用于多通道单分子定位的高精度图像配准方法

单分子定位技术可以绕过光学系统的衍射限制,在生物样品的单粒子追踪和超分辨显微成像中得到了广泛应用.多通道单分子定位采用多个成像通道,可以实现对不同目标的同时追踪或多色超分辨成像,也可以提升单粒子追踪的轴向深度或实现更高的定位精度和密度.但各通道图像间的差异会影响协同定位或定量分析,因此图像配准是其图像数据预处理的关键环节;且由于单分子定位精度高,其对多通道图像配准精度的要求也很高.现有技术一般采用基于控制点的配准方法,且多采用复杂而精密的方式来获取基准物网格图像用于定位得到控制点对,以实现高精度图像配准,对样品或实验设备要求高,难以直接推广.为此,本文基于局部非线性变换和误匹配点剔除,发展了一种可以直接采用随机分布荧光珠样品作为基准物的高精度图像配准方法,通过在特征匹配和变换模型参数估计的过程中对控制点进行监测和迭代筛选,以剔除因单分子定位不准确或精度差而导致未精确匹配的控制点对,从而消除以随机分布荧光珠样品作为基准物时对于控制点准确获取和精确匹配所带来的不良影响,同时采用基于局部加权平均的二阶多项式拟合进行变换模型参数估计,以更好地适用于不同通道间存在局部非线性形变的情形.结果表明,采用该方法只需要3次迭代,就可以将未准确定位和精确匹配的控制点对找到并剔除,从而实现更准确的变换模型参数估计,将配准精度提高一个数量级,在图像局部非线性形变情况严重的正交像散双通道单分子定位成像系统中实现了约6 nm的配准精度.

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.

纳米级光学超分辨成像技术研究及展望

荧光显微成像技术能够将细胞生理活动可视化,是现代生命科学研究的重要手段。超分辨成像技术的出现将研究推进到亚细胞结构层次,而具有纳米级分辨率的单分子定位成像技术成为了研究细胞器、大分子复合物空间分布及相互作用的有力工具。继2014年超分辨成像技术获得诺贝尔化学奖后,《自然》(Nature)发布的2024年值得关注的七大技术中再次将纳米级分辨率光学成像技术作为热点进行介绍,超高分辨率成像技术是重要的前沿研究领域。本文首先简要介绍了荧光显微成像技术的发展历史、荧光显微镜的基础概念、超分辨成像技术的基本概况,之后着重介绍了单分子超分辨成像技术的研究进展,并在最后对该技术的发展及应用做了展望。

光控荧光蛋白及其衍生的超分辨成像技术

通过在时间或空间上精确控制荧光蛋白(FP)或染料分子的激活和失活,人们发展了一系列的超分辨率(SR)成像技术,并在细胞生物学领域取得了突破性的发现。此外,对于不同SR成像技术而言,FP的某种或者某些光化学特性对于其成像的时间和空间分辨率至关重要。早期我们的研究重点是通过改进光转换荧光蛋白(FP)的亮度、融合特性和光转换效率来提高单分子定位超分辨PALM成像的时空分辨率。还通过发展可抵抗锇酸固定和Epon包埋的光转换FP(包括mEosEM和mEosEM-E),我们发明了称为PALM-CLEM的创新光电关联(CLEM)技术,并实现了同层透射电镜切片SR CLEM成像。我们还发展了具有卓越开关对比度和亮度性质的光开关荧光蛋白,提高了SOFI、NL-SIM和RESOLFT成像技术的时空分辨率。此外,我们还致力于通过利用光调制FP的光闪烁和光转换来提高宽视场SR成像的时间分辨率。通过SIMBA、quick SIMBA、SOGO-SOFI等技术的发展,我们成功实现了仅用20帧原始宽场图片重建一张具有完整结构细节的SR图像。最近,我们实现了活细胞中单帧宽场超分辨成像,空间分辨率可达到65 nm。

