我国华东与华南地区养殖鱼类迟缓爱德华氏菌分离株的多样性分析

目的对17株来源于我国华东与华南地区的养殖鱼类迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)分离株进行多样性分析。方法通过菌体血清凝集试验及16S rRNA与hsp60部分基因序列的聚类分析。结果菌体血清凝集试验结果显示,鳗源迟缓爱德华氏菌ETY的抗O血清可凝集大部分鱼源迟缓爱德华氏菌;人源迟缓爱德华氏菌标准株ATCC15947的抗O血清仅与鱼源迟缓爱德华氏菌WY37有交叉凝集;鲶鱼爱德华氏菌EIV的抗O血清与鱼源迟缓爱德华氏菌无交叉凝集。2株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1和E29L与以上3种爱德华氏菌抗O血清不发生凝集反应。基于16S rRNA及hsp60部分基因序列构建的系统发育进化树显示,来源于不同地区的绝大部分鱼源迟缓爱德华氏菌分离株进化同源性较高,在基于16S rRNA构建的系统进化树中,山东地区分离自大菱鲆的迟缓爱德华氏菌聚为一支。3株鱼源迟缓爱德华氏菌AL60306NA1、E29L、GK4与人源迟缓爱德华氏菌ATCC15947及人源鲶鱼爱德华氏菌EIV有一定亲缘关系。结论我国华东、华南地区的鱼源迟缓爱德华氏菌分离株普遍具有相似的血清型和较高的进化同源性,并与人源的迟缓爱德华氏菌、人源的鲶鱼爱德华氏菌有明显差异。个别鱼源迟缓爱德华氏菌血清型与分子系统进化分析结果不一致,提示在防控鱼类爱德华氏菌病时,应将菌体表面抗原的免疫原性与分子聚类分析相结合。

黄唇鱼迟缓爱德华氏菌分离鉴定及药敏分析

2023年入夏以来,东莞市黄唇鱼(Bahaba taipingensis)自然保护区救护基地出现黄唇鱼发病和死亡病例,症状主要为食欲下降,体表发红、充血,眼球突出,角膜白浊溃烂,吻部溃烂;解剖后发现腹腔有大量腹水,肝肿大呈褐色。为确定其病因,针对性制定防治措施,采集死亡病鱼的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃丝等组织样品。从病死鱼体内分离到一株优势菌株,命名为DG230920,通过对菌株的形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列综合分析,鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。病理组织学检测结果显示,心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃均有明显的炎症反应,肠出血、黏膜上皮细胞脱落,脾淋巴细胞稀疏、内皮细胞变性坏死,肾小管变性坏死,鳃见鳃丝脱落、出血。对分离菌株进行药敏分析,结果为对环丙沙星、左氧氟沙星高度敏感,最低抑菌质量浓度仅≤0.25 mg·mL^(-1);其次是厄他培南,最低抑菌质量浓度≤0.5 mg·mL^(-1)。结果表明,黄唇鱼发病原因可能是迟缓爱德华氏菌感染,分离菌株遗传序列稳定,对临床使用的抗菌药物均为敏感。研究提示,应加强黄唇鱼迟缓爱德华氏菌感染的防治,选用敏感药物科学治疗。

拮抗鲶爱德华氏菌的高地芽孢杆菌Yab4的鉴定及其应用前景

为筛选拮抗鲶爱德华氏菌的肠道益生菌,从鲶形目鱼类的肠道中分离耐热菌株,通过体外抑菌实验及宿主黏附实验,筛选出一株既对鲶爱德华氏菌具有良好抑菌活性,又能高效定植鲶爱德华氏菌易感宿主的菌株Yab4。通过16S rDNA与gyrB构建系统发育树,Yab4菌株被鉴定为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。该菌在pH 4.0—7.0及30—40℃耐受性较强,同时对大部分水产常用抗生素敏感。将高地芽孢杆菌Yab4以喷雾的形式喷洒至饲料表面(5×10^(9) CFU/kg),经饲喂实验检测其对黄颡鱼的生长性能及免疫指标的影响。结果显示,饲喂高地芽孢杆菌Yab428d的黄颡鱼生长性能高于对照组;其血清中碱性磷酸酶、溶菌酶及总蛋白等先天免疫指标在28d时均显著上升,IL-1β、TNF-α和NF-κB p65等免疫相关基因表达水平呈显著性增高。通过腹腔注射鲶爱德华氏菌HSN-1的方式感染饲喂高地芽孢杆菌Yab428d的黄颡鱼,发现高地芽孢杆菌Yab4饲喂组存活率达到60%,较对照组提高了35%。研究筛选得到的拮抗鲶爱德华氏菌的高地芽孢杆菌Yab4具有良好的抗菌和益生效果,并且有望作为一种饲料添加剂应用于鲶形目鱼类的替抗健康养殖。

