一种有效的黑曲霉启动子捕获探针的构建及其应用

启动子对基因的表达起着关键的作用,为获得黑曲霉强启动子,该文以柠檬酸生产菌株黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 10142为出发菌株,运用启动子捕获探针和基因重组技术筛选菌株高强度启动子,并确定其核心启动区域。结果显示:以红色荧光蛋白基因(Rfp)为报告基因,潮霉素抗性基因(HygR)为筛选标记,构建黑曲霉启动子捕获探针质粒pN3,借助T-DNA随机整合到黑曲霉基因组,筛选具有高潮霉素抗性和强红色荧光表型的突变株,进而通过交错热不对称链式聚合酶反应(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,Tail-PCR)获得整合位点上游核苷酸序列,测序确定该序列为糖苷水解酶基因启动子区(Pgh),通过分析其具有多个转录因子结合元件。对Pgh启动子进行5'端缺失分析,获得6个不同长度5'端缺失的启动子序列,并与强启动子PglaA对比,根据报告基因Rfp表达情况确定启动子Pgh的-1 066~-766 bp为其核心区域。

牡丹花青素苷合成关键基因PsDFR启动子活性分析

[目的]分析牡丹花青素苷合成关键基因PsDFR启动子的顺式作用元件及活性,为进一步研究PsDFR启动子的功能及其在牡丹花色形成中的调控机制奠定基础。[方法]以‘黑花魁’牡丹花瓣中提取的基因组DNA为模板,通过染色体步移法克隆PsDFR的启动子序列。利用生物信息在线软件预测分析启动子序列的顺式作用元件。构建5个不同长度缺失启动子与GUS基因融合的表达载体,并瞬时转化烟草叶片,通过GUS组织化学染色和酶活性检测分析缺失启动子的活性,及其对脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、光照等不同胁迫处理的响应。[结果]克隆得到PsDFR上游1687 bp的启动子序列。生物信息学分析发现PsDFR启动子含有多个光信号、激素响应、逆境响应及组织特异表达等顺式作用元件,这暗示PsDFR的表达可能受光信号、激素和胁迫等多种信号的共同调节。GUS组织化学染色和酶活性检测表明,随启动子片段的缩短,启动子活性逐渐下降,-1623至-916区段对于启动子活性具有重要作用。MeJA和黑暗处理对各启动子片段活性均有显著抑制作用,恢复光照可促使启动子活性明显回升,而参与ABA响应的核心调控区域位于-443至-76 bp。[结论]PsDFR启动子含有多个光信号、激素响应、逆境响应及组织特异表达等顺式作用元件,其活性受光的正调控以及MeJA的负调控;-1623至-916 bp间的区域对于启动子活性具有重要作用,-443至-76 bp是响应ABA处理的核心区域。该研究为进一步揭示PsDFR应答环境信号参与牡丹花色形成的分子调控机制提供参考。

绵羊清道夫受体A基因启动子克隆及序列分析

为了分析绵羊清道夫受体A(scavenger receptor A,SRA)基因的启动子序列特征,试验根据UCSC数据库和NCBI数据库预测的绵羊SRA基因启动子序列设计特异性引物,以绵羊肺组织基因组DNA为模板进行SRA基因启动子序列PCR扩增、测序,然后对序列进行生物信息学分析,包括预测启动子活性区域、转录因子结合位点、TATA box及CpG岛。结果表明:利用根据UCSC数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物未扩增出目的片段,利用NCBI数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物扩增得到了绵羊SRA基因启动子序列,大小约为1200 bp,与NCBI预测序列的相似性为99%,其中第577位碱基发生了突变(G→A);含有1个潜在活性区域(aaaaatgagctcacattcattttttttttcttaactggc);存在干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)1、IRF2、c-Jun、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)、活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)转录因子结合位点,其中IRF1和c-Jun的结合位点出现频率较高;不存在TATA box和CpG岛,只存在3个CpG位点。说明SRA基因的表达可能受IRF1和c-Jun等相关转录因子的调控,不受甲基化的影响。