单分子定位超分辨显微成像有机荧光探针的研究进展

在生物医学领域,对纳米尺寸级别的微小生物目标进行精确定位研究具有非常重要的意义,而光学显微成像技术为此提供了强有力的工具。光学显微成像技术受到光学衍射极限的限制,难以分辨尺寸在衍射极限(<200 nm)以下的生物结构,无法直接获取微小生物结构信息,阻碍了生物医学的进一步发展。近年来,随着纳米分辨显微成像技术的出现,新型荧光探针的开发、成像系统与设备的不断发展及成像算法不断完善地深入结合,促进了光学衍射极限以下尺寸微观目标的研究。基于单分子定位的超分辨荧光显微成像(SMLM)包括光激活定位成像(PALM)与随机光学重构超分辨成像(STORM),将有机荧光探针与超分辨光学显微成像技术紧密结合在一起,荧光探针的光物理性质直接决定着超分辨成像结果的好坏。因此,设计不同性能的荧光探针可以实现超精细结构的不同超分辨成像,为研究其生物学功能提供了有力的工具。本文着重围绕基于SMLM的原理、有机荧光探针的设计要求、用于SMLM的荧光探针种类及其生物应用等方面进行总结综述,指出了单分子定位成像上存在的不足,并对其发展方向进行了展望,希望为对超分辨成像研究感兴趣或初涉该领域的研究者提供成像理论与探针设计方面的帮助。

超分辨显微成像中荧光单分子定位算法的研究进展

超分辨显微成像技术的发展,可为生物医学的研究提供前所未有的机会。基于单分子定位的超分辨显微成像技术由于其相对简单的硬件结构,在生物医学领域的应用较为广泛。单分子定位的超分辨成像巧妙利用荧光发光的特点,针对少量离散的随机发光的荧光分子进行成像,再通过拟合分析实现单分子的高精度空间定位。在这一过程中,荧光单分子的定位算法及图像处理速度显得尤其关键。对单分子定位成像算法的基本原理进行阐述,包括模型和估计器的选择以及重建结果的评估等内容。同时针对拟合方法和功能的不同,对10余种算法进行分类和比较,并选取具有代表性的算法展开讨论和分析,希望对未来开展相关研究提供一定的参考。

单分子定位超分辨成像技术进展及应用

21世纪初诞生的超分辨光学成像技术凭借纳米级空间分辨率、低损制样等优点,迅速发展成为生命科学研究中不可或缺的技术手段。其中单分子定位超分辨成像(SMLM)技术更是由于其成像原理易懂、空间分辨率极高等特点,一直受到科研工作者的青睐,不断取得重要的技术和应用进展。首先回顾了SMLM的工作原理,讨论了其光路搭建、图像重建、漂移校正等关键技术问题。介绍了两类代表性SMLM技术。列举了多种多色SMLM方法,并分析了各自的优缺点。介绍了SMLM成像参数的改进研究,包括横/纵分辨率的提高、成像视野和深度的改善。介绍了SMLM和深度学习,SMLM和电镜等成像手段结合的关联成像研究进展。讨论了SMLM数据提取与分析方法。最后列举了SMLM在细胞生物学中的重要应用,并展望了SMLM未来的发展方向。期望该综述能为SMLM工作者提供有益的启发和参考,推进SMLM在生命科学研究中的深入应用。

超分辨成像中基于模板函数对多个荧光分子定位

在生物结构和功能成像领域里,超分辨成像成为近年来研究的热点,而荧光分子定位,特别是多荧光分子的定位,是超分辨成像的一个重要环节。本文基于模板函数和非线性拟合给出多个荧光分子定位算法,并利用该算法分析信噪比和两个荧光分子距离对荧光分子定位精度的影响,指出了只有信噪比大于5,两个荧光分子的距离大于8个像素时,才能获得精确的荧光分子的定位。结果证明该方法的合理性和有效性。

傅里叶单像素显微超分辨成像系统设计

单像素成像因其仅需一个无空间分辨能力的单点探测器即可实现目标物体的空间信息获取重建物体图像,是解决非可见光波段成像的关键技术。该技术的发展和应用在高分辨率空间存在数据采集量大,成像慢的问题。因此,设计了一种傅里叶单像素显微超分辨成像系统来提高现有单像素显微成像的效率和质量。首先,搭建了单像素显微超分辨成像系统,引入基于深度学习的超分辨模型来提升其成像分辨率,从而快速获得高分辨率的物体重建图像。经实验结果证明,相同的光强信号采集时间下,成像分辨率可提高近9倍,且其峰值信噪比达到28 dB,有效提高了单像素显微成像在高分辨率情况下的成像效率。

液体环境单分子免疫球蛋白G的原子力显微镜高分辨成像

原子力显微镜技术(AFM)具有纳米级高分辨成像能力,是研究生物大分子结构和功能的重要工具之一。制备合适的样品是获取高分辨成像的关键要素。本研究结合DNA折纸技术,将抗原分子修饰在DNA折纸上,通过分子识别作用,抗体分子与抗原分子特异性结合,形成由DNA折纸和抗原抗体复合物构成的纳米结构。利用DNA折纸在云母表面上的吸附特点,使得抗体分子选择性地吸附在衬底表面上,由此获得了液体环境中的单个地高辛抗体免疫球蛋白G(Ig G)分子的"Y"超微结构形貌。本方法简单、方便,为AFM在单分子水平上检测和表征生物分子结构和功能提供帮助。

