克里米亚-刚果出血热病毒新型治疗性抗体研制展望

随着人们认识的增加,烈性传染性病毒不断被发现和鉴定,高致病性、高传播性的病毒往往由于变异,导致反复流行。如在非洲和阿拉伯半岛多次暴发1931年首次分离到的裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)[1];1937年发现于非洲,并于1999年传入美国且在多个州暴发的西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)[2-3];1944、1956、1965年分别发现于俄国克里米亚、非洲刚果和我国新疆巴楚地区的克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus,CCHFV),1967年分离出该病毒,被我国称为新疆出血热病毒(Xinjiang haemorrhagic fever virus,XHFV)[4]。1967年在德国首次发现马尔堡病毒(Marburgvirus,MARV)[5];1976年发现,随后在非洲反复暴发流行的埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)[6];1998—1999年在马来西亚暴发,2001—2009年连续在印度和孟加拉国流行的尼帕病毒(Nipahvirus,NiV)[7-8];2002年底出现,2003年在我国暴发流行的SARS冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)[9];2012年出现于沙特阿拉伯,具有高致死率的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)[10];2013年在我国多地出现的H7N9型流感病毒[11]。自2009年以来,中国加强了急性发热性疾病的监测与管理,发现了一种不明原因的严重发热伴血小板减少综合征(SFTS),该病由一种新型病毒引起,命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒,简称新布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome visus,SFTSV)[12]。目前,上述病毒感染几乎没有特效药物和疫苗,因此,针对其研制特效药物,对于提高其防治水平、保障我国国民健康,具有非常重要的意义。

新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定

1983年通过病毒形态学的鉴定,证明了新疆出血热病毒是布尼安病毒科(Bunyaviridae)的成员。本次通过血清学方法与布尼安病毒属的西姆波组SMB-48株和内罗病毒属的刚果病毒K2/61株的免疫腹水进行比较。采用补体结合试验、反向被动血凝抑制试验和双抗体夹心抑制ELISA试验进行鉴定的结果,发现新疆出血热病毒与布尼安病毒属的代表毒株SMB-48株没有血清学联系,而与内罗病毒属的刚果病毒有显著的抗原关系。从而证明新疆出血热病毒与布尼安病毒属无关。其抗原性与内罗病毒属克里米亚-刚果出血热病毒一致。

广西首例牛源鹿流行性出血热病毒的分离鉴定

为了解广西反刍动物鹿流行性出血热病毒(EHDV)的感染情况,本研究在广西马山县设立牛羊虫媒病监控点,筛选EHDV抗体阴性的10头牛和5只羊作为哨兵动物,分别混养在EHDV抗体阳性的牛群及羊群中,采取白天放牧,夜间赶回栏舍的方式饲养。采用竞争性ELISA全年监测其抗体转阳情况,取抗体阳转动物的红细胞,接种BHK-21细胞分离EHDV。以RT-PCR、病毒中和试验等对分离株进行鉴定,结果在3头哨兵牛EHDV抗体转阳前后的7份抗凝血中分离到3株病毒,TCID50分别为102.5/0.1 m L、102.83/0.1 m L和102.5/0.1 m L,血清型均为EHDV-5型。该结果为首次在广西牛群中分离到EHDV,表明广西反刍动物存在EHDV感染。本研究为国家监测反刍动物重要虫媒病毒病流行情况和疫病风险分析提供了有价值的参考资料。

用单克隆抗体分析流行性出血热病毒的核蛋白抗原位点

17株针对流行性出血热病毒(EHFV)L99株和C4株核蛋白(50kd)的单克隆抗体(McAb),根据抗原性分析可分为组特异性、型特异性(野鼠型或家鼠型),以及反应谱不全的亚组特异性McAb。这表明,在EHFV核蛋白上不仅有组特异性抗原决定簇,而且有型特异性抗原决定簇,采用竞争性酶联免疫吸附试验,以亲和层析纯化的核蛋白傲为抗原,用这些McAb分析L99株和C4株核蛋白的抗原位点,在两株病毒核蛋白上各发现了至少7个共有的位点,3个野鼠型和两个家鼠型病毒特有的位点,组特异性抗原位点至少分布在两个独立的区域,其构象和分布在不同毒株表现不尽相同,无论野鼠型或家鼠型病毒,其型特异性抗原位点均较集中在一个独立区域内。