花生干旱诱导型启动子Ah MYB44-11-Pro的克隆与功能分析

干旱是严重威胁我国花生产量与品质的主要环境因素之一。为阐明干旱胁迫响应基因AhMYB44-11的调控机制,揭示其启动子的功能,本研究从花生基因组中扩增获得该基因的启动子序列AhMYB44-11-Pro,分别构建全长及5'端部分缺失启动子的GUS融合表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化体系,分析启动子的活性和表达模式。结果显示,相比于同源基因AhMYB44-01的启动子,AhMYB44-11-Pro具有更多的MBS、Myb-bindingsit等响应干旱胁迫的顺式作用元件;同时其拟南芥转基因阳性植株经脱水处理后GUS染色加深,GUS酶活性显著增加;表明启动子的活性受干旱胁迫诱导表达,证实AhMYB44-11-Pro是一个干旱诱导型启动子。此外, AhMYB44-11-Pro含有种子胚乳特异表达元件和赤霉素响应元件, GUS染色显示在角果发育过程中其活性呈上调趋势,由此推测AhMYB44-11可能在种子发育尤其是干物质积累过程中发挥重要作用。本研究结果将为全面解析AhMYB44的生物学功能奠定基础,也为作物抗旱遗传改良提供参考依据。

甘薯U6启动子克隆及其转录活性分析

在CRISPR/Cas9基因编辑系统中,U6启动子可以通过驱动sgRNA的表达来编辑目的基因,因而其转录活性会影响基因编辑效率。尽管人们已经在拟南芥、玉米、大豆、棉花等植物中开展了U6启动子的克隆与应用研究,然而目前在甘薯中U6启动子的相关研究还未见报道。本研究利用拟南芥的AtU6 SnRNA的保守序列在三浅裂野牵牛(Ipomoea trifida)基因组数据库中搜索候选U6 RNA,然后在其上游搜索到2个不同的候选U6启动子,长度分别为526 bp(IbU6p-1)和532 bp(IbU6p-2);序列比对分析结果显示,甘薯的U6启动子具有上游序列元件(USE)以及TATA-box,其序列也与拟南芥高度相似。然后,利用获得的U6启动子核酸序列构建了能够驱动萤火虫荧光素酶基因(LUC)表达的重组框U6::LUC。最后,将含有上述重组载体的根癌农杆菌瞬时转化到本氏烟草叶片和甘薯愈伤组织中,并通过荧光成像技术分析荧光素酶活性。结果发现,在烟草及甘薯愈伤组织中2个甘薯U6启动子均能驱动LUC基因表达,具有转录活性。同时,IbU6p-2的转录活性无论是在烟草叶片中还是在甘薯愈伤组织中都显著高于拟南芥U6启动子。本研究结果为进一步发展甘薯基因编辑技术提供了参考。

线粒体解偶联蛋白2基因多态性及启动子区域基因型与糖尿病肾病发病的关系

目的观察线粒体解偶联蛋白2(UCP2)基因多态性,分析UCP2基因启动子区域基因型与糖尿病肾病(DKD)发病的关系。方法2型糖尿病(T2DM)患者180例,根据尿白蛋白/肌酐比值(ACR)和预估肾小球滤过率(eGFR)分为DKD患者92例[糖尿病肾病组,ACR≥30 mg/g、eGFR<60 mL/(min·1.73 m^(2))]和单纯糖尿病患者88例[单纯组,ACR<30 mg/g、eGFR≥60 mL/(min·1.73 m^(2))],采用多重聚合酶链反应进行UCP2基因测序,另利用二元Logistic回归分析UCP2基因启动子区域位点-866G/A三种基因型(A/A、G/A、G/G)与DKD的关系。结果糖尿病肾病组-866G/A位点G/G基因型频率为33.0%、G/A基因型频率为40.9%、A/A基因型频率为26.1%,单纯糖尿病组分别为30.4%、56.5%、13.0%,两组A/A基因型频率比较,P均<0.05;糖尿病肾病组Ala55Val位点C/C基因型频率为31.8%、C/T基因型频率为42.0%、T/T基因型频率为26.1%,单纯糖尿病组分别为28.3%、57.6%、14.1%,两组比较,P均>0.05;糖尿病肾病组45bp INS/DEL位点DEL/DEL基因型频率为73.9%、DEL/INS基因型频率为23.9%、INS/INS基因型频率为2.3%,单纯糖尿病组分别为84.8%、13.0%、2.2%,两组比较,P均>0.05。在-866G/A隐性模型中,A/A基因型是DKD发生的风险因素,相比于G/A和G/G,A/A基因型发生DKD的风险增高2.359倍[2.359(1.091~5.099),P=0.029];当矫正性别、年龄后,A/A基因型发生DKD的风险增高2.491倍[2.491(1.142~5.437),P=0.022];当进一步矫正性别、年龄、糖尿病病程、糖化血红蛋白、尿酸、总胆固醇后,A/A基因型发生DKD的风险增高2.491倍[2.489(1.004~6.172),P=0.049]。在-866G/A显性模型中,相比于G/G基因型,G/A和A/A基因型发生DKD的风险无统计学差异。结论UCP2基因启动子区域存在3个位点的基因多态性,包括-866G/A、Ala55Val以及45bp插入缺失突变,其中-866G/A与DKD的发生密切相关,A/A基因型患者发生DKD的风险高于G/A、G/G基因型。

