株进行草铵膦抗性鉴定。【结果】在所获得的181株抗性植株中12株为阳性,转基因植株的外源抗除草剂基因(CP4-EPSPS)在转录水平上均能正常表达;转基因植株中筛选到低拷贝植株5株;抗性鉴定证明转基因植株均具有草铵膦抗性。收获T1代转基因低拷贝植株种子5份。【结论】建立了以B73为受体,基于农杆菌法介导的玉米遗传转化体系。

油菜下胚轴农杆菌介导法转化影响因素探讨

利用甘蓝型油菜下胚轴为外植体,对油菜农杆菌介导转化中的主要因素进行了研究,并由此建立了油菜下胚轴农杆菌介导的遗传转化体系。研究发现,在农杆菌介导的油菜下胚轴转化中,较好的转化体系是:外植体在农杆菌侵染前进行3d的预培养。农杆菌的浸染浓度为OD600=0.2～0.4。共培养时的pH值为5.2。在转化后的分化培养基中附加30μmol/LAgNO3。

影响农杆菌介导狗牙根遗传转化的因素

农杆菌LBA4404/pCAMBIA1301介导转化狗牙根的体系中,遗传转化的最佳优化条件是:胚性愈伤组织预培养10 d,农杆菌菌液浓度为OD600 0.5～0.8,共培养时间为2d.共培养基中添加100μmol·L-1乙酰丁香酮能有效地提高植物瞬时表达率.侵染处理方法中滤纸滴加法比浸泡法效果更好.黑暗条件下的瞬时表达率比12 h光照/12 h黑暗培养条件下的高.在最佳优化条件下狗牙根的GUS瞬时表达率达到36.36%.

农杆菌介导果树遗传转化因素分析研究进展

根癌农杆菌介导遗传转化系统是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的转基因技术。该技术广泛应用于双子叶植物,迄今为止已获得的近200种转基因植株中,80%以上植物是利用该方法获得成功的。根癌农杆菌介导果树遗传转化研究最常用的方法为叶盘法。叶盘法（leave dish transformation）是Horsch等研究出的转化方法,其优点是适用性广,即对于能被农杆菌感染,并能从片再生出植株的各种植物都适用；改良的叶盘法广泛应用于其他外植体即茎段、叶柄、胚轴、子叶等材料。农杆菌介导法在遗传转化过程中，有多种因素影响其转化效率，主要因素有受体材料的再生系统的建立、预培养时间、农杆菌的侵染能力和浓度及侵染时间、共培养时间及方式、筛选培养等。本文通过分析农杆菌介导法在遗传转化过程中的影响因素，为利用转基因技术进行种质创新提供理论依据。

农杆菌介导法获得小麦转基因植株的研究

从 gus基因的瞬时表达入手 ,利用不同种类的农杆菌菌株感染小麦不同基因型和同一基因型的不同外植体 ,研究了农杆菌菌系、小麦基因型和外植体对转化效率的影响。从中优选出了对小麦愈伤组织感染力比较强的农杆菌菌系 AGL 0和 MOG10 1,以及高敏感受体基因型 Alondra和扬麦 15 8等。实验结果还表明 ,预培养 10～ 15天的幼胚愈伤组织具有较高的瞬时表达率和再生能力 ,是较好的转化受体。对愈伤组织与农杆菌共培养后的筛选程序进行了摸索 ,获得了 70多个 PPT(Phosphinothricin)抗性植株 ,经 PCR等分子检测分析 ,证明部分植株实现了外源基因的成功转化 ,为进一步的研究工作打下了基础。

农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立

粳稻品种牡丹江 8号具有繁殖周期短、对多个白叶枯病和稻瘟病生理小种感病或高度感病的优点 ,因此 ,是水稻抗白叶枯病和抗稻瘟病基因克隆研究中候选基因功能验证的一个理想受体。本试验通过对农杆菌侵染参数的优化 ,建立了农杆菌介导的牡丹江 8号高效转基因操作体系。在 3次重复试验中 ,该转基因操作体系抗性愈伤转化率分别为 6 7.5 %、 75 .8%和 70 .0 % ,抗性植株转化率分别为 36 .2 %、 4 2 .1%和 37.9% ,具有较高的转基因效率和转基因稳定性 ;