黄颡鱼源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及其药物敏感性研究

为确定重庆市荣昌区某养殖场黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)疾病爆发的原因,从患病黄颡鱼肝脏中分离到一株优势菌,命名为ET230818。通过形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA、gyrB、rpoB、cpn60基因序列分析确定ET230818为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。通过人工感染试验计算出菌株ET230818对黄颡鱼[平均体质量(17.5±2.5)g、平均体长(15.0±1.2)cm]的半数致死量(LD50)为2.51×10^(6)CFU·mL^(-1)。毒力基因检测结果显示,该菌株携带sodB、katB、esrB、gadB、fimA、citC和mukF毒力基因。组织病理学观察发现,患病黄颡鱼肝细胞排列杂乱、肿胀,脾组织中含血铁黄素聚集,肾小管收缩变窄且结构松散、萎缩;肠道黏膜细胞排列杂乱、坏死脱落,肠绒毛崩解,鳃小片明显变性弯折。抗菌药物敏感性试验与中草药抑菌试验发现,菌株ET230818对多西环素、恩诺沙星等11种抗菌药物高度敏感,丁香、五倍子等中草药对其具有较强的抑菌效果,研究可为黄颡鱼源迟缓爱德华氏菌的诊断和药物防治提供参考依据。

迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法的建立及初步应用

为构建一种灵敏、特异、准确的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)检测方法,以gyr B为靶基因设计特异性引物和探针,经过优化反应体系和退火温度,建立了迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法。随后对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估,并应用该方法进行临床样品检测。结果显示:当引物和探针浓度分别为250和200 nmol/L,退火温度为55℃时,建立的迟缓爱德华氏菌荧光PCR方法荧光曲线标准,线性关系良好,最低检测限可达12.4 CFU/m L,且1 CFU/m L的细菌经35℃培养1 h后即可被检出;与猪链球菌2型以及无乳链球菌等14种常见水生动物病原体无交叉反应;重复性试验变异系数均小于0.95%;在100份临床样品中,检出阳性22份,与细菌分离鉴定结果一致。结果表明,本研究建立的迟缓爱德华氏菌荧光PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,为迟缓爱德华氏菌病的临床诊断和研究提供了技术支撑。

鳗鲡爱德华氏菌对美洲鳗鲡的致病性与宿主抗感染相关基因的表达

采用1.0×10^(7)~2.0×10^(8)cfu/mL的鳗鲡爱德华氏菌感染美洲鳗鲡以确定其半数致死量(LD_(50)),然后采用略低于LD_(50)的菌浓度(3.3×10^(6)cfu/尾)感染鳗鲡,并于感染后12、24、36、48、60、72 h等6个时间点检测鳗鲡肝脏、肾脏和血液的载菌量,同时观察感染后36、60 h鳗鲡肝脏、肾脏和脾脏的病理变化。此外,采用qRT-PCR方法探究感染前和感染后12、36、60 h等4个时间点细菌外膜蛋白A(OmpA)和宿主抗鳗鲡爱德华氏菌感染的16个免疫相关基因表达。结果表明:感染鳗鲡爱德华氏菌后,美洲鳗鲡的LD_(50)为2.5×10^(5)cfu/g(5.0×10^(6)cfu/尾);美洲鳗鲡肾脏的载菌量于感染后36、48、60 h均显著高于在肝脏和血液中的载菌量,且感染后36 h菌浓度在肾脏和血液中均达到峰值,而在肝脏中的峰值则为感染后72 h。感染后36 h鳗鲡肝脏血管充血,肾小球萎缩且肾小管上皮细胞脱落,脾脏血管内形成血栓;感染后60 h肝血管出现血栓且部分肝细胞坏死,肾小管上皮细胞空泡变性并脱落入肾小管管腔,脾脏出现大量因细菌感染而导致的坏死性结节。与感染前相比,感染后12 h细菌OmpA基因在肝脏的表达量显著(P<0.05)升高;感染后OmpA基因在脾脏的表达量先下降后急剧上升,在肾脏的表达量则先上升后下降再上升。鳗鲡抗爱德华氏菌感染的5个免疫球蛋白相关的基因,在肝脏和肾脏不同时间点的表达量均无明显差异,而感染后早期在脾脏的表达量显著高于晚期;感染后3个肿瘤坏死因子相关基因在早期的表达量相对较高;此外,感染后12 h多个免疫相关基因表达量显著上升。