ki-67核心启动子调控E1A表达的腺病毒的构建和鉴定

目的构建含有ki-67启动子的腺病毒Ad-pki-67-E1A-GFP,实现特异在ki-67阳性的脑胶质瘤细胞中复制。方法利用分子生物学的方法将ki-67启动子序列克隆到pGL3-basic载体中,双荧光素酶报告基因实验检测ki-67启动子活性;将ki-67启动子构建到穿梭质粒,并与辅助质粒共转染293T细胞,重组腺病毒Ad-pki-67-E1A-GFP;Ad-pki-67-E1A-GFP加入到脑胶质瘤细胞中,荧光显微镜观察GFP表达情况,同时实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测细胞中ki-67基因表达、腺病毒复制必需基因E1A表达和病毒拷贝数。结果克隆的ki-67序列在脑胶质瘤细胞中能够启动报告基因表达;酶切和测序证明ki-67启动子构建到穿梭质粒中,并重组得到腺病毒Ad-pki-67-E1A-GFP;Ad-pki-67-E1A-GFP能够感染脑胶质瘤细胞,并且E1A的表达和病毒拷贝数与细胞中ki-67表达呈正相关。结论ki-67启动子改造后的腺病毒在脑胶质瘤细胞中复制,为进一步改造用于基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础。

CD14基因启动子区-159C/T多态性在H型高血压患者中的分布

目的:调查H型高血压患者中CD14基因启动子区-159C/T基因多态性分布情况。方法:用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术对H型高血压组、普通高血压组和对照组的CD14基因启动子区-159C/T多态性分布进行研究,同时检测血清同型半胱氨酸(HCY)及其他生化指标。结果:H型高血压组CC型、CT型、TT型分布频率分别为10%、43%、47%,C和T等位基因频率分别为31.5%、68.5%;普通高血压组CC型、CT型、TT型分布频率分别为10%、50%、40%,C和T等位基因频率分别为35%、65%;对照组CC型、CT型、TT型分布频率分别为13%、53%、34%,C和T等位基因频率分别为39.5%、60.5%,三组基因分型和等位基因频率均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,H型高血压组、普通高血压组高密度脂蛋白(HDL-C)水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:H型高血压患者CD14基因启动子区-159C/T多态性分布无明显差异。