根癌农杆菌介导TA29-Barnase基因转化甘蓝型油菜的研究

经比较影响农杆菌介导Barnase嵌合基因转化甘蓝型油菜的各种因素后 ,建立了高效稳定的转基因实验体系。按该体系 ,甘蓝型油菜“湘油 15”子叶柄预培养 2 0h ,OD60 0 为 0 5农杆菌菌液感染后共培养 3d ,在MS +2mg·L-1AgNO3 +4 5mg·L-1BA +10mg·L-1Km +30 0mg·L-1Carb培养基上进行选择 ,转化率为 8 8% ,PCR检测和Southern杂交检测证明外源基因已整合了甘蓝型油菜基因组中。

农杆菌介导的苏云金杆菌抗虫基因cryIA(b)和cryIA(c)在水稻中的遗传转化及蛋白表达

通过农杆菌介导法用含有抗潮霉素和 Ｇ Ｕ Ｓ 基因的双元载体将杀虫结晶蛋白基因ｃｒｙ Ｉ Ａ（ ｂ） 和ｃｒｙ Ｉ Ａ（ｃ） 导入到籼、粳稻幼穗愈伤组织中，然后经过在含有不同浓度潮霉素的培养基上进行数次筛选，获得一批 Ｂｔ 转基因株。经 Ｐ Ｃ Ｒ、 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交及 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析证实此二基因已整合进水稻中，饲虫试验结果表明，转基因株具有１００ ％ 杀虫率。

根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株

为改良草坪型高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)的耐逆性,以成熟种子来源的胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐逆相关CBF1基因导入4个供试品种的基因组,经GUS染色、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得了112株转基因植株,转化频率为0.92%～2.87%,不同品种间存在差异.试验表明,在高盐与高渗胁迫下,转基因植株具有显著生长优势,存活率极显著高于非转化对照植株,经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率平均较对照植株低25%～30%,证明转基因植株的耐逆性有所增强.考察发现,非胁迫条件下CBF1基因的组成型超表达使转基因植株的生长受到抑制.

甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株

由双拷贝CaMV35S启动子驱动担子菌灰树花 (Grifolafrondosa)的海藻糖合酶基因 (TSase)构建植物表达载体 pBBBT ,通过三亲交配法将 pBBBT导入根癌农杆菌EHA10 5菌株 ,经根癌农杆菌介导转化甘蔗 (Saccha rumhybrid)栽培品种 ,以增强甘蔗的抗旱能力。结果表明 ,甘蔗胚性愈伤组织对EHA10 5菌株敏感 ,甘蔗外植体开始大量形成胚性愈伤组织时是感染的适宜时期 ,用膦丝菌素 (PPT)筛选 ,抗性植株发生频率平均为 4 .5 %。经PCR及dot Southern检测证明 ,TSase已经整合到甘蔗基因组中。部分转化植株根叶畸形、株型异常、生长缓慢。移栽到含PEG80 0 0 17.4 % (w/v)的MS培养基后 。

农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立

以籼稻恢复系明恢86为材料,探讨受体材料、愈伤代龄、预培养时间、筛选时间等因素对转化效率的影响,并建立了高效稳定的农杆菌介导籼稻转化体系。转化技术参数如下,水稻花后15 d幼胚诱导的胚性愈伤(2～6代),作为转化受体材料,经4 d预培养,农杆菌侵染30 min,共培养3 d后,在30 mg·L-1潮霉素筛选出抗性愈伤,抗性愈伤经50 mg·L-1潮霉素筛选10～15 d后立即分化,幼胚的胚性愈伤转化频率可达6.98％,并且能够周年转化。

甘蓝下胚轴的高效再生和农杆菌介导B.t.基因转化甘蓝

分别对取材时间和培养基组成进行研究，建立了甘蓝下胚轴外植体的高效再生系统，当选取6～7d苗龄的下胚轴，将其置于MSB＋BA2．5mg／L＋ZT1mg／L＋IBA0．1mg／L的芽分化培养基中，并于培养基中附加AgNO37．5mg／L时，最高的芽分化频率，“夏光甘蓝”母本“103”可达81．67％，父本“60天早椰菜”可达78．56％。在此基础上，我们对影响转化频率的不同因素，即：抑制农杆菌生长的抗生素种类及其浓度、预培养的有无及感染时的浓度、下胚轴外植体与农杆菌的感染时间和共培养时间、筛选时抗生素的加入时间进行了探讨。共获得100余株卡那霉素抗性植株，全部移栽成活，生长良好。对转基因植株总DNA进行Southernblotting分析，证明nptⅡ基因已整合到甘蓝植株细胞基因组中。

农杆菌介导棉花大规模高效转化体系的研究

对农杆菌介导法转化棉花技术体系进行了综合改进,突破基因型的限制,使多品种或基因型 10个以上 的我国主栽棉花品种 系 转化成功,其中中棉所24号发展成为快速模式化转化品种 转化周期5～7个月,转化率8.1% ,CCRI27、CCRI36等多个品种转化体系基本成熟.不同转化体系的愈伤组织诱导率为10%～40%,愈伤组织胚性愈伤诱导率达到10%～40%,转化率总体平均达到1.8%,并对大批量再生苗的鉴定予以程序化.实现棉花转基因规模化,达到年产转基因棉花植株2000～4000株以上的水平.