肾综合征出血热病毒气溶胶动物实验感染研究

为了研究HFRSV的吸入感染性和动物与动物间空气传播感染,用TK_2型气溶胶发生器发生H8205株病毒气溶胶,引入动态气溶胶暴露装置并对实验动物进行暴露.以AGI微生物气溶胶采样器进行采样,以Vero-E_6细胞空斑法分析病毒含量,对病毒耐气溶胶化和吸入病毒剂量进行了测定.对染毒动物产生气溶胶引起交叉感染能力进行了观察.结果表明:HFRS病毒雾化30min回流液病毒存活50%,AGI冲击5分钟其效价下降不明显.数种动物对该病毒气溶胶比较敏感.在本实验装备和条件下其气溶胶乳小鼠吸入0.065pfu全部感染;离乳小鼠吸入0.72pfu几乎全部感染;乳小鼠半数吸入致死量(ILD50)为0.57pfu.从乳小鼠脏器组织分离出了HFRS病毒.结果认为,气溶胶传播是HFRS流行的重要危险因素.

肾综合征出血热病毒对人外周血单个核细胞产生细胞因子的影响

目的研究肾综合征出血热(HFRS)病毒对人外周血单个核细胞(PMBC)产生细胞因子的影响。方法用HFRS病毒A69株及脂多糖(LPS)单独或联合作用于PMBC,于作用后12、24、48、72、96h分别收集培养上清液,用ELISA法检测上清液中细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ的含量,实验数据用方差分析处理。结果病毒感染和LPS能使PBMC分泌TNF-α、IL-6和IFN-γ能力增强。感染后12h,TNF-α和IFN-γ开始升高,于感染后24h达高峰,然后开始下降;而IL-6水平于感染后72h达高峰,然后开始下降。HFRS病毒与LPS联合作用显著提高病毒诱导PBMC分泌TNF-α、IL-6和IFN-γ的能力。结论HFRS病毒能提高PBMC分泌TNF-α、IL-6和IFN-γ的能力,LPS可增强病毒诱导PBMC分泌细胞因子的能力,在HFRS病毒感染过程中合并细菌感染可能调节细胞因子介导的疾病进程,细胞因子在HFRS病毒的致病与免疫过程中可能起重要作用。

肾综合征出血热病毒对人血管内皮细胞感染性的研究

目的 研究肾综合征出血热 (HFRS)病毒在血管内皮细胞 (HEC)内的增殖 ,及病毒对HEC产生几种细胞因子的影响。方法 采用微量免疫酶斑法检测HFRS病毒A6 9株感染HEC后病毒繁殖动态变化 ,间接免疫荧光法检测HEC内HFRS病毒抗原。ELISA法检测HFRS病毒感染上清液中TNF -α、IL - 6和IFN - β的含量。 结果 病毒感染后 1d即可在培养上清中用微量免疫酶斑法测出病毒 ,病毒滴度 5d达高峰 ,以后下降。在一定范围内病毒产量随病毒感染复数 (multiplicityofinfection ,M0I)的增加而增高。间接免疫荧光法证明感染的HEC胞浆及胞膜上携带肾综合征出血热病毒抗原。电镜和光镜下 ,感染细胞未见明显的形态和结构改变。病毒对HEC产生TNF -α无影响 ;产生IL - 6和IFN - β明显增高。 结论 HFRS病毒可在原始靶细胞HEC内增殖。HFRS病毒感染后所出现的微血管损害可能不是病毒直接损害所致 ,而很可能与间接因素有关。