BDNF与5-HTT基因启动子区多态性的交互作用对精神分裂症暴力攻击行为的影响

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)与5-羟色胺转运体基因启动子区多态性(5-HTTLPR)的交互作用对精神分裂症暴力攻击行为(SCZ-AB)的影响。方法选取169例精神分裂症患者,根据是否有暴力攻击行为分为A组(有暴力攻击行为,n=87)与B组(无暴力攻击行为,n=82)。比较两组一般资料、BDNF与5-HTTLPR基因分型及等位基因频率分布、A组BDNF与5-HTTLPR基因型间Buss&Perry攻击量表和Barratt冲动量表评分,Logistic回归分析不同BDNF基因型和5-HTTLPR基因型对SCZ-AB的影响。运用MDR统计分析不同基因型间交互作用。结果A组与B组间Val和Met频率比较,差异有统计学意义(P<0.05),A组Val/Val频率低于B组(P<0.05),Val/Met和Met/Met基因型频率高于B组(P<0.05);Buss&Perry攻击量表和Barratt冲动量表比较发现:A组Met/Met基因型的各项分值均高于Val/Val、Val/Met基因型(P<0.05);控制性别因素,携带Met等位基因有暴力攻击行为的精神分裂患者的相对危险度是不携带Met等位基因患者的2倍(P<0.05)。Buss&Perry攻击量表和Barratt冲动量表比较发现:L/L基因型患者的各项分值均显著高于S/S基因型(P<0.05)。同时携带Met和L等位基因者的相对危险度是不携带Met和L等位基因者的2倍(P<0.05)。结论同时携带BDNF Met和5-HTTLPR L等位基因患者有暴力攻击行为的危险度较高,BDNF Met等位基因发挥主要作用,Met/Met基因型患者病情更严重。

基于Tail-PCR分析AN2基因上游启动子活性

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)富含花青素,AN2基因是调控黑果枸杞花青素合成代谢的主效基因。为解析AN2基因启动子的活性差异,采用Tail-PCR方法分别克隆了黑果枸杞和红果枸杞(L.barbarum)AN2基因起始密码子上游约1686 bp(LrAN2p)和1495 bp(LbAN2p)的序列。PlantCARE预测表明,LbAN2p和LrAN2p中分别有133和137个的顺式作用元件,其中,参与光调控的顺式元件分别有11和15个;参与激素响应相关的顺式元件分别有13和16个。构建AN2启动子植物表达载体pKGWFS7:LbAN2p和pKGWFS7:Lr AN2p,利用农杆菌介导的烟草遗传转化体系获得转基因烟草。GUS染色结果表明,LrAN2p能够驱动GUS在烟草中的表达,叶片呈现蓝色,具有较LbAN2p更强的启动活性,qRT-PCR结果表明,LrAN2p转基因烟草中GUS基因具有更高的转录水平,这可能会使AN2基因在黑果枸杞中具有更高的表达,激活黑果枸杞花青素合成代谢通路。这为解析枸杞果色形成及AN2基因的表达调控机制奠定了理论基础。

毛竹PheMADS47a基因启动子克隆及功能分析

MADS-box转录因子家族成员SVP作为开花调控网络的中枢调控因子,也可在植物芽发育中发挥作用并参与逆境及激素途径。为探究毛竹(Phyllostachys edulis)PheMADS47a基因启动子的功能,本研究克隆了PheMADS47a约2000 bp的启动子序列,构建了不同长度5′端缺失启动子(P1:1949 bp、P2:825 bp、P3:578 bp、P4:493 bp、P5:230 bp、P6:79 bp)的植物表达载体(含报告基因GUS),遗传转化至拟南芥(Arabidopsis thaliana),通过β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色分析其活性。结果显示,PheMADS47a基因启动子中存在脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)等激素应答元件及低温、干旱等非生物胁迫响应元件以及众多光响应元件。在10和15 d幼苗期,除P4启动子外,其他长度的启动子片段均有活性;在23和33 d苗期,P1~P3启动子活性强。全长启动子P1驱动的GUS基因在拟南芥的根、茎、叶、花序、角果基部均有表达,而在角果和侧枝中无表达。PheMADS47a基因启动子活性明显受MeJA、SA促进,不同长度的启动子活性对ABA、GA和IAA的应答不同。不同长度的启动子活性均可被黑暗、干旱、NaCl、4℃低温抑制。推测-578~-493 bp是该启动子活性的关键区域,该启动子是MeJA诱导型启动子。本研究为应用PheMADS47a基因启动子和探究该基因的调控机制提供了理论依据。

