基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度测定方法研究

近年来,稳定同位素标记化合物,尤其是同位素标记氨基酸在合成生物学、蛋白质组学、代谢组学等前沿科学研究中发挥着越来越重要的作用。建立了一种基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度检测方法,以^(13)C_(2),^(15)N-甘氨酸为例,考察了样品浓度、质谱扫描张数等影响因素对同位素丰度计算结果的影响,结果表明该方法具有良好的准确性和稳定性,所需样品用量少,操作简单,有望成为一种简便、通用的同位素试剂质控方法;也将为代谢组学、海洋学等同位素示踪技术应用研究提供数据支持。

^(14)C,^(59)Fe双标记样品的测量

本试验通过^(14)C和^(59)F双标记固相模拟样品,依据两种核素的衰变特性和不同仪器对它们的探测灵敏度,确立两种简便的测量双标记示踪样品的方法。结果表明,该方法测量的数据与给出参考值在4％以内符合。

大鼠颌下腺GnRH及其受体的免疫组织化学双标记和年龄变化

用免疫组织化学法，以邻片双标记技术研究了大鼠颌下腺内ＧｎＲＨ及ＧｎＲＨ受体的分布；并对不同发育阶段大鼠颌下腺内ＧｎＲＨ及其受体进行了原位定量分析。结果表明，雄性成年大鼠颌下腺浆液性腺泡的腺上皮细胞及各级导管上皮细胞既呈ＧｎＲＨ又呈ＧｎＲＨ受体免疫反应性。６０ｄ龄内，大鼠颌下腺的ＧｎＲＨ及其受体的含量随年龄的增长而增多，６０ｄ龄～９０ｄ龄，其含量相对恒定。以上结果提示，ＧｎＲＨ可能以自分泌的方式参与了颌下腺的发育成熟过程及分泌功能的调节。

胃蛋白酶原双标记时间分辨荧光免疫分析及其初步临床应用

采用钐(Sm3+)标记抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体(PGⅠ)及铕(Eu3+)标记抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体(PGⅡ),建立了双标记时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),同时检测人血清PGⅠ和PGⅡ.将抗PGⅠ单克隆抗体8003#、抗PGⅡ单克隆抗体8101#以一定比例共包被于96孔微孔板上,用Sm3+标记抗PGⅠ单抗8016#、Eu3+标记抗PGⅡ单抗8102#,采用双抗体夹心法建立PGⅠ/PGⅡ的双标记TRFIA.标准曲线由TRFIA检测仪自带的Log-LogB函数处理.PGⅠ可测范围为0.2～300μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为5.2%和8.1%,平均回收率为96.9%;PGⅡ可测范围为0.05～55μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为7.1%和11.7%,平均回收率为103.7%;双标记PGⅠ/PGⅡ-TRFIA与PGⅠ-ELISA法、PGⅡ-ELISA法的测定结果高度相关,具有较好的一致性,相关系数分别为0.9426和0.9396.检测300例健康人员的PGⅠ为(157.3±51.0)μg/L,PGⅡ为(10.6±5.9)μg/L,PGⅠ/PGⅡ比值为(14.8±4.3)μg/L.PGⅠ的正常参考值范围在55.3～259.3μg/L之间,PGⅡ正常参考值为<23μg/L,PGⅠ/PGⅡ>6.双标记PGⅠ/PGⅡ-TRFIA方法的研究在国内外尚未见报道,是一种灵敏、简便、快速、经济并可用于大批量样品筛查的方法,有利于各种胃病的大规模普查筛选及患者病程监测.

