单细胞巢式PCR检测RHD的初步研究

目的建立单细胞巢式PCR检测技术,用以检测单个细胞的RHD。方法采用稀释法获得单个细胞,直接提取DNA,根据RHD特点设计两对特异性引物进行巢式PCR,凝胶电泳观察结果,将扩增产物测序以检测扩增的目的基因。结果通过巢式PCR,阳性对照可以获得明显的目的产物,阴性和空白对照无扩增产物,10份Rh阳性单细胞检测标本均能检出RHD。结论建立的检测RHD单细胞巢式PCR检测技术具有很好的特异性和敏感性,可应用于生殖医学等领域,为预防Rh新生儿溶血病提供新的技术途径。

单细胞巢式PCR诊断软骨发育不全

目的 探讨单细胞水平诊断软骨发育不全 ( achondroplasia,ACH)的可靠性 ,为开展 ACH的胚胎植入前遗传学诊断 ( preimplantation genetic diagnosis,PGD)打下基础。方法 采用巢式 PCR扩增单淋巴细胞及单卵裂球的成纤维细胞生长因子受体 3基因的高发突变位点 G380 R区域 ,用限制酶 Bfm 消化 PCR产物 ,10 %聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果 单淋巴细胞的 PCR扩增成功率为 90 .4 % ,等位基因脱扣发生率为 8.2 % ,诊断准确率为 91.8% ;单卵裂球的扩增成功率为 75 .4 %。结论 单细胞巢式 PCR诊断 ACH是比较稳定。

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义。

杜氏肌营养不良症(DMD)的植入前遗传学诊断

目的对杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD)进行植入前遗传学诊断(preim-plantation genetic diagnosis,PGD),阻断DMD患儿的出生。方法针对患者的DMD基因的48号外显子缺失位点采用巢式PCR分别对患者和携带者的单个淋巴细胞、行体外授精-胚胎移植治疗的健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞进行扩增,建立稳定的经单细胞基因诊断DMD的方法。再对在该中心进行超排和体外授精-胚胎移植治疗的DMD携带者的胚胎活检后完成PGD,根据诊断结果选择健康的优质的胚胎移植入子宫。结果携带者的单个淋巴细胞的PCR扩增成功率为90.5%(95/105),健康志愿捐献者的单个卵裂球细胞PCR扩增成功率为85.7%(54/63),假阳性率为0(0/28)。分别对3例DMD携带者施行了植入前遗传学诊断,病例1移植了2枚未受累的优质胚胎,且成功妊娠单胎并已于2005年4月分娩了1个健康的女婴;病例2移植了2枚优良胚胎,不幸的是未能妊娠。病例3诊断为未受累的仅有的2枚胚胎因胚胎质量差而未能移植。结论该组采用的方案可对DMD基因的48号外显子缺失突变的DMD家庭进行PGD,达到了阻断DMD患儿出生的目的。

基于单个B细胞抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的研制

为了建立基于单个B细胞制备抗体技术,本研究以O型灭活FMDV为抗原,采集健康C57/BL小鼠脾细胞,经过磁珠富集、流式B220+/CD38+/Ig G1+/抗原+分选,获得单个抗原特异性的B细胞。经单细胞巢式PCR反应扩增获得抗体完整轻、重链可变区序列后,分别构建轻/重链表达质粒,然后共转染HEK-293细胞后,成功获得3株特异性单克隆抗体,且证明均属于Ig G1型抗体;ELISA结果显示,获得的3株抗体均能与O型FMDV抗原结合;免疫荧光试验证明,3株抗体能够特异性结合细胞内复制的O型FMDV。本研究成功建立了基于单个B细胞直接制备抗FMDV单抗的方法,为后期开发特异性单克隆抗体打下了坚实的基础。