巨噬细胞特异性启动子SP146-C1增强血管内皮生长因子C在动脉粥样硬化小鼠中的表达

背景:携带巨噬细胞特异性启动子SP146-C1(Synthetic promoter 146-C1)及外源性基因血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGFC)的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)在动脉粥样硬化组织中的表达效率还不确定。目的:探究rAAV9-SP146-C1-VEGFC在动脉粥样硬化小鼠中的表达效率及对淋巴管生成的影响。方法:取30只ApoE^(-/-)小鼠给予高脂饮食喂养12周构建动脉粥样硬化模型,随机数字表法分为转染7,14,21,28,35 d组各5只,尾静脉注射5.0×10^(11) vg rAAV9-SP146-C1-VEGFC,对照组5只小鼠尾静脉注射等量对照病毒rAAV9-SP146-C1-Scramble。分别于转染后7,14,21,28,35 d时麻醉后处死,留取血清、股骨、胫骨、心脏及主动脉组织,对照组于7 d时同法取材。各组小鼠的股骨和胫骨用于提取骨髓原代巨噬细胞,RT-qPCR检测骨髓原代巨噬细胞及主动脉中VEGFC、血管内皮细胞生长因子受体3、平足蛋白、淋巴管内皮透明质酸受体1的基因表达;Western blot检测骨髓原代巨噬细胞及主动脉中VEGFC的蛋白表达水平,ELISA检测小鼠血清中VEGFC水平,免疫荧光检测主动脉窦中VEGFC的表达,主动脉周围及心肌中淋巴管内皮透明质酸受体1的表达。结果与结论:①与对照组比较,转染7 d组小鼠血清VEGFC水平增加,主动脉及骨髓巨噬细胞中VEGFC、血管内皮细胞生长因子受体3、平足蛋白、淋巴管内皮透明质酸受体1的mRNA表达增高,骨髓巨噬细胞中VEGFC蛋白表达增高,主动脉窦斑块的VEGFC荧光强度增高(P<0.05,P<0.01);②转染rAAV9-SP146-C1-VEGFC的各组小鼠血清VEGFC水平随时间延长逐渐增加,在28 d时开始减少;主动脉及骨髓巨噬细胞中VEGFC、血管内皮细胞生长因子受体3、平足蛋白、淋巴管内皮透明质酸受体1的mRNA水平、骨髓巨噬细胞中VEGFC蛋白水平、主动脉窦斑块的VEGFC荧光强度、主动脉窦周围及心肌的淋巴管内皮透明质酸受体1荧光强度随着时间延长逐渐增加,其中主动脉淋巴管内皮透明质酸受体1的mRNA水平、主动脉窦周围及心肌的淋巴管内皮透明质酸受体1荧光强度在28 d时表达量最高(P<0.05),其余均在21 d时表达最高,28 d后逐渐减少(P<0.05)。结果表明,rAAV9-SP146-C1-VEGFC可有效转染动脉粥样硬化模型小鼠骨髓巨噬细胞,并促进淋巴管增生。

工业大麻腺毛发育基因CsMIXTA启动子克隆及功能分析

CsMIXTA在调控大麻雌性花器官中腺毛的发生和发育中发挥重要作用。为了研究CsMIXTA基因的表达调控,对CsMIXTA基因上游2199 bp启动子序列进行了克隆。通过PlantCARE预测发现,该启动子序列具有多个胁迫响应元件与光响应元件。根据预测的响应元件分布情况,扩增获得5个5′端缺失的启动子片段。用克隆的启动子全长和缺失片段分别构建融合GUS基因的表达载体,并将其瞬时转化到烟草叶片和工业大麻糖叶中。通过GUS染色观察发现,CsMIXTA启动子的核心区域位于–393~–99 bp之间,包含赤霉素响应元件TATC-box和转录起始元件TATA-box。通过LUC荧光素酶表达发现,CsMIXTA启动子的核心区域具有转录活性。研究还发现,CsMIXTA基因在工业大麻糖叶的腺毛中特异性表达。对启动子进行胁迫响应分析的结果显示,低温、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)都能增强该启动子的活性。这些结果为CsMIXTA基因调控机制研究奠定了重要基础。