C肽与胰岛素双标记时间分辨荧光免疫分析法的建立及初步临床应用

建立钐(Sm3+)标记检测C肽(C-peptide)及铕(Eu3+)标记检测胰岛素(insulin)的双标记时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),并初步尝试检测人血C肽以及胰岛素含量.将抗C肽单克隆抗体(Biodesign No.E54094M)与抗insulin单克隆抗体(BiodesignNo.E86306M)混合包被96孔板,然后用Sm3+标记抗C肽单克隆抗体(Medix No.9103),Eu3+标记抗insulin单克隆抗体(Biodesign No.E86802M),运用双抗体夹心一步法建立C肽/胰岛素双标记时间分辨免疫荧光分析法.结果显示:C肽分析灵敏度为0.2μg/L,线性范围为0.5～22μg/L,平均回收率达到99.6%,分析内和分析间变异系数分别为4.6%～6.0%和5.1%～7.6%.胰岛素分析灵敏度为0.8 mU/L,线性范围为3.6～180 mU/L,平均回收率为99.4%,分析内和分析间变异系数分别为3.7%～6.0%和5.1%～8.0%.C肽/胰岛素双标记检测试剂与PerkinElmer公司对应的单标记进口试剂盒分别同时测定血清样本200份,检测结果高度相关,具有较好的一致性,相关系数分别为0.98与0.99.总之,自建C肽/胰岛素双标记时间分辨荧光免疫分析方法的性能均可以达到临床检测要求,有望替代现有国内外较为昂贵的单标记试剂,可用于胰岛素分泌不足导致的糖尿病诊断及糖尿病的大规模普查筛选.

妊娠期奶山羊下丘脑GnRH和OT免疫反应双标记细胞的分布

为了探讨促性腺激素释放激素(GnRH)和催产素(OT)是否在下丘脑细胞中共存,采用免疫组织化学双标记法对妊娠期奶山羊下丘脑中GnRH与OT的分布进行了检测。结果显示:室旁核、视上核、视前交叉上核、弓状核、下丘脑外侧区、乳头体内侧核、乳头体后核等核团(区)有GnRH和OT免疫反应双标记细胞,在妊娠的不同时期,GnRH和OT免疫反应双标记细胞数量有显著差异。这些结果为GnRH与OT相互调节提供了形态学证据。

免疫荧光双标记技术检测胎盘HBsAg-抗-HBs复合物

目的 探讨乙肝病毒 (HBV)以何种形式感染胎盘滋养层细胞 .方法 通过免疫荧光双标记技术检测 12例血清HBs Ag阳性母亲的胎盘滋养层细胞 HBs Ag-抗 - HBs复合物 .结果 血清学 HBs Ag阳性母亲胎盘滋养层细胞中存在 HB-s Ag-抗 - HBs复合物 .结论 提示 HBV可能通过 HBs Ag与抗 - HBs结合成复合物的方式进入胞内 ,导致胎盘屏障的第一层细胞受到

免疫组化双酶双标记和组织化学复合染色方法的探讨

免疫组化双酶双标记和组织化学复合染色方法的探讨赵秀兰，孙保存，林建韶，王欣，李薇，谭郁彬随着免疫组化技术的发展，已有可能在同一张切片上标记出不同的细胞成分，若与组织化学染色相结合，则可显示更多的细胞成分，为同时观察几种细胞的分布特点、相互关系提供了新...

呋喃丹降解菌CDS-1的双标记菌株的构建

用Sau3AI消化呋喃丹降解菌Sphingomonassp.CDS-1的基因组DNA,将所得DNA片段与BamHⅠ酶切的启动子探针载体pRobe-GFP酶连后转化E.coliDH5α感受态细胞,在选择性平板上培养,从大约1×104个菌落中筛选到50个含启动子片段的阳性克隆。挑选其中一个发光强度最强的阳性克隆F7,将它的重组质粒pF7用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后得到包含Sphingomonassp.CDS-1启动子和gfp基因的DNA片段,将该片段克隆到广宿主载体pPZP201上,得到pPZP201-gfp质粒。将pPZP201-gfp通过三亲接合转移至Sphingomonassp.CDS-1中得到GFP标记菌株CDS-gfp,经荧光显微镜观察,gfp基因在CDS-gfp中表达量很高。对标记菌株进行连续传代10次(48h/次),发现pPZP201-gfp依然存在,而且发光明显。通过NotⅠ酶切位点把linA基因连接到pUT/mini-Tn5上构建新的转座子载体pUT/mini-Tn5-linA。以pRK600为辅助质粒将pUT/mini-Tn5-linA引入到CDS-1中,linA基因通过转座作用,插入到CDS-gfp的染色体中,得到双标记菌株CDS-GFP-LinA。该菌株是一株能同时降解γ-六六六和呋喃丹的基因工程菌,本研究的结果为研究Sphingomonassp.CDS-1的生态学行为奠定了基础。