建立青菜(Brassica chinensis)农杆菌介导法基因转化体系

以青菜地方品种矮脚黄、苏州青的子叶、子叶柄、真叶为外植体，在改良ＭＳ培养基上离体培养获得再生植株。在不定芽诱导培养基中添加２～２０ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３可显著提高子叶不定芽诱导频率；添加０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ和１～２ｍｇ／ＬＣＰＰＵ既可提高不定芽诱导频率，又可获得较多数量的不定芽。用含ＣｐＴＩ基因和ＮＰＴＩＩ基因的农杆菌感染子叶，获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。培养基中添加羧苄青霉素促进子叶再生不定芽，头孢霉素和卡那霉素则抑制子叶再生。卡那霉素敏感性测定结果表明，当培养基中含卡那霉素１０ｍｇ／Ｌ时。

根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究

采用携带pUbi-Ecppc质粒的3个根癌农杆菌菌株(LBA4404、EHA105和C58c1),对经过预培养10-12 d的春小麦品种扬麦158、Bobwhite和扬麦12的幼胚愈伤组织进行了遗传转化,对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、受体基因型、菌株-质粒组合等影响转化的重要因素进行了研究。首次将单子叶野生C4植物稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ecppc)导入不同基因型小麦受体,并得到具有潮霉素(Hyg)抗性的转化植株。从816块共培养愈伤组织中转化得到34株抗性植株,其中14株PCR检测为阳性。扬麦158的转化效率达3.03%。Southern和RT-PCR分析表明,外源基因已整合到小麦基因组并得到正确的转录。生理学检测显示,转基因小麦植株的光合速率和PEPC活性都有所提高。说明Ubiqintin基因启动子控制的稗草PEPC cDNA基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。这些工作为进一步探讨PEPC对小麦光合作用及其他生理过程的影响奠定了基础。

农杆菌介导的油菜脂肪酸调控基因工程研究

采用农杆菌介导法 ,将反义的油酸脱饱和酶基因 (Fad2基因 )导入油菜 ,获得了7株转基因植株。与对照植株比较 ,有 5株转基因油菜产生的种子中脂肪酸含量发生变化 ,表现为油酸含量升高 ,亚油酸、亚麻酸含量降低 ,其中油酸最高含量为 68.72 % ,比对照高 2 0

通过农杆菌介导法将Bt(cryIA)基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因 (cryIA)导入大豆。从发芽 5 - 7天的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌感染和共培养后 ,在选择培养基上 4周左右出现抗性不定芽。将不定芽转移到芽伸长培养基上 ,4 - 6周后再生苗长至 2 .5 - 3cm高。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2周左右生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入盆中 ,所有植株均能正常开花结荚。在移栽成活的 8株T0 植株中有 7株PCR检测呈阳性反应 ;在 7个T1株系中有 4个株系存在PCR阳性植株。取 4个稳定遗传的T1代株系内的阳性植株的叶片提取DNA ,用地高辛标记的Bt基因探针进行Southern杂交分析 ,结果 4个株系均呈现阳性 ,证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内并能传递给后代。

农杆菌介导的中国水仙遗传转化体系的建立

利用根癌农杆菌介导法将 GUS基因导入中国水仙 ,组织化学法检测转化后共培养 3d的水仙鳞茎盘组织块 ,GUS基因瞬时表达很好 ,90 %以上的材料呈现大面积的蓝色斑块 ,取筛选培养 2 0d的材料检测 GU S基因的稳定表达 ,约 1%的组织块有蓝色反应 .水仙预培养 10 d后转化 ,转化前在菌液中加入 60 μmol/ L AS活化 2～ 3h,转化率提高了两倍以上 .转化材料在 MS+ BA10 + NAA0 .2+ Cef30 0 + Hyg30 培养基上培养 2 0 d左右分化出小鳞芽 ,频率约为 60 % ,组织块平均出芽 5 .7个 ,最多可达 14个 ,小鳞芽 10 d后长成小鳞茎 .