小黑杨Rubisco小亚基基因启动子的克隆及表达活性分析

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用中决定碳同化速率的关键酶,其中小亚基(rbcS)是由核基因编码,并且主要在叶片中表达。利用RT-qPCR技术确定了小黑杨(Populus×xiaohei)叶片中高表达的Rubisco小亚基基因PxrbcS1和PxrbcS2基因,并克隆了其上游2 240、2 174 bp的启动子。对其进行启动子元件分析结果表明,PxrbcS1和PxrbcS2的启动子具有多个与光诱导表达相关的元件,例如G-box、MRE和Box4等元件。构建pBI-121-p PxrbcS1::GUS和pBI-121-p PxrbcS2::GUS植物表达载体并遗传转化84K杨(P. alba×P. glandulosa)。GUS组织化学染色以及qPCR表达分析表明PxrbcS1和PxrbcS2的启动子能够驱动GUS基因在84K杨叶片特异性高表达。总之,上述结果表明该研究成功地从小黑杨中克隆了具有叶片高表达活性的PxrbcS1和PxrbcS2的启动子,该启动子可应用到包括杨树在内的植物光合作用相关的基因功能研究以及提高植物光合作用的遗传操作中。

基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件npsa-prabi.ibcp.fr/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。

硒都黑猪NT5C1A基因核心启动子区鉴定及转录因子预测

本研究旨在探究猪胞质5'核苷酸酶1A基因(Cytosolic 5'-Nucleotidase1A,NT5C1A)启动子区序列的结构特性,确定其核心启动子区并分析其关键转录因子结合位点,为探究其表达调控机制提供理论依据。对NT5C1A互作蛋白进行预测,在线生物信息学分析软件预测猪NT5C1A基因核心启动子区,根据预测结果设计7对启动子缺失片段引物,以硒都黑猪血液基因组DNA为模板,通过PCR扩增和Sanger测序方法获得NT5C1A基因5'端7个启动子缺失片段并克隆至pGL3-Basic载体,以双荧光素酶报告基因检测试验对缺失片段进行荧光素酶活性检测,并通过转录因子在线预测软件预测核心启动子区潜在的转录因子。结果表明,NT5C1A基因核心启动子位于转录起始位点-290~+109bp的位置(ATG作为+1),该区域含有MYOD1、MYOG、MYF5和SP1等肌肉发育相关的转录因子结合位点。本试验为研究NT5C1A基因调控猪肌肉发育的分子机制提供了理论依据。

miR-23a/27a/24基因簇g.65307469G>A突变对大白猪产仔数和启动子活性的影响

[目的]本文旨在研究大白猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点多态性与产仔数性状的关系及潜在机制,为母猪繁殖性状的分子育种提供新的潜在遗传标记。[方法]利用混池测序技术筛选猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点,直接测序法对大白猪群体(n=345)miR-23a/27a/24基因簇突变位点进行基因分型,计算遗传多样性;用线性模型对突变位点多态性与产仔数性状进行关联性分析;构建不同等位基因类型启动子载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过检测荧光素酶活性分析突变对启动子活性的影响;用生物信息学方法预测不同等位基因类型启动子潜在结合的差异转录因子,用荧光素酶活性分析差异转录因子对不同等位基因类型启动子活性的影响。[结果]在猪miR-23a/27a/24基因簇启动子-648 nt(Chr.2,65307469 nt)处发现1个新的G/A突变,命名为g.65307469G>A。在大白猪群体中发现3种基因型(GG、GA和AA),其中GG为优势基因型(89.57%),G等位基因为优势等位基因(94.64%)。关联性分析发现,GA基因型母猪的总产仔数(TNB)比GG基因型母猪每胎高0.56头(P<0.05)。荧光素酶活性分析结果显示G等位基因类型启动子活性显著高于A等位基因类型(P<0.05)。在不同等位基因类型启动子间发现1个潜在结合的差异转录因子死亡相关蛋白1(THAP1),成功构建猪THAP1基因过表达载体,共转试验结果显示转录因子THAP1对不同等位基因类型启动子活性均无显著影响(P>0.05)。[结论]miR-23a、miR-27a和miR-24是大白猪产仔数性状的候选基因,g.65307469G>A突变抑制miR-23a/27a/24基因簇的启动子活性,但与转录因子THAP1无关。