重组新疆出血热病毒S和M基因疫苗诱导小鼠免疫应答的评价

目的选取新疆出血热病毒M基因（编码糖蛋白Gn,Gc）和S基因（编码核蛋白NP）部分基因片段,并进行部分片段的嵌合,分别插入至真核表达载体PVAX1中构建重组质粒,并将重组质粒分别免疫小鼠,评价其诱导的体液和细胞免疫应答的效果。方法将NP（aa1~482）、NP2（aa170~305）和糖蛋白Gn（aa529~820）、Gc（aa1050~1697）片段,及Gc-NP2片段分别构建到真核表达载体PVAX1上构建重组质粒,用重组质粒免疫小鼠,通过T细胞增殖试验,细胞因子含量测定和ELISA对免疫效果进行评价。结果经双酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。pVAX1-NP2实验组小鼠的血清抗体效价可以达到1∶6 400,pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2实验组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显,两组的IFN-γ的表达水平也高达（865.15±6.29）pg/mL及（1727.21±33.93）pg/mL,与对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.01）。pVAX1-NP2及pVAX1-Gn实验组IL-4的表达水平为（19.11±1.20）pg/mL和（20.07±1.67）pg/mL,都显著高于对照组的（9.35±1.82）pg/mL（P〈0.05）。结论成功构建了多个重组真核表达载体,免疫小鼠后获得了效价高,特异性好的抗体。各重组质粒都激起了较强的体液免疫及细胞免疫,pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2实验组效果最好,可将其作为新疆出血热病毒的候选疫苗。

肾综合征出血热病毒50K结构蛋白免疫学特性的初步研究

以McAb亲和层祈纯化的HFRS病毒50K结构蛋白免疫BALB/c小鼠,证明其具有较好的免疫原性,可刺激产生中和抗体。该抗体不仅可中和细胞培养中的病毒,对HFRS病毒感染裸鼠也有一定保护作用。

从家鼠型疫区家畜家禽血清中检出流行性出血热病毒抗体

本文报告从山西农村流行性出血热(EHF)疫区家畜家禽血清中检出EHF病毒抗体的初步结果。在8种动物的520份血清标本中,用反向被动血凝抑制试验(RPHI)在6种动物的49份(19.42％)标本中检出EHF抗体。阳性血清的抗体滴度在1:10～1:80之间。抗体阳性率分别为狗20.95％(22/105),猪11.76％(11/119),羊6.06％(6/99),兔4.08％(4/98),牛3.85％(1/26),鸡2.90％(2/69)。3份驴和1份骡血清未检出EHF抗体。结果表明,家鼠型EHF疫区中,上述6种动物可被EHF病毒自然感染,同时说明在多种动物大数量血清流行病学调查中,RPHI是一种简便的满意方法。这些受感染的动物,在流行病学及动物流行病学中的意义,尚待进一步研究。

免疫转印技术在肾综合征出血热病毒多肽抗原研究中的应用

本文应用免疫转印技术(Immunoblotting)对我国分离的肾综合征出血热(HFRS)病毒抗原性多肽进行了分析,发现HFRS病毒50Kd多肽上可能存在着属特异性抗原决定簇。观察并讨论了实验条件对结果的影响,选择了最佳实验条件。

流行性出血热病毒抗体IgM对流行性出血热的诊断意义

目的探讨流行性出血热病毒IgM抗体对流行性出血热确诊的临床意义。方法收集临床疑似流行性出血热(epidemic hemorrhagic fever,EHF)患者血清185例,正常人血清30例,进行流行性出血热病毒抗体IgM(EHF-IgM)酶联免疫吸附试验,并对该试验进行灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和诊断有效率分析。结果(1)185例样本共检出36例EHF-IgM抗体阳性,其中35例最后确诊为流行性出血热,1例确诊为登革热;检出149例EHF-IgM抗体阴性,其中8例临床确诊为流行性出血热,其余141例经临床观察,排除流行性出血热。30例正常人血清EHF-IgM抗体均为阴性。(2)EHF-IgM抗体灵敏度为81.40%、特异性为99.30%、阳性预测值为97.22%、阴性预测值为94.63%诊断有效率为95.14%。结论酶联免疫吸附试验检测流行性出血热IgM抗体,操作简便快速,灵敏度较高,特异性强,可为临床早期诊断提供依据。