双标记流式细胞术定量分析5-FU诱导胃癌细胞早期凋亡

目的 以AnnexinV FITC/PI双标记流式细胞术检测 5 FU诱导胃癌细胞株SCG790 1早期凋亡。方法 2 50、1 2 5、50以及2 5mg/L不同浓度 5 FU处理SCG790 1胃癌细胞 0、6、1 2、1 8、2 4、30h ,AnnexinV FITC/PI双标记流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡。结果 早期 (0～ 2 4h)瘤细胞凋亡比例随 5 -FU作用剂量增加和时间延长而显著提高 (P <0 0 1 ) ;后期 (2 4～30h)瘤细胞以坏死增加为主(P <0 0 1 )而凋亡比例反而降低。结论 5 FU诱导细胞凋亡呈时间以及剂量依赖关系。AnnexinV/PI双标记法可以清楚区分正常、坏死、机械损伤以及凋亡细胞群落 。

原位杂交和免疫组化双标记技术在大鼠全脑脑片培养中的应用

目的探讨联合应用原位杂交(in situ hybridization,ISH)和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)技术检测全脑脑片特定核酸和蛋白的表达。方法在静态全脑脑片培养的基础上,将培养的脑片进行冰冻切片,然后联合应用原位杂交和免疫组化技术检测特定基因的表达情况。结果脑片冰冻切片的质量可以进行后续的实验;与单纯应用一种方法相比,联合应用两种技术可同时在核酸水平和蛋白水平检测待测基因,两种显色方法不相互冲突,且可以更直观地显示核酸和蛋白的表达模式。结论原位杂交和免疫组化双染技术明显优于单纯的原位杂交技术或免疫组化;该双染技术可用于脑片培养中的基因和蛋白检测。

尿清蛋白、β_2微球蛋白的双标记TrFIA法的建立

目的建立同时可测尿清蛋白(Alb)和β2微球蛋白(β2-MG)的双标记时间分辨荧光免疫分析法(β2-MG/AlbTr FIA)。方法用羊抗兔IgG包被96孔板,加入限量的特异性兔抗人Alb抗体和兔抗人β2-MG抗体使之结合到板上,使Eu3+标记的β2-MG和Sm3+标记的Alb与标准品(标本)中的β2-MG、Alb竞争结合在板上的限量相应抗体,以Log-Logit制作标准曲线,并对方法学进行评价。结果该法检测尿液Alb和β2-MG的灵敏度分别为0.2mg/L和0.05mg/L。检测范围Alb为2～50mg/L,β2-MG为0.1～8mg/L。检测Alb平均批内、批间CV%分别为4.6%、7.8%;检测β2-MG的平均批内、批间CV%分别为3.3%、5.5%。Alb和β2-MG的平均添加回收率分别为95.4%和102.4%。该法结果与单独检测Alb和β2-MG的放射免疫方法所测结果配对t检验均P>0.05。结论该方法可同时定量检测尿Alb和β2-MG,简便、快速,结果准确,适于临床应用。

双标记水法测量54例4和6月龄婴儿体成分

为了解 4和 6个月婴儿的体成分组成情况 ,使用双标记水稀释法测量 5 4名健康婴儿总体水(TBW)、瘦体重 (LBM)和脂肪含量。结果表明 ,4个月婴儿的TBW、LBM和脂肪的重量分别为 (4 2 7± 0 4 7)、(5 11± 0 6 6 )和 (2 13± 0 5 7)kg。 6个月婴儿的TBW、LBM和脂肪的重量分别为 (4 5 9± 0 5 8)、(5 77± 0 73) ,和 (2 0 1± 0 6 6 )kg。而且 4和 6个月婴儿体成分中各组成成分占体重的百分含量没有性别差异。但是在两个月龄婴儿组中分别按照不同喂养方式分组进行分析时 。