杀鱼爱德华氏菌ETAE_1309基因的启动子研究

为研究杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)ETAE_1309蛋白的表达调控机制,本实验利用序列截短方式和定点突变技术鉴定了ETAE_1309基因的启动子,并检测了不同培养条件下启动子的活性。结果显示:ETAE_1309上游-139~-1 bp具有启动子活性,ETAE_1309的核心启动子为-10元件TATACT和-35元件CTGGCG,该启动子属于σ38依赖型启动子。ETAE_1309转录水平受到RpoS_(Ep)(σ^(38))强烈的正调控,与毒力相关的调控蛋白EsrB、EsrC和与生理过程相关的Fur、CpxR、ETAE_2077对ETAE_1309转录水平影响不大。当杀鱼爱德华氏菌在DMEM培养基中生长时,随着培养时间延长ETAE_1309启动子活性逐渐增加,24 h(稳定期)和36 h(衰亡期)启动子活性分别为12 h(对数期)的2.4倍和2.9倍。当培养温度升高至35℃时ETAE_1309启动子活性显著下降,约为25℃时启动子活性的44.0%。本研究确证了杀鱼爱德华氏菌ETAE_1309的启动子序列及调控蛋白,随着培养时间延长该启动子活性逐渐增加,随着培养温度升高该启动子活性显著降低,研究结果为精准控制ETAE_1309蛋白表达及其介导的细菌毒力奠定了基础。

杀鱼爱德华氏菌新型毒力因子研究进展

杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida,又称迟缓爱德华氏菌),可感染多种重要水产养殖动物,对全球水产养殖业造成巨大经济损失。杀鱼爱德华氏菌具有很强的环境适应性与抗逆性,通过典型的胞内寄生引发严重感染,为研究水产致病菌毒力机制的模型菌株。除T3SS/T6SS系统等典型毒力因子外,近年来又在杀鱼爱德华氏菌中鉴定出众多新型毒力因子。本文主要综述了杀鱼爱德华氏菌一些新型毒力因子(如逃逸宿主免疫杀伤因子、毒素-抗毒素、硫氧还蛋白和蛋白酶类等)以及新型毒力调控因子的研究进展,可为研究该菌致病性提供参考。

淋巴浆细胞淋巴瘤华氏巨球蛋白血症的研究进展

淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenström macroglobulinemia,LPL/WM)是一种以血液中出现大量单克隆丙种球蛋白(IgM)为特征的、少见的惰性成熟B细胞淋巴瘤。其诊断标准包括血清中检测到单克隆性IgM,骨髓中浆细胞样或浆细胞分化的小淋巴细胞呈小梁间隙侵犯,特征性的免疫表型,除外其他已知类型的淋巴瘤以及90%以上的MYD88 L265P突变。其发病机制与家族易感性、丙型肝炎、自身免疫病、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)以及MYD88基因突变相关。实验室检查主要涵盖骨髓细胞学、血清学、组织学、免疫表型和基因突变。LPL/WM需要与IgM-MGUS、冒烟型WM(SWM)及其他淋巴增殖性疾病(LPD)进行鉴别诊断。LPL/WM治疗的优选方案包括BR[苯达莫司汀+利妥昔单抗(R)]、BDR(硼替佐米+地塞米松+R)、伊布替尼单药或伊布替尼+R(1类推荐)、RCD(R+环磷酰胺+地塞米松)、泽布替尼单药(1类推荐)等。