流行性出血热病毒经人体胎盘传播及其在人胎部份脏器定位的研究

应用 Vero—E6细胞,从一例患流行性出血热（EHF）孕妇流产胎儿的肝、肾、肺三种脏器中分离出病毒,经鉴定证实为 EHF 病毒,同时发现相应脏器有明显的病理改变。以上表明 EHF 病毒可经胎盘感染胎儿,定位于胎儿的肝、肾、肺脏,并可直接造成病理损害。

海南省克里米亚─刚果出血热病毒血清抗体检测结果分析

本文首次报告海南省从本土２～３月龄羊羔血清中检出克里米亚─刚果出血热（ＣＣＨＦ）病毒ＩｇＧ抗体，阳性率１．０８％（２／１８６）；人和其它动物未检出阳性。表明海南省低山丘陵地带的澄迈县永发镇、儋州市峨蔓乡存在着ＣＣＨＦ的自然疫源地。

家鼠型肾综合征出血热病毒单克隆抗体的制备与鉴定

以家鼠型HFRS病毒R22株免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14融合,获得了23株能稳定分泌HFRS病毒特异性McAb的杂交瘤细胞系。以18株不同型别的HFRS病毒株进行分析,结果表明上述McAb中有些为HFRS病毒组特异性的,有些为家鼠型特异性的。有2株McAb对家鼠型HFRS病毒株具有较高的中和活性,对HFRS病毒R22株感染乳鼠也有明显的保护作用。

肾综合征出血热病毒Z10株在Vero细胞上传代适应和增殖动态

目的为了肾综合征出血热病毒滴度达到规模化生产要求。方法将肾综合征出血热病毒 Ｚ１０ 株在Ｖｅｒｏ细胞上传代适应，不同时间取样，测定病毒滴度。结果从第２代即可稳定达到高滴度。转瓶培养比静 止培养的病毒峰值出现的更早，第 ４ ｄ即可达到１０８／ｍｌ以上，且可多次收液。结论初步确立了疫苗生产中病毒制 备工艺。

微斑免疫酶技术在检测肾综合征出血热病毒及其特异抗体中的应用

本文报道一种简便且快速的方法—微斑免疫酶技术(MPIPA),检测Vero-E6细胞培养的肾综合征出血热(HFRS)病毒及其特异抗体,并与免疫荧光技术(IFA),酶联免疫吸附技术(ELISA)进行比较。结果,本法用于检测HFRS患者血清IgG抗体和抗HFRS病毒单克隆抗体(McAb),其敏感性介于ELISA和IFA之间;用于检测Vero—E6细胞培养的病毒,阳性结果比IFA和细胞病变(CPE)出现早。MPIPA具有简单,快速、敏感性高、特异性好,结果易判定诸优点,便于基层医疗单位推广应用,适合于临床HFRS血清标本的检测和血清流行病学调查。

中国流行性出血热病毒的抗原性研究——不同毒株间交叉免疫荧光和交叉中和试验

用不同来源EHF病毒毒株免疫家兔制备相应的抗血清,对各株病毒进行交叉免疫荧光测定和交叉中和试验,结果显示交叉免疫荧光法难以对我国不同来源病毒抗原性差异作出型别判断。交叉中和试验,根据同株与异株中和抗体滴度相差4倍的判断标准,可将病毒分为三个不同的类型:Ⅰ型(野鼠型):Chen、A_(96)、A_3及汉坦76-118;Ⅱ型(家鼠型):R_(22);Ⅲ型(中间型):H_(8205)、L_(99)。Ⅰ型抗体对Ⅱ型(R_(22))病毒与Ⅰ型病毒有相同的中和效力。反之,R_(22)(Ⅱ型)抗体对Ⅰ型病毒的中和滴度则低于同型的4倍;Ⅲ型L_(99)株兼有部份Ⅰ型及Ⅱ型病毒相同水平的中和抗体滴度,而H_(8205)株又缺乏Ⅱ型及Ⅰ型中另一些毒株有效中和能力。