免疫组化与原位杂交双标记技术在鼻咽癌诊断中的应用

目的探讨如何应用免疫组化和原位杂交双重标记技术,对辅助鼻咽癌的组织学诊断最有帮助。方法采用免疫组化和原位杂交双重标记技术检测30例鼻咽未分化型非角化性癌组织,并在同一切片上检测细胞角蛋白(CK)和EB病毒(EBER),同时观察两种指标在鼻咽癌细胞中的表达情况。结果 CK定位于鼻咽癌细胞胞浆内,呈棕黄色;EBER阳性反应定位于鼻咽癌细胞的细胞核上,呈蓝黑色。30例鼻咽未分化型非角化性癌癌组织均呈CK和EBER阳性,可看到鼻咽癌细胞同时表达CK和EBER,CK的棕黄色和EBER的蓝黑色对比清晰容易观察。增生的鼻咽上皮细胞CK阳性,而EBER呈阴性。结论 CK免疫组化与EBER原位杂交双标记技术有助于鼻咽癌的组织学诊断,可常规作为鼻咽癌病理诊断常用的辅助技术。双标技术以先做EBER原位杂交,后做CK免疫组化,显色剂分别用BCIP/NBT和DAB为好。

乳腺疾病的SMA/CK免疫组化双标记法

目的 探讨平滑肌肌动蛋白 /角蛋白免疫组化双标记法在乳腺疾病诊断以及鉴别诊断中的应用。方法 对乳腺正常组织、良性病变、原位癌、乳腺癌早期浸润以及浸润性癌共 2 0例进行标记。结果 乳腺正常组织、良性病变和叶状囊肉瘤中腺上皮细胞呈鲜红色 ,肌上皮细胞连续性围绕并形成棕色花冠样 ;原位癌癌巢周围肌上皮细胞数目减少 ,呈细绳样连续或不连续围绕 ;乳腺癌早期浸润中早期浸润灶及浸润性癌癌巢周围肌上皮细胞大部分消失或无肌上皮细胞围绕。结论 从乳腺正常组织、良性病变到原位癌、早期浸润和浸润性癌 ,肌上皮细胞的消失是一逐渐发展的过程 。

运用图像处理软件将同视野两种单标记免疫荧光图像合成为双标记图像的方法研究

探讨以计算机图像处理技术将普通荧光显微镜采集的同视野单标记免疫荧光图像合成为双标记图像的方法。应用AdobePhotoshop7.0和ImageJ两个图像处理软件,将普通荧光显微镜采集的同视野单标记荧光图像叠加处理成双标记荧光图像,并同激光扫描共聚焦显微镜获得的同一双标记免疫荧光图像进行比较。普通荧光显微镜采集的单标记荧光图像在分辨率及清晰度上逊于激光扫描共聚焦显微镜采集的单标记图像,但显示的脊髓室管膜细胞形态更为完整,细胞突起较长且更连续。因此,在没有激光扫描共聚焦显微镜时,可用AdobePhotoshop7.0或ImageJ图像处理软件将普通荧光显微镜采集的同视野两种单标记免疫荧光图像合成为保持原有特点、简便而清晰的双标记荧光图像。

免疫组织化学双标记结合激光显微切割技术在霍奇金淋巴瘤诊断中的应用

目的探讨IHC双标记技术结合LCM技术在研究HL肿瘤细胞与背景细胞中的应用。方法选取10例HL标本,10%中性福尔马林固定,石蜡包埋组织,采用不同的抗原修复方法,通过IHC双标记与LCM技术获得单一的肿瘤细胞和背景细胞。结果在10例HL标本中通过IHC双标记与LCM技术获得单一的肿瘤细胞和背景细胞,二者表现出不同的颜色以及表达不同的CD分子。结论通过IHC双标记与LCM技术获得单一的肿瘤细胞和背景细胞,IHC双标记在HL研究中起着区分不同细胞的作用。