基于深度学习的单像素相机超分辨率成像优化

基于压缩感知和单像素成像的基本原理,设计了一种用于图像超分辨率重建的新型深度卷积神经网络架构。这种单像素超分辨率成像算法成功地将深度学习图像超分辨率重建技术与压缩感知单像素成像技术相结合,从而发展出一种全新的深度学习单像素成像优化方法。与传统的常规压缩感知图像重构算法相比,该算法有效提升了图像超分辨率重建精度和单像素成像质量。通过图像重建的仿真实验和单像素相机的成像实验验证,结果表明这种基于深度学习的新型单像素相机成像方式具有良好的性能表现。

基于DNA折纸的单个链霉亲和素分子的原子力显微术高分辨成像

链霉亲和素(Streptavidin,STV)和生物素(Biotin)之间的非共价相互作用很强,已被运用到包括分子生物学、免疫学以及生物技术领域。STV与Biotin间优异的结合能力与其结构密切相关,晶体解析结果证明STV是一个四聚体蛋白。原子力显微镜技术(Atomic Force Microscopy,AFM)可以在液体环境下获得生物单分子的形貌信息,对结构和功能的研究具有非常重要的作用。然而,由于STV分子小而柔软,获得高分辨的AFM图像极其困难。本研究利用DNA折纸可寻址的特点,将Biotin定位修饰在折纸上,选择性地将STV固定在折纸设定的位置上,实现了对单个STV分子的高分辨成像,观察到了单个STV呈"沙漏形"结构,与其晶体结构符合性较好。同时,我们注意到STV形貌易受成像力的影响,可能与STV分子的柔性相关。这种基于DNA折纸的高分辨成像方法,简单、方便,为研究生物分子形貌和功能提供了新思路。

核孔复合物单分子定位超分辨图像的筛选和重构

核孔复合物(NPC)是细胞核膜上由多种蛋白组装而成的复杂结构,在细胞核质交换和信息传递中起着关键作用。单分子定位超分辨成像(SMLM)以其特异性和高成像分辨率成为研究NPC超微结构的主要方法之一。然而,由于抗体标记不完全等因素导致的数据丢失,给后续分析带来了困难。笔者使用SMLM提供的定位信息,结合基于密度的空间聚类算法(DBSCAN)和层次聚类算法进行数据的提取和分类,建立了NPC筛选和定位的分析流程,并采用该处理流程得到了缺失较少且形貌比较均匀的核孔。进一步,基于最小二乘法原理对筛选得到的大量NPC进行质心对齐的重构处理,成功复现出了其经典的八重对称结构,并揭示了核孔蛋白Nup133与Nup98的精确相对位置关系。本研究通过建立核孔筛选和重构的标准流程,填补了SMLM数据的缺失。采用该流程对多种核孔蛋白进行分析,揭示它们的结构特性。所建流程为理解核孔的复杂结构提供了一种高通量的定量分析方法。

挑战化学成像极限:世界最高分辨率的单分子拉曼成像

【本刊讯】近日，中国科学技术大学微尺度物质科学国家实验室董振超研究小组在国际上首次实现亚纳米分辨的单分子光学拉曼成像，将具有化学识别能力的空间成像分辨率提高到前所未有的0．5纳米。Nature于2013年6月6日在线发表了这项成果。

关键生物信号枢纽的细胞原位单分子定位超高分辨率解析

细胞内存在大量性质各异的大分子复合物,它们是控制生命活动的核心信号枢纽。荧光显微成像因其分子特异性、细胞原位可视化和多色标记解析等优势,已成为当今生物学研究不可或缺的技术手段。而突破光学衍射极限的超分辨光学成像技术为进一步理解多种重要生物百纳米信号体的原位结构和功能调节提供了亚细胞尺度甚至单分子精度的研究思路和方案。首先阐述了超分辨成像和单分子定位显微镜的基本原理,介绍了近年来在多项生命科学研究中的代表性应用案例,结合实际研究经验总结了超分辨光学成像技术在使用中面临的诸多挑战和未来发展方向,提出了基于原位纳米成像解析信号枢纽组织结构将有力促进新型疾病治疗靶点和策略的开发。

单分子三维取向超分辨成像技术进展(特邀)