鱼类迟缓爱德华氏菌肠溶口服疫苗的制备及免疫保护效应研究

本文采用海藻酸钠作为载体,采用乳化复沉淀方法包裹迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)全菌制备疫苗微球。制备工艺研究结果表明:3%(m/v)海藻酸钠溶液,4%(m/v)CaCl_(2)溶液,水油相比1∶2,乳化剂Span801%,搅拌速度1200 r/min为最佳制备工艺,微球包埋率达91.04%,微球平均粒径(16.51±11.87)μm。通过人工胃肠液对疫苗微球的耐受性进行分析,微球在体外人工模拟胃液和肠液中16h释放率分别为0.8%和98.1%。用表达有绿色荧光蛋白的大肠杆菌做示踪标记,口灌免疫半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther),疫苗能耐受胃的酸性环境影响,通过前消化道到达后肠。免疫保护效应研究表明,口腔灌注疫苗后,出现特异性和非特异性免疫应答,疫苗组在初免后第14天血清效价达到峰值1∶322;外周血白细胞吞噬率在初免后第14天达到峰值27.06%,吞噬指数在初免后第14天达到峰值1.65。初免后第28天用迟缓爱德华氏菌活菌攻毒,对照组死亡率58.82%,疫苗组死亡率13.33%,免疫保护率为77.33%。本研究优化了鱼类肠溶口服疫苗的制备工艺,疫苗免疫评价结果表明,该口服疫苗可以有效激活鱼体免疫反应,预防鱼类疾病发生。

朱鹮源迟钝爱德华氏菌的分离鉴定

2022年9月中旬,陕西省洋县一处朱鹮养殖基地内接连发现多只朱鹮、白鹭死亡。为了确定病因,通过对死亡朱鹮病理剖检、细菌分离培养鉴定、PCR检测、动物致病性试验和分离菌药敏试验,确定引起朱鹮死亡的病源为迟缓爱德华氏菌且致病性较强,分离菌对羧苄西林、头孢他啶、头孢唑林、头孢呋辛、诺氟沙星、环丙沙星、新霉素高度敏感。这次朱鹮死亡病例的研究,为朱鹮人工种群疾病防控工作提供了指导。

加州鲈源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及药敏试验

加州鲈,学名大口黑鲈,隶属鲈形目、太阳鱼科、黑鲈属,其肉质紧实,味道鲜美,无肌间刺,营养价值高,同时该鱼攻击性强、贪食易上钩,深受消费者和休闲垂钓者的喜爱,是我国广泛养殖的经济鱼类之一。根据2023年渔业统计年鉴显示,2022年我国加州鲈产量已突破80万吨,形成了较大规模的产业链,但病害的发生成为了制约加州鲈养殖业发展的重要因素。

华氏巨球蛋白血症患者不同样本类型中MYD88 L265P突变检出率差异比较

目的探讨华氏巨球蛋白血症(WM)患者不同样本类型的MYD88基因L265P突变检出率差异及意义。方法回顾性分析2018年4月至2022年3月送检该机构的WM患者行MYD88 L265P突变的数字PCR检测数据,结合患者同时间送检的不同样本类型中的数据进行分析。结果共收集得到符合要求的170例WM患者的208株有效样本。整体MYD88 L265P阳性率为43.53%。骨髓样本MYD88 L265P突变阳性率显著高于外周血(53.85%vs.36.54%,P=0.037)和血浆cfDNA(53.85%vs.23.08%,36.54%vs.23.08%,P<0.005),且骨髓类型样本的比例高于外周血(25.00%)和血浆cfDNA(6.25%)。结论样本类型差异在一定程度上影响WM患者的MYD88 L265P突变检测结果判读,骨髓中的MYD88 L265P检出率与疾病发生率之间强相关。WM患者治疗期间可考虑结合送检外周血监测突变以辅助分析疾病状态,需进一步扩大样本量加以证实。

牛蛙爱德华氏菌病病原菌的鉴定和致病因素的研究

从患爱德华氏菌病的牛蛙肌肉、肝、肾、血液和腹水中分离到8株细菌，根据其形态和生理生化特性鉴定为野生型迟钝爱德华氏菌。人工感染实验均为该病的病原菌，毒素检测试验表明，致病因素主要是内毒素而不是外毒素。分离菌株的主要特性为杆状、革兰氏阴性、周生鞭毛、兼性厌氧。接触酶、甲基红试验和硝酸盐还原均为阳性。在三糖铁琼脂上产H2S。氧化酶、丙二酸盐利用、V．P试验、明胶液化、尿素酶。苯丙氨酸脱氨酶为阴性。分解葡萄糖、甘露糖、麦芽糖，产酸产气，不利用甘露醇、蔗糖和阿拉伯糖。

华氏巨球蛋白血症伴慢性肾功能衰竭患者1例报告

华氏巨球蛋白血症(WM)是一种与免疫球蛋白M(IgM)相关的淋巴浆细胞性淋巴瘤,由于国内外报道较少见,临床治疗中易被忽视,并逐渐发展为终末期肾病,影响患者预后。近年来针对WM的治疗方案增多,本研究回顾1例WM并发慢性肾功能衰竭患者的诊疗经过,并复习国内外相关文献分析该疾病的诊治进展。