流式细胞术Ki67/DNA双标记法在实体肿瘤中的应用

目的探讨流式细胞术双标记法检测恶性实体肿瘤细胞ＤＮＡ含量、细胞周期和Ｋｉ６７表达和组织学分级之间的关系。方法利用流式细胞术Ｋｉ６７／ＤＮＡ双标记法同时检测８７例新鲜恶性实体肿瘤的ＤＮＡ含量、细胞周期和增殖核抗原Ｋｉ６７的表达。结果异倍体发生率为４０．２％，其中高分化肿瘤为１１．ｌ％，中分化肿瘤为３７．５％，低分化肿瘤为 ４６． ３％。 Ｋｉ６７阳性细胞为 ０． ５％～８７％（１７． ３６％士１６． ６％）。 Ｓ期细胞百分比为 ０～２４％（５ ２８％±４． ８５％）。高分化肿瘤 Ｓ期细胞百分比及增殖核抗原 Ｋｉ６７的表达明显低于中分化和低分化肿瘤，统计学上有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。中分化和低分化肿瘤之间则差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。异倍体肿瘤Ｓ期细胞百分比高于二倍体肿瘤，差异有显著性（Ｐ＜０．０１），而Ｋｉ６７的表达在两者之间无显著性差异。结论流式细胞术Ｋｉ６７／ＤＮＡ双标记法可同时检测实体恶性肿瘤细胞的ＤＮＡ含量、细胞周期和增殖核抗原Ｋｉ６７的表达，并能进一步阐明这些参数与组织学分级的关系。方法简便、快速，有利于对肿瘤生物学特性的了解。

用双标记水示踪法测定人体自由活动时的能量消耗率

本文报道用１８Ｏ和２Ｈ双标记水测定人自由活动时能量消耗率的示踪方法及正常成人的初步测定结果。根据质谱测量精度将ＨＯ和２Ｈ２Ｏ测量定为１．０ｇ／ｋｇ（丰度１４．４５％）和０．０６ｇ／ｋｇ（丰度９９．９％），一次口服后在１４ｄ内间歇性收集尿样５次，然后从１８Ｏ和２Ｈ时相曲线斜率的差别，并加入同位素分馏校正因子，算出整体ＣＯ２产生率，再根据食物组成估计呼吸商，求出能量消耗率。测得１０例正常实验室工作人员的结果是：男性和女性平均为２０８．８±１４．２和１９２．０±２３，ｋＪ·ｋｇ－１·ｄ－１。３例住院康复人员平均为１５４．０ｋＪ·ｋｇ－１·ｄ－１。

抗AFP抗体双标记法及其产物特性测定

采用氯胺丁改良法和过碘酸钠氧化法，进行抗ＡＦＰ多抗或单抗直接双标记１３１Ⅰ和ＭＭＣ，过Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ５０柱并以ｒ计数仪与紫外分光光度仪同步监测分离、收集标记物。经测定多抗和单抗双标记物，标记比分别为７０．３ＭＢｑ∶ｍｇ∶２．２μｇ和５９．２ＭＢｑ∶ｍｇ∶１．８μｇ；放化纯度９８％和９７％；１３１Ⅰ利用率８３％和８８％；抗体回收率６２％和７４％；标记后与标记前相比抗体活性均无明显降低。置４℃５ｄ和１０ｄ时，抗体活性不受影响；放化纯度分别降为９５％和９２％、９１％和８８％。经裸鼠人肝癌模型放免显像，７２ｈ即见肿瘤区有放射性浓集，至１２０ｈ肿瘤显像最清晰。结果表明，多抗和单抗的双标记物的生物、理化性质稳定。为免疫导向治疗肝癌提供了一种新型的“双弹头”导向药物。