超分辨显微成像技术自诞生以来,凭借其优异的纳米级空间分辨率,已成为生命科学研究中精准揭示复杂生命现象的重要成像技术。其中,基于单分子定位的超分辨成像策略,使得定位、观察、研究单个探针分子独特的理、化、光学性能成为可能。偏振作为荧光信号的一个重要特性,近年来伴随着单分子三维取向成像技术的发展,逐步在单分子成像和超分辨领域中展示出诸多新颖且重要的应用特性。本文总结了单分子三维取向超分辨成像技术的最新进展,介绍并分析了两类主要的单分子三维取向荧光显微技术——基于荧光吸收与辐射偏振调制的单分子三维取向成像方法以及利用点扩散函数工程将单个荧光分子的三维取向信息编码到荧光图像上的成像策略。此外,还探讨了应用于活细胞或单颗粒的其他类型的超分辨取向成像技术。最后,针对单分子三维取向超分辨成像技术发展与应用前景面临的挑战,进行了总结与展望。

我国科学家实现单离子超分辨成像

中国科学技术大学郭光灿院士团队在冷原子超分辨成像研究中取得重要进展。该团队李传锋、黄运锋、崔金明等人在离子阱系统中实现了单个离子的超分辨成像,该成果于2021年12月23日发表在国际知名期刊《物理评论快报》上。冷原子系统包括离子阱中囚禁的离子和光场中囚禁的原子等,是研究量子物理的理想实验平台,也是进行量子模拟、量子计算和量子精密测量实验研究的重要物理系统。

我国首次实现亚纳米分辨的单分子光学拉曼成像

中国科学技术大学科学家日前在国际上首次实现亚纳米分辨的单分子光学拉曼成像。将具有化学识别能力的空间成像分辨率提高到前所未有的0．5纳米。国际权威学术期刊《自然》杂志6月6日在线发表这项成果。研究由侯建国院士领衔的单分子科学团队董振超研究小组完成，博士生张瑞、张尧为论文共同第一作者。三位审稿人盛赞这项工作“打破了所有的纪录，是该领域创建以来的最大进展”、“是该领域迄今质量最高的顶级工作，开辟了该领域的一片新天地”、“是一项设计精妙的实验观测与理论模拟相结合的意义重大的工作”。世界著名纳米光子学专家还在同期杂志的《新闻与观点》栏目撰文评述了这项研究。

中国科大实现世界最高分辨率单分子拉曼成像

中国科学技术大学的科学家们在国际上首次实现亚纳米分辨的单分子光学拉曼成像．将具有化学识别能力的空间成像分辨率提高到前所未有的0．5纳米。国际权威学术期刊《自然》杂志于6月6日在线发表了这项成果。世界著名纳米光子学专家Atkin教授和RaSChke教授在同期杂志的《新闻与观点》栏目以《光学光谱探测挺进分子内部》为题撰文评述了这一研究成果。《自然》三位审稿人盛赞这项工作“打破了所有的纪录．是该领域创建以来的最大进展”，”是该领域迄今质量最高的顶级工作．开辟了该领域的一片新天地”．”是一项设计精妙的实验观测与理论模拟相结合的意义重大的工作”。

正交像散高密度三维单分子定位显微的数值模拟

单分子定位显微(single molecule localization microscopy, SMLM)成像技术利用荧光分子的稀疏发光、探测及定位,实现了纳米级空间分辨率的超分辨成像.为了提高其时间分辨率,需要提高同时发光的荧光分子密度.但随着分子密度的提高,不同分子的点扩散函数(point spread function, PSF)在探测器上将发生严重的重叠现象,导致空间分辨率降低,尤其是在进行三维SMLM成像时.为了解决这一问题,本文提出了一种基于正交像散的高密度三维单分子定位超分辨成像方法,并对该方法进行分析和数值模拟研究.该方法的核心是在单分子定位显微镜中将采集的荧光分成两束成像在同一个探测器的两个区域,并在两个通道中各引入一个光学参数相同但取向相互正交的柱透镜,实现对同一个荧光分子正负两个像散PSF图像的同时探测,然后建立该成像过程的线性投影模型,利用压缩感知算法求解出荧光分子的三维定位信息.结果表明,由于两个正交柱透镜产生的一组正交像散PSF对作为一个分子的系统响应时具有较低的相关性,该方法的高密度三维定位准确性可显著优于采用单个柱透镜的传统像散方法,且离焦程度越大两个像散PSF的形状差异越大,这种准确定位的优势就越明显.