弥漫大B细胞淋巴瘤合并淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症伴IgM及IgG共存的临床研究

目的 探讨弥漫大B细胞淋巴瘤合并淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(LPL/WM)伴免疫球蛋白M(IgM)及免疫球蛋白G(IgG)共存的发病机制、诊断标准、治疗方案及预后。方法 分析1例弥漫大B细胞淋巴瘤合并LPL/WM伴IgM及IgG共存患者的临床资料,以“弥漫大B细胞淋巴瘤”“免疫球蛋白”“单克隆”“IgM”“IgG”“淋巴浆细胞淋巴瘤”“华氏巨球蛋白血症”“diffuse large B-cell lymphoma”“immune globulin”“monoclonal”“lymphoplasmacytic lymphoma”“Waldenstr9m macroglobulinemia”为检索词,对中国知网数据库、万方知识服务平台及PubMed数据库中2017年1月至2023年6月发表的文献进行检索。结果 该例患者明确诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤合并LPL/WM伴IgM及IgG共存,确诊后经环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松(CHOP)方案、环磷酰胺+长春新碱+泼尼松(COP)方案治疗有效,但治疗期间病情进展,从发病到死亡存活10个月。依照上述检索条件并经过阅读文献题目与摘要筛选出7篇文献。阅读全文共筛出11例双克隆免疫球蛋白共存LPL/WM患者,其中IgM伴IgG双克隆6例,IgM伴免疫球蛋白A(IgA)双克隆2例,IgG伴IgA双克隆2例及IgMκ伴IgMλ双克隆1例。文献中提到的治疗方案主要包括硼替佐米+利妥昔单抗方案、COP方案、CHOP方案等,上述方案联合化疗均有效,但该病的发病机制尚不明确,尚无标准的治疗方案及确切的生存期。结论 弥漫大B细胞淋巴瘤合并LPL/WM伴IgM及IgG共存系首次报告,因该病发病率极低,发病机制尚不明确,因此目前尚无统一的治疗方案,预后尚不明确,临床需进一步提高对该病的认识,未来对于其发病机制及新型分子靶向药物的应用进行深入研究,将会大大改善患者的预后。

pH值、温度及培养基对爱德华氏菌生长的影响

为探究爱德华氏菌在自然环境下暴发的水质理化参数,设定不同的培养基[胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基、溶菌肉汤(LB)培养基]、pH值(5.5,7.0,8.5)及温度(25℃,28℃,32℃),对爱德华氏菌进行培养。结果表明,TSB培养基比LB培养基更适合爱德华氏菌生长;爱德华氏菌在pH值8.5的生长速度高于pH值7.0和pH值5.5,该菌适合在碱性条件下生长;在25℃时,爱德华氏菌生长速度最快,28℃次之,32℃生长速度最慢。指出,爱德华氏菌适合在低盐度、高无机盐、偏碱性、低温环境中生长。提出,在现实养殖过程中,可以通过提高水体盐度、降低pH值和适当调高水温且不影响水产动物正常生长的措施,以降低水产经济动物感染爱德华氏菌发病率,从而达到绿色健康养殖的目的。

广西斑点叉尾鮰爱德华氏菌的分离鉴定

在广西2处网箱和2处池塘发病斑点叉尾鮰中分离到4株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、培养特征、生理生化特性鉴定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌,通过PCR检测、PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对,进一步确定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌;致病性试验结果显示,这4株分离菌株具有较强的致病性,能引起斑点叉尾鮰发生爱德华氏菌病;药敏试验结果显示,4株分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、氟哌酸等高度敏感。

二温式聚合酶链反应鉴别诊断迟缓爱德华氏菌病

根据迟缓爱德华氏菌株23SrDNA基因,设计合成一对引物XZE15、XZE16,建立了二温式聚合酶链反应(PCR)鉴别诊断迟缓爱德华氏菌株的技术。特异性试验表明,对3株迟钝爱德华氏菌株进行PCR扩增出与预期大小相一致的284bp的特异性片段,但对3株钻鱼爱德华氏菌及其他对照鱼病病原体核酸模板的PCR扩增不出现任何条带;敏感性试验结果显示,该二温式PCR可以检测到10pg的迟钝爱德华氏菌DNA。