山羊NPC1基因核心启动子鉴定与转录调控分析

NPC1基因编码的C型尼曼匹克蛋白1(NPC1)参与脂筏形成、病原微生物内吞以及内吞体的胞内转运等过程。本试验旨在阐明海南黑山羊NPC1基因的转录调控机制,为研究病原微生物与宿主细胞互作提供理论参考。首先,以山羊NPC1基因1466 bp启动子序列为模板,构建9个启动子5'端连续缺失的双荧光素酶报告载体,筛选NPC1基因核心启动子区;继而对核心启动子区的关键转录因子进行预测分析,构建转录因子结合位点缺失的双荧光素酶报告载体,筛选NPC1基因的关键转录因子结合位点。结果表明:山羊NPC1基因的核心启动子区位于转录起始位点上游-195 bp至-60 bp,并且该区域存在E2F3(-134/-120 bp)、SREBP-1(-107/-96 bp)、SP1(-68/-62 bp)等多个转录因子结合位点。双荧光素酶报告实验结果表明,缺失E2F3、SREBP-1、SP1三个转录因子结合位点均会使山羊NPC1基因启动子的转录活性显著下降(P<0.01),且缺失SREBP-1结合位点后NPC1基因转录活性下降最显著。提示,SREBP-1转录因子对海南黑山羊NPC1基因转录活性具有重要的调控作用。本试验成功鉴定山羊NPC1基因的核心启动子区(-195/-60 bp)及该区域的关键转录因子结合位点SREBP-1,为进一步研究山羊NPC1基因介导病原微生物与宿主互作分子机制提供理论基础。

山葡萄基因VaEXO11及其启动子的克隆与序列分析

【目的】探究欧洲葡萄基因VvEXO11在山葡萄中的同源基因VaEXO11的表达及功能,为揭示葡萄抗寒分子通路、培育新的抗寒葡萄品种提供理论依据。【方法】克隆并分析VaEXO11及其启动子PVaEXO11序列,通过瞬时转化烟草探究PVaEXO11与低温胁迫的关系。【结果】从VaEXO11克隆到的cDNA序列全长为957 bp,其中ORF为957 bp,编码318个氨基酸。该基因仅由1个外显子构成,其蛋白含有一个高度保守的Phi_1结构域和一个信号肽,丝氨酸含量丰富,经预测为疏水脂溶性蛋白。对克隆到的P_(VaEXO11)进行顺式作用元件预测,分析结果表明,PVa EXO11不仅含有CAAT-box、TATA-box等核心启动子元件,还具备参与干旱胁迫、昼夜节律调控和创伤响应等功能响应元件。瞬时转化结果表明,低温激活P_(VaEXO11)的活性,VaEXO11的相对表达量迅速上升,直接或间接促进细胞内抗氧化酶的产生。【结论】VaEXO11除了参与低温调控,还可能参与多种逆境相关的调控,从而响应多种生物与非生物胁迫。

基于Nrf2/HO-1启动子筛选抗水生病毒药物的方法

为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法,实验以胖头鱥上皮细胞系(FHM)为材料,构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒,利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素对启动子活性的影响,并利用鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)和蛙虹彩病毒(rana grylio iridovirus,RGV)验证阳性药物的抗病毒效果。结果显示,Nrf2、HO-1启动子序列中存在FOX家族、IRF家族等多种转录因子的结合位点,并分别存在1个和3个与甲基化相关的CpG岛。双荧光素酶报告实验显示,水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素可激活Nrf2、HO-1启动子。药物浓度梯度实验显示,6.3μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯可显著上调Nrf2和HO-1的启动子活性。病毒感染后的细胞病变效应、病毒的复制及病毒滴度结果均表明姜黄素和穿心莲内酯可抑制SVCV和RGV的感染。综上,本实验建立的pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1启动子报告质粒,可用于抗水生病毒药物的筛选,也为Nrf2、HO-1转录调控机制的研究